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방법 논문

성게 Paracentrotus lividus의 산화환원 상태 및 대사 프로필에 대한 카드뮴의 영향 평가

763 조회수

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DOI:

10.3791/68300

⸱

2025년 7월 29일

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1Higher Institute of Biotechnology - Sidi Thabet, Laboratory of Biotechnology and Valorization of Bio-Geo-Resources, University Manouba, 2Faculty of Sciences of Tunis, Laboratory of Ecology, Biology and Physiology of Aquatic Organisms LR, University Tunis El Manar, 3Laboratory of Mass Spectrometry, National Institute of Research and Physical-Chemical Analysis (INRAP) Biotechpole Sidi Thabet, 4Department of Chemistry, College of Sciences at Bisha, University of Bisha, 5Department of Applied Medical Sciences, Applied College at Bisha, University of Bisha

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 성게 Paracentrotus lividus (극피동물)에서 생리 활성 화합물의 추출 및 특성화 방법과 카드뮴 노출 후 산화 스트레스 매개변수의 결정을 강조합니다.

초록

카드뮴(Cd)은 수생 생물에 가장 유해한 중금속 중 하나이며 해양 생물군에 널리 퍼져 있는 오염 물질입니다. 높은 생체 이용률, 지속성 및 생체 축적 능력으로 인해 광산 유출수, 산업 배출 및 농업 투입물에서 배출되는 독성 중금속인 카드뮴(Cd)은 수생 생물에 가장 해로운 오염 물질 중 하나이며 해양 생물군에서 흔히 발생하는 오염 물질입니다. 현재 연구는 96시간 동안 다양한 농도(0.0183, 0.183 및 1.83 mg/L)에 노출된 Paracentrotuslividus 생식선의 산화 스트레스 바이오마커 및 대사산물 프로필에 대한 카드뮴의 잠재적 독성 효과를 평가했습니다. 그 결과 Cd는 대조군에 비해 말론디알데히드, 과산화수소, 지질 과산화수소 수치를 증가시키고 항산화 활성(글루타티온 및 카탈라아제 감소)을 증가시켜 산화 스트레스를 유도하는 것으로 나타났습니다. 또한, 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 기반으로 처리된 성게와 대조군 모두의 생식선 추출물에서 74개의 대사산물이 확인되었습니다. 부분 최소 제곱 판별 분석은 명확한 클래스 분리를 밝혔고 VIP 점수를 통해 9개의 관련 대사 산물을 구별했습니다. 수행된 히트맵 분석은 스테롤 및 Cholest-5-en-3-ol(3.beta)과 같은 지방산 화합물 수준의 교란을 강조했습니다.-, 데스모스테롤, (23S)-에틸콜레스트-5-엔-3.베타.-올 및 에이코사펜타엔산(EPA), 레티노산과 같은 항산화 방어제, 프레그나-5-엔-20-온, 3-하이드록시-,(3β)와 같은 스테로이드 조절. 전반적으로 우리의 데이터는 상대적으로 낮은 농도에서도 Cd에 대한 생식선의 높은 민감도를 보여주었습니다.

