방법 논문

점막 천포창 진단을 위한 결막 생검 및 직접 면역형광 기법

DOI:

10.3791/68303

⸱

2025년 6월 17일

 ,  , 
1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

이 논문에서

요약

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여기에서는 점막 천포창을 확인하기 위해 결막 생검을 채취하고 처리하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

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안구 점막 천포창(MMP)은 만성 결막염으로 나타나며, 치료하지 않고 방치하면 실명을 유발할 수 있습니다. 시기적절한 진단과 면역억제 요법으로 질병 진행을 예방할 수 있습니다. 기저막의 면역 복합체 침착을 위한 결막 생검의 직접 면역형광 염색(DIF)은 MMP를 진단합니다. 생검 양성률은 생검 특성, 측측성, 고령 및 질병 활성도에 따라 달라집니다. 현재 방법 백서에서는 결막 생검을 채취하는 기술과 시료 이송 및 블록 준비를 위해 최적의 절단 온도 중간 충전 카트리지를 사용하는 기술을 설명합니다. 생검은 양쪽 눈의 결막에서 흉터가 없거나, 침범되지 않거나, 상대적으로 덜 침범된 부위에서 수행됩니다. 일반적인 생검 크기는 길이 4-5mm, 너비 2-3mm이며, 기저막이 놓치지 않도록 아래에 작은 결막하 조직이 있어야 합니다. 기저막의 존재를 확인하기 위해 주기적인 산성 Schiff 염색을 수행하는 것이 좋습니다. 지정된 프로토콜을 사용하여 생검의 동결 절편을 형광 접합 항체 IgG, IgM, IgA 및 보체 인자 C3c 및 C4c로 염색합니다. 양성 생검 결과 기저막에서 녹색 양성 형광이 나타나며, 항체 중 하나가 양성이더라도 MMP 양성입니다. 음성 생검이 천포창성을 배제하지는 않습니다. 그러나 양성 반응은 MMP를 확진하고 약물 유발 시결막염 또는 가성 천포창과 구별됩니다.

서론

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점막 천포창(MMP)은 자가면역 병인인 만성 결막 질환으로 신체의 점막에 영향을 미칩니다 1,2. 만성 결막염은 다양한 병인을 가지고 있으며, MMP는 전신 면역억제가 필요하기 때문에 SJS, 유육종증, 안구 편평 신생물 및 가성 천포창과 구별이 필요합니다 3,4. 더욱이, MMP는 환자가 종종 늦게 나타나 초기에 오진되는 잠재적인 실명 질환입니다 1,2,5. 전신 침범이 없는 안구 침범만이 안구 MMP 환자의 27.4%에서 관찰되었다6. MMP를 진단하려면 결막 생검을 통해 기저막에 자가항체가 있는지 확인해야 합니다 2,5. 직접 면역형광(DIF)은 MMP와 같이 결막에 영향을 미치는 자가면역 질환을 식별하기 위한 중추적인 진단 도구입니다. DIF는 MMP의 특징인 기저막 영역(BMZ)에서 면역글로불린의 현장 침착을 감지하고 성분을 보체하는 데 도움이 됩니다. DIF 양성률은 30%에서 80%까지 다양합니다1,5. 그러나 일부 환자, 특히 안구 단독 MMP가 있는 환자는 조직 검사에서 음성이 나올 수 있지만, 질병 진행에 대한 임상 기록은 생검 양성 안구 MMP 사례와 유사하게 취급된다 7,8. 따라서 Dart 등은 안구 전용 MMP8에 대한 별도의 진단 기준이 필요하다고 강조했습니다.