서론

해양 환경은 중금속과 같은 여러 독성 화학 물질의 중요한 흡수원으로 간주될 수도 있습니다. 친유성으로 인해 이러한 원소는 부유 입자상 물질과 결합하고 해양 퇴적물에 점진적으로 축적되는 경향이 있어 이동성과 생체 이용률이 감소합니다. 결과적으로 해양 퇴적물은 주요 중금속 흡수원역할을 합니다 1. 이러한 오염 물질 중에서 카드뮴(Cd)은 생태계 및 관련 생물군을 위협하는 주요 글로벌 수질 오염 물질로 오랫동안 인식되어 왔습니다2. 수생 생태계에 존재하는 Cd의 1/3은 인산염 비료의 제조 및 사용에서 나옵니다2. 환경으로의 Cd 방출의 다른 원인으로는 광업 부문, 전기 도금 회사 및 지각의 자연 과정이 있습니다3. 이 오염 물질은 수성 매질을 통해 쉽게 운반할 수 있는 능력과 다른 중금속과 달리 상대적으로 이동성이 뛰어나기 때문에 매우 널리 퍼져 있습니다2. 문헌에 따르면 Cd의 농도는 발트해에서 12에서 16 x 10-3 μg/L 사이로 다양하며4, 갈리시아 해안(NW 이베리아 반도)을 따라 매우 오염된 지역에서는 13.4 x 10-3에서 1.49 μg/L 사이입니다.5. 지중해의 일부 오염 지역에서는 훨씬 더 높은 수준의 Cd가 기록되었으며, 시칠리아 섬(이탈리아) 근처에서는 농도가 80.4 x 10-3 μg/L에 도달할 수 있습니다.6, 가베스만(튀니지)에서는 48μg/L에 도달할 수 있습니다.7. 이 잔류적이고 생물 축적적이며 비필수 전이 금속은 인간과 수생 생물 모두에게 심각한 건강 문제를 일으킬 수 있는 능력으로 알려져 있습니다8. Cd는 단백질에 결합하고 효소 활성을 억제하며 칼슘 항상성을 방해함으로써 독성을 직접적으로 발휘할 수 있습니다9. 또한 활성 산소종(ROS)의 생성을 통해 간접적으로 작용하여 지질, 단백질 및 DNA와 같은 생체 분자에 산화적 손상을 일으킬 수 있습니다10. 여러 과학적 연구에서 Cd 오염이 수생 생물의 구조적 및 기능적 장애를 유발할 수 있다고 보고했습니다11.

다른 해양 저서 무척추 동물과 마찬가지로 성게는 특히 해양 오염에 노출되어 있습니다. 높은 수준의 중금속을 축적하는 능력에도 불구하고 성게는 금속 오염에 대처하고 오염된 환경에서 견딜 수 있습니다12. 따라서 그들은 일반적으로 감시 유기체로 인식되며 생태독성학 및 환경 연구의 모델로 널리 사용됩니다13. 수많은 연구에서 성체, 배아 및 유충을 포함하여 다양한 생애 단계의 성게 종에 대한 Cd 노출의 영향을 조사했습니다13. Cd 노출은 난자 수정률 감소, 배아 및 유충 발달 이상, 산화 스트레스, 세포사멸 및 자가포식에 이르기까지 다양한 부작용을 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다13. 이용 가능한 대부분의 문헌은 성게가 배아를 발달시키는 데 대한 Cd의 효과에 초점을 맞추고 있습니다 13,14; 그러나 성게의 대사 프로필에 대한 이 금속의 영향을 이해하기 위해 수행된 연구는 소수에 불과하며 지질 대사에 대한 정보는 없습니다.

Paracentrotus lividus(Lamarck, 1816) 배아를 아급성/아치사적 카드뮴 농도에 지속적으로 노출시키면 골격 신장 및 패턴화의 결함과 함께 비정상적인 발달이 발생하고 단백질 합성의 일반적인 감소 및 차등 메탈로티오네인 발현이 발생합니다16.

제안된 방법은 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)을 사용하여 생화학적 분석과 표적 및 비표적 대사체 프로파일링을 결합하여 해양 유기체의 카드뮴(Cd) 독성 및 산화 스트레스 평가를 개선합니다. 지질 과산화 또는 항산화 효소 활성(예: SOD, CAT)과 같은 단일 바이오마커에만 의존하는 전통적인 접근법과 비교할 때 GC-MS 기반 대사산물 스크리닝을 추가하면 유기체의 생리학적 상태에 대한 포괄적인 생화학적 지문을 얻을 수 있습니다17. 이러한 통합을 통해 낮은 Cd 농도에서도 치사적 영향을 보다 민감하고 체계적으로 감지할 수 있으며 관찰 가능한 독성학적 손상 전에 발생하는 에너지 대사, 아미노산 회전율 및 산화 경로의 초기 교란을 감지할 수 있습니다. 중요한 것은 이 방법이 더 높은 해상도 데이터를 제공하고 기존 분석에서 놓칠 수 있는 새로운 바이오마커를 식별할 수 있도록 함으로써 기존 독성학적 평가를 보완한다는 것입니다18. 또한 예측 생태독성학 모델을 향상시키는 경로 수준 분석을 통해 기계론적 이해를 촉진합니다19. 이 방법은 오염된 해안 및 하구 시스템과 관련된 1-100μg/L 범위의 카드뮴 노출을 감지합니다20. 이 접근 방식은 통제된 실험실 노출 또는 적당히 복잡한 현장 연구에 가장 적합합니다. 그러나 여러 스트레스 요인(예: 중금속, PAH, 신흥 오염 물질)이 상호 작용하여 잠재적으로 바이오마커 특이성을 혼란스럽게 하는 고도로 오염된 매트릭스에서는 해석이 어려울 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 적절하게 설계되면 다변량 데이터 분석(예: PCA, PLS-DA)과 결합된 GC-MS의 견고성과 특이성은 중첩 효과를 해결하는 강력한 차별력을 제공합니다.

이 통합 생화학-대사체 플랫폼은 해양 전략 프레임워크 지침(MSFD)과 같은 프레임워크에 따른 감시 종 모니터링 및 생태학적 위험 평가에 특히 유용하며 오믹스 기반 환경 모니터링을 발전시키려는 현재의 노력과 일치합니다21.

현재 연구에서 우리는 대서양과 지중해 연안22 전역에서 가장 많이 이용되고 경제적으로 중요한 종 중 하나인 보라색 성게를 사용하여 Cd 오염이 생식선의 산화환원 상태와 대사체 프로필에 미치는 영향을 평가했습니다.

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프로토콜

1. 샘플 및 실험 설계

  1. 총 40마리의 성게 성 게(수컷 20마리, 암컷 20마리, 평균 길이: 45 ± 4mm, 평균 연령: 2.0 ± 0.5세, 평균 체중: 22.54 ± 2.50g) 2023년 5월 비제르테 해안(튀니지, 지중해)에서 수심 5-7m 범위에서 다이버가 수집합니다.
  2. 수집한 성게( 크기 에 따라 약 12-18개월로 추정되는 혼합 성게)를 실험실로 옮기고 ~38 PSU의 자연 염도, pH 7.8-8.0 및 광주기 12:12의 자연 염도로 16± 1°C의 폭기된 천연 해수에 보관합니다. 노출 기간 동안 매일 매개변수를 모니터링하여 환경 안정성을 보장하고 외부 변동을 최소화합니다.
  3. 1mL의 KCl 0.5M을 주입하여 산란을 유도하고 배우자를 육안으로 식별합니다. 여과된 바닷물로 개인을 헹구고 음식 제공 없이 통제된 조건에서 3일 동안 적응시킵니다.
  4. 성게를 무작위로 9마리씩 4개 그룹(3회 수조당 3마리)으로 나누어 50L 유리 수족관에 할당합니다. 해양 무척추동물의 산화 스트레스 바이오마커 및 대사체 반응을 평가하고 비슷하거나 더 적은 생물학적 복제를 사용한 이전에 발표된 연구23,24를 기반으로 표본 크기를 결정합니다.
    참고: 이 수준의 복제는 강력한 생물학적 표현과 통계적으로 유의미한 결과를 보장합니다.
  5. 순화 후 동물을 다음과 같이 염화카드뮴(CdCl2) 농도 범위에 96시간 동안 노출시킵니다. 그룹 I(Ctrl): 비-CdCl2물에 보관된 성게; 그룹 II(Tr1): 0.0183mg/L의 CdCl2농도에 노출된 성게; 그룹 III(Tr2): 0.183mg/L의 CdCl2농도에 노출된 성게; 그룹 IV(Tr3): 1.83mg/L의 CdCl2농도에 노출된 성게.
  6. 실험 중 물의 안정성을 유지하기 위해 24시간마다 물의 50%를 교체하고 사이펀을 사용하여 조심스럽게 물을 제거한 다음 CdCl2의 농도를 유지하면서 새로 준비한 물로 교체하십시오.