연구에서 양성률이 낮은 이유는 광범위한 안구 표면 흉터를 동반한 진행성 질환, 부적절한 조직 처리 또는 염색 기술, 생검 음성 질병 변이 8,9,10,11입니다. 안구 MMP가 의심되는 환자 27명의 생검을 후향적으로 분석한 결과, 양성률은 30%에 불과했고, 63.7%는 안구 침범만 있었다12. DIF에는 특정 프로토콜이 필요합니다. 모든 진단 실험실이 이에 맞춰져 있는 것은 아닙니다. 생검 부위에 관해서는 한쪽 또는 양쪽 눈으로 생검을 실시할 것인지의 여부와 검체 이송 용액 13,14,15에 대한 차이점이 있다. 본 센터에서 실시한 결막 생검에 대한 후향적 분석에서 DIF 양성률은 54.1%였으며, 양측으로 생검했을 때 양성 반응이 더 많았습니다(59% 대 45%)8. 생검이 중요하지만, 임상 징후와 진행성 안구 표면 침체화는 MMP의 진단을 확정하는 데 도움이 됩니다. 구강이나 피부와 같은 안구 외 부위가 침범된 경우 진단이 더 쉬웠으며, 각각 40%와 18%의 환자에서 진단이 더 쉬웠다5.

기존 문헌에는 변형이 있으며, 여기에 제시된 프로토콜은 고유한 전달 매체(14)에 대한 필요성을 줄이기 위해 도입된 수정 사항과 함께 참조 가이드 역할을 할 수 있습니다. 생검은 최적 절단 온도(OCT) 배지로 전송되고 병리학 실험실의 동일한 전달 카트리지에서 스냅 프로즌되므로 추가 전달 매체가 필요하지 않습니다. 현재 논문에서는 결막 조직의 DIF 염색 방법론, 조직 채취 및 샘플 전달 프로토콜에 대해 간략하게 설명합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 LV Prasad Eye Institute 인간 연구 윤리 위원회의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 결막 생검 기법

  1. 천포창성이 의심되는 환자의 양쪽 눈에서 국소 또는 국소 마취 및 수술 현미경으로 생검을 계획합니다.
  2. 환자의 사전 동의를 받고 출혈, 흉터 및 수술 후 국소 스테로이드 투여의 가능한 부작용을 나열합니다.
  3. 양쪽 눈에 0.5% 프로파라카인 1-2방울을 떨어뜨리고 5분 정도 기다렸다가 시술을 시작합니다.
  4. 환자가 가는 집게로 결막을 만질 때 통증을 느끼지 않는지 확인하십시오. 환자가 국소 프로파라카인을 도포한 후에도 통증을 느끼면 결막하 2% 리도카인 0.2mL를 투베르쿨린 주사기 1mL로 주사합니다.
  5. 오른쪽 또는 왼쪽 눈 중 먼저 선택한 눈에 검경을 배치합니다.
  6. 안구 표면에 흉터와 각질화가 있는 부위를 검사합니다. 관련되지 않고 흉터가 있거나 각질화되지 않은 생검 영역을 선택하십시오.
    참고: 이 연구에서는 변두리에서 멀리 떨어진 상구결막이 생검 부위로 선호되며, 그 다음으로 하구결막이 선호됩니다.
  7. Lim의 집게를 사용하여 결막에서 공막을 들어 올리고 길이 4-5mm, 너비 2-3mm의 Westcott의 가위로 선형으로 절제합니다.
  8. 전체 생검을 즉시 최적 절단 매체(OCT)로 옮깁니다.
    참고: 생검을 생리 식염수 또는 Michel 수송 배지로 옮길 수 있습니다.
  9. 카트리지와 중앙에 우물이 있는 플라스틱 티슈 틀을 가져다가 식염수로 세척하고 자연 건조합니다.
  10. 카트리지에 오른쪽 눈과 왼쪽 눈에 각각 OCT 매체를 채웁니다. 절제된 결막 조직을 OCT 배지에 담그고 병리학적으로 보냅니다.
  11. 반대쪽 쪽에 대해서도 유사한 단계를 반복합니다.

2. 조직 이식

  1. 결막의 생검 표본을 OCT 배지에 삽입하여 Michel의 수송 배지 또는 생리식염수로 받은 경우 조직 구조와 항원성을 보존합니다.
  2. 액체 질소 또는 드라이 아이스를 사용하여 포함된 샘플을 스냅 동결하고 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.