2. 조직 준비

  1. Telahigue et al.23에 의해 기술된 프로토콜을 사용하여 성게 조직 균질화의 제조를 수행합니다.
  2. 실험이 끝나면 각 그룹의 얼음 성게를 해부합니다. 멸균 가위를 사용하여 입 주위에 원형으로 절단하여 테스트를 엽니다.
  3. 주걱으로 5개의 생식선을 조심스럽게 제거하고 추가 분석을 위해 보관하십시오. 차가운 증류수로 세척하여 부스러기와 표면 오염 물질을 제거합니다.
  4. 추운 조건에서 Tris-HCl 완충액(20mM, pH 7.4)으로 생식선 분획 300mg을 각각 10초씩 3회 버스트하고 각각 10초씩 3회 버스트로 40% 진폭으로 설정된 프로브 초음파 발생기를 사용하여 균질화합니다.
  5. 각 생식선 샘플을 생화학적 분석(신선)용과 대사체 분석(동결건조)용의 두 부분으로 나눕니다.
  6. 10,000 x g 에서 20분 동안 원심분리합니다. 생화학적 매개변수 분석을 위해 상청액을 -80°C에서 보관합니다.
  7. GC-MS 분석 전에 동결 건조기를 사용하여 다른 생식선 분획을 동결건조합니다. 완전 건조가 완료될 때까지 0.1 mbar 미만의 진공으로 -50 °C에서 48시간 동안 유지합니다.
  8. Lowry 방법을 활용하여 BSA를 표준으로 사용하여 각 샘플의 총 단백질 함량을 결정합니다. 560nm에서 LOOH 수준을 결정하고 단백질의 mmol/mg으로 표현합니다.
    참고: 이 정량화는 바이오마커 수준을 정상화하기 위해 모든 생화학적 분석 전에 수행되었습니다.

3. 환원된 글루타티온 분석

  1. 글루타티온의 티올(SH) 그룹에 의한 5-50-디티오-비스-2-니트로벤조산(DTNB)의 환원으로 인한 2-니트로-5-메르카프투르산의 흡광도를 기반으로 Ellman25의 방법에 따라 환원된 글루타티온(GSH) 함량을 추정합니다.
  2. 인산염 완충액과 설포살리실산(4%)에 조직 균질염의 혼합물을 1600 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
  3. 얻은 상청액 500μL를 채취하여 0.025mL와 함께 Ellman 시약(DNTB)에 첨가합니다. 412nm에서 생성된 혼합물의 흡광도를 읽습니다.
  4. GSH 함량을 조직 g당 mg으로 평가합니다. 총 GSH 함량을 조직 μg/mg으로 표현합니다. 알려진 농도의 환원 글루타티온을 기반으로 표준 검량선을 사용하여 GSH 수치를 계산합니다.
    참고: 목적은 카드뮴 노출 후 산화 스트레스 마커로서 생식선 균질체에서 환원된 글루타티온(GSH)을 정량화하는 것입니다.