3. 준비 및 조직 절단

  1. 냉동 조직을 -20 °C에서 -25 °C의 저온 유지 장치를 사용하여 4-6 μm 슬라이스 (숫자 7)로 절단합니다.
  2. 접착력을 보장하기 위해 양전하를 띤 폴리리신 코팅 현미경 슬라이드에 절편을 장착하고 알루미늄 호일로 염색할 때까지 -80°C에서 보관합니다.

4. 면역형광성 염색

  1. 슬라이드를 실온(RT)에서 10분 동안 해동하고 차가운 아세톤(100%)에서 10분 동안 고정하여 항원을 보존하고 조직 손상을 방지합니다.
  2. 1x PBS로 3회 헹구고, 매번 5분 동안 헹구어 과도한 OCT 배지와 아세톤을 제거합니다.
  3. 슬라이드에 희석된 접합 항체 anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM 및 anti-C3(Fibrinogen-1:10[양성 대조군], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10)를 적용합니다.
    참고: 항체는 1x PBS에 희석됩니다.
  4. 음성 대조군의 경우, 접합 항체 적용을 건너뛰고 아래에 언급된 나머지 단계를 따르십시오.
  5. 항체 희석에 대한 제조업체의 지침을 따르고 알려진 양성 및 음성 대조군으로 표준화하십시오.
  6. 37°C의 가습실에서 45-60분 동안 슬라이드를 배양합니다.
  7. PBS(각 5분씩 3×)로 슬라이드를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
  8. 핵 시각화를 위한 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylidole) 함유 장착 매체를 사용한 대조염색.
  9. 슬라이드 위에 커버슬립을 놓고 20분 동안 경화시킵니다.
  10. 사용된 형광단에 적합한 필터(488nm의 경우 여기 녹색 필터)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 검사합니다.
  11. 디지털 현미경 사진으로 결과를 문서화합니다.

5. 급속 주기적 산 - Schiff 염색

  1. 주기적 산 쉬프(PAS)의 제조
    1. 기본 푸신 1g을 뜨거운 증류수 100mL에 녹입니다.
    2. 염산 10mL와 이황산칼륨 2g을 첨가하여 염료를 탈색합니다.
    3. 냉각 후 활성탄 0.5g을 넣고 저어 용액을 여과하여 맑은 주기산 Schiff 시약을 얻습니다. 어두운 병에 보관하십시오.
      참고: Schiff의 시약을 테스트하려면 37% 포르말린 10mL를 시계 유리에 붓고 테스트를 위해 Schiff 시약을 몇 방울 떨어뜨립니다. 좋은 Schiff의 시약은 빠르게 적자주색으로 변합니다. Schiff 시약이 악화되면 반응이 지연되고 생성물은 짙은 청자주색이 됩니다.
  2. PAS 염색 기법
    1. 슬라이드를 물에 수화시키십시오.
    2. 0.5% 주기적 산성 용액에서 5분 동안 산화시킵니다.
    3. 증류수로 헹굽니다.
    4. Schiff의 시약에 15분 동안 놓습니다(이 단계에서 섹션이 연한 분홍색으로 보임).
    5. 미지근한 수돗물로 5분 동안 세탁합니다(섹션이 짙은 분홍색으로 변함).
    6. Mayer의 hematoxylin을 1분 동안 counterstain합니다.
    7. 수돗물로 5분 동안 씻습니다.
    8. 다음 용액에서 슬라이드를 탈수하십시오 : 80 % 에틸 알코올에서 1 분 동안 1 회, 90 % 에틸 알코올에서 1 분 동안 2 회, 100 % 에틸 알코올에서 1 분 동안 2 회.
    9. 슬라이드를 자일렌에 1분씩 3회 탈수합니다.
    10. 합성 장착 매체(예: DPX 장착제)를 사용하여 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다.
    11. 명시야 현미경으로 PAS 결과를 관찰합니다.