4. 카탈라아제 활성

  1. Aebi26의 방법에 따라 반응 설정을 수행합니다. 2.9mL의 100mM 인산염 완충액(pH 7.4)과 20μL의 생식선 조직 상청액으로 구성된 반응 배지를 준비합니다. 반응 매질을 실온으로 미리 평형화합니다.
  2. 새로 준비된 0.5M 과산화수소(H2O2) 용액 80 μL를 큐벳에 첨가하여 반응을 시작합니다. 즉시 내용물을 완전히 혼합하고 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 10초 간격으로 1mi 동안 240nm에서 흡광도 감소를 기록합니다.
  3. 시간 경과에 따른 240nm에서 흡광도 감소를 모니터링하여 결정된 H2O2 분해 속도를 기반으로 CAT 활성을 계산합니다. 다음 공식을 사용하십시오: CAT 활동= (ΔA/min x V) / (ε x l x C)
    여기서: ΔA/min = 240nm에서 분당 흡광도의 변화, V = 분석의 총 부피(L), ε = H2O2(43.6M-1/cm)의 몰 소광 계수, l = 큐벳의 경로 길이(보통 1cm), C = 단백질 농도(mg/mL).
  4. 몰 소광 계수 43.6 M/cm를 사용합니다. CAT 활성은 mg 단백질당 분당 분해되는 nmol H2O2 (nmol H2O2/min/mg 단백질)로 표현됩니다.
    참고: 목적은 카드뮴 노출에 대한 항산화 효소 반응의 척도로 P. lividus 의 생식선 균질체에서 카탈라아제 활성을 정량화하는 것입니다.

5. 과산화수소 발생 측정

  1. Ou 및 Wolff27에 의해 기술된 방법에 따라 철 산화-자일레놀 오렌지 분석을 사용하여 P. lividus 생식선의 과산화수소(H2O2) 수준을 측정합니다.
  2. 560nm에서 분광 광도계를 사용하여 상청액에서 H2O2의 농도를 결정합니다. 결과를 단백질의 nmol/mg으로 표현합니다.

6. 말론디알데히드 분석

  1. Draper 및 Hadley 방법28에 설명된 대로 샘플을 준비합니다. 생식선 균질액 500μL과 10% 트리클로로아세트산(TCA) 1mL를 혼합합니다. 4°C에서 10분 동안 2500 x g 에서 원심분리합니다.
  2. 생성된 상청액 1mL를 새 튜브에 옮기고 0.67% TBA 용액 1mL를 추가합니다. 혼합물을 100°C의 수조에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 샘플을 실온으로 식힙니다. 분광 광도계를 사용하여 532nm에서 흡광도를 측정합니다.
  4. 시약 블랭크(조직 추출물이 없는 TBA + TCA)를 사용하여 배경 흡광도를 뺍니다. 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(TEP)을 사용하여 표준 곡선을 준비하고 MDA 농도를 nmol/mg 단백질로 표현합니다.

7. 지질 하이드로퍼옥사이드 측정

  1. Jiang et al.29의 방법으로 설명된 바와 같이 자일레놀 오렌지 분석에서 철 산화를 사용하여 생식선 조직에서 지질 하이드로퍼옥사이드(LOOH)를 측정합니다.
    참고: 목적은 산화막 손상의 부산물인 말론디알데히드(MDA)를 정량화하여 생식선 조직의 지질 과산화 수준을 평가하는 것입니다.

8. 생식선에서 생리활성 화합물 추출 및 분석 스크리닝

  1. 주변 온도에서 150 rev/min의 회전식 셰이커에서 분석 등급 메탄올(≥99.8%; 1:25 w/v)에 물질을 담그어 각 그룹의 건조된 생식선 조직에서 삼중으로 친유성 화합물의 메탄올 추출을 수행합니다.
  2. 40°C의 수조 온도와 100rpm으로 설정된 회전 속도에서 회전 증발에 의해 MeOH 분획을 증발시킨 후 700 x g, 4°C에서 15분 동안 모든 추출물을 원심분리합니다. 조 추출물을 MeOH 1mL에 재현탁한 다음 밀봉된 바이알에 4°C에서 보관합니다.

9. 생식선 추출물의 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석

  1. 저장된 메탄올 추출물을 사용하여 바이알에 500μL 분취량을 만듭니다.
  2. 질량 분석기와 결합된 가스 크로마토그래피에서 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)으로 분석을 수행합니다. GC 컬럼은 5%-페닐-메틸실록산: 30m x 0.25mm x 0.25μm 필름 두께였습니다.
  3. 헬륨을 1mL/min의 일정한 유속으로 운반 가스로 사용합니다. 분할 모드에서 100:1의 비율로 주입량을 1μL로 설정합니다. 오븐 온도를 5°C/min에서 4-280°C로 프로그래밍합니다.
  4. 분광계를 전자 충격(EI) 모드에서 작동하고 이온화 에너지는 72eV, 이온 소스 온도는 250°C, 스캔 시간은 1초, 질량 범위는 45-550 amu입니다.
  5. NIST98MS Library 및 Willy Library275 데이터베이스의 질량 스펙트럼과 질량 스펙트럼을 비교하여 화합물을 식별합니다.

10. 통계 분석

  1. 먼저 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정규성을 평가하고 Levene's test를 사용하여 분산의 동질성을 위해 데이터 세트를 평가합니다.
  2. 표준 정규화 절차, 로그 변환 및 파레토 스케일링을 사용하여 MetaboAnalyst6.0 30으로 데이터를 전처리하여 정규 분포 및 분산 동질성과 같은 ANOVA 가정을 충족합니다.
  3. Metaboanalyst를 사용하여 다변량 통계 분석을 수행하고, 다중 테스트 수정을 위해 Benjamini-Hochberg 거짓 발견률(FDR) 방법을 사용하여 수많은 생화학적 비교와 관련된 유형 I 오류를 설명하고, 통계적 견고성을 보장합니다.
  4. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 결과를 비교합니다. 평균 간의 차이는 p <0.05일 때 유의한 것으로 간주되었습니다.
  5. PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)를 사용하여 비교 가능한 그룹을 구별합니다. 모든 화합물에 대한 투영(VIP)의 변수 중요도를 결정합니다.
  6. 표준화된 변수의 1차원 통계 분석을 위해 paired Student's t-test를 사용하여 p-값을 계산합니다.

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결과

우리 방법의 타당성과 효능은 일관되고 신뢰할 수 있는 측정을 가능하게 하는 생물학적 및 기술적 복제를 사용하여 보장되었습니다. 분석은 표준 편차가 일반적으로 10% 미만인 낮은 변동성을 보여 높은 반복성을 나타냅니다. 정확한 대사산물 정량화를 보장하기 위해 GC-MS 분석에는 검량선과 내부 표준이 포함되었습니다. 사용된 모든 기술은 원고에 명시된 바와 같이 이전에 해양 생태독성학 및 환경 대사체학에서 검증된 널리 인정되는 프로토콜을 기반으로 합니다.

바이오마커 반응
결과는 카드뮴에 노출된 P. lividus 의 생식선에서 GSH 수준이 대조군과 비교할 때 모든 치료군(Tr1, Tr2 및 Tr3)에서 유의하게 증가했음<을 보여줍니다(그림 1).

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토론

본 연구는 성게 P. lividus 생식선에 대한 Cd의 독성 효과를 생화학적 바이오마커와 활성 대사산물을 분석하여 평가하기 위해 기획되었다. P. lividus 를 다양한 농도의 Cd에 노출시키면 산화 스트레스 반응이 발생했습니다. 이러한 발견은 성게 땅의 항산화 수준 증가와 오염 물질 수준 사이에 밀접한 상관관계가 있음을 나타내는 이전 보고서와 유사합니다13.

우리의 결과는 서로 다른 농도의 Tr1, Tr2 및 Tr3에 노출된 후 GSH 수준이 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1A). 우리의 연구 결과는 해삼 Holothuria forskali에 대한 수은 노출의 영향을 연구한 Telahigue et

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자들은 패스트 트랙 연구 지원 프로그램을 통해 이 작업을 지원해 준 비샤 대학의 대학원 및 과학 연구 학장에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
동결 건조기BiobaseBK-FD12PT 동결 건조기동결 건조
크로마토그래프애질런트 테크놀로지HP 6890 가스 크로마토그래프화염 이온화 검출기(FID)GC
컬럼애질런트 테크놀로지HP-5(5%-페닐)-메틸실록산 컬럼비극성  column  광범위한 응용 분야에서 탁월한 성능을 제공하는 질
량 분석기Agilent TechnologiesHP 5973 질량 분석기Quadrupole MS
가스 스 스

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