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결과

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DIF를 해석하려면 조직 단면에 기저막이 있는지 확인해야 합니다(그림 1). PAS로 염색된 슬라이드에서 기저막은 결막 상피의 기저 영역에 위치한 밝은 분홍색 막으로 나타납니다(그림 1C). 기저막의 연속성과 건축에 대해서도 언급해야 합니다. DIF 양성은 밝은 녹색 BM(그림 1B)으로 표시되며, 이는 IgM(그림 2A), IgA(그림 2B), IgG(그림 1B), C3 또는 C4의 침착을 나타냅니다. 이 5가지 항체 중 1개라도 양성이 나오면 DIF 양성으로 간주됩니다. PAS 염색에서 기저막이 없는 경우 결막 생검을 반복해야 합니다. 피브리노겐으로 염색된 양성 대조군은 기저막에서 밝은 녹색 형광을 보여줍니다...

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토론

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여기에 설명된 결막 생검 기법은 OCT 배지를 전달 매체로 사용하여 추가 전달 매체의 필요성을 없애고 동결 절편을 위해 OCT 배지로 전달하기 위한 생검 처리를 피합니다. 배지와 생검으로 채워진 플라스틱 카트리지 금형을 직접 동결하여 조직 블록을 만든 다음 절편합니다. OCT의 장점은 결정 형성으로 인한 손상을 최소화하면서 빠르게 동결되고 조직 표본을 캡슐화한다는 것입니다. 직접 면역형광에서 가장 중요한 단계는 시료 전달입니다. 결막 생검은 포르말린으로 보내서는 안 됩니다. 그러나 한 연구에서는 면역조직화학(immunohistochemistry)을 사용하여 처리된 포르말린 고정, 파라핀 함유 검체의 생검 양성률을 평가했다16. 어떤 생검도 IgG 또는 IgA에 대해 양성이 아니었으며, 생검의 56%만이 C3d 또는 C4d에 대해 양성이었습니다. 실험실 시설을 외주로 운영하는 클리닉의 경우, 생리식염수도 수송 매체로 사용되어 왔...

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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이 연구를 지원해 주신 인도 하이데라바드 안과 연구 재단(Hyderabad Eye Research Foundation)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 N 염산 피나르  화학 제한 7647-01-0
아세톤 퀄리겐질문33517
알부민다코F0117
기본 푹신퀄리겐질문39402
C3c진단 바이오시스템즈 F003
C4c진단 바이오시스템즈 F005
카트리지폴리사이언스25376-500
숯 활성 시그마C-5260
극저온 조절기 라이카 CM1860UV 
냉동 절개 블레이드 라이카 818
DAPI앱캠 AB104139
피브리노겐 진단 바이오시스템즈 에프006
형광 현미경올림푸스CX43
집게 조자 외과JS1528A
습도 챔버 진단 바이오시스템즈 에스엠365
IgA진단 바이오시스템즈 에프007
IgG진단 바이오시스템즈 F008
IgM진단 바이오시스템즈 에프009
IHC 접착 유리 슬라이드 토모 33140455
임의 집게스피드웨이 에스-7223
미셸의 탄스포트 미디엄피셔 시니틱스 NC0253304
미세한 커버 유리블루 스타https://www.bluestarslides.com
OCT 중간 크라이오매트릭스 6769006
PBS 다코dm831
요오드산 시그마375810-25G
이아황산칼륨시그마P2522-500G
프로파라카인 0.5%선웨이 프라이빗 지/1118A
웨스트콧의 가위Pillig Gurgical Intruments 423480

참고문헌

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  17. Philip, A. M., Stephenson, A., Al-Dabbagh, A., Ramezani, K., Fernandez-Santos, C. C., Foster, C. S. Ocular cicatricial pemphigoid with IgM-positive biopsy. Cornea. 42 (12), 1503-1505 (2023).
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