방법 논문

Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

DOI:

10.3791/68308

⸱

2025년 6월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포 기능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 신경면역 상호 작용을 자세히 검사할 수 있으며 다른 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 적용할 수 있어 뇌졸중 병리학의 면역 반응에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주요 원인이며, 허혈성 뇌졸중이 대부분의 경우를 차지합니다. 허혈성 뇌졸중 후에는 상주 면역 세포와 침투 면역 세포가 활성화되어 신경 세포가 더 손상됩니다. 그러나 허혈성 뇌졸중의 병리학에서 면역 체계의 역할은 완전히 이해되지 않았는데, 이는 주로 신경염증 중 미세환경의 변화에 대한 반응으로 면역 반응의 복잡하고 역동적인 조절로 인해 이루어졌습니다. 따라서 허혈성 뇌졸중 후 시간이 지남에 따라 상주 면역 세포와 침투 면역 세포의 활성화를 모니터링하고 분석하는 것이 필수적입니다. 본 연구에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 이러한 면역 세포의 기능을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 특정 시점에서 경색된 뇌 조직을 미세 해부한 다음 기계적 방법과 효소적 방법을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 세포는 70μm 세포 스트레이너를 통과하고 유세포 분석으로 정량화하기 전에 형광 표지된 항체 칵테일로 표지됩니다. 이 분석법은 허혈성 뇌졸중 후 신경면역 상호작용을 조사하기 위해 특별히 개발되었지만, 다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 다른 신경퇴행성 질환의 신경면역 메커니즘을 연구하는 데에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌졸중은 전 세계적으로 사망 및 장기 장애의 주된 원인이며, 허혈성 뇌졸중이 대부분의 사례를 차지합니다 1,2,3. 이 방법의 전반적인 목표는 미니 뇌졸중 쥐 모델에서 상주 면역 세포와 침투 면역 세포의 활성화를 평가하기 위한 정교한 접근 방식을 제공함으로써 허혈성 뇌졸중 후 발생하는 신경면역 상호 작용에 대한 이해를 높이는 것입니다 4,5. 이러한 면역 세포와 신경 미세환경 사이의 복잡한 상호 작용은 허혈성 뇌졸중의 병태생리학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나 이러한 신경면역 상호작용의 기저에 있는 정확한 메커니즘은 주로 신경염증에 의해 유발되는 면역 반응의 역동적이고 다면적인 특성으로 인해 제대로 규명되지 않았습니다6. 이 기술은 신경 염증의 맥락에서 면역 반응의 복잡한 역학과 신경 손상 및 회복 결과에 대한 후속 영향을 설명하는 것을 목표로 합니다.

이 기술의 개발의 근거는 면역 세포가 신경 세포 손상을 악화시키고 허혈성 사건 후 회복에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 한다는 데서 비롯됩니다. 이러한 상호 작용을 연구하는 전통적인 방법은 면역 세포 활성화의 시간적, 공간적 뉘앙스를 포착하는 데 필요한 해상도가 부족한 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 미세절개된 경색된 뇌 조직에서 유래한 단세포 현탁액에 대한 유세포 분석을 사용함으로써 시간 경과에 따른 면역 세포 프로파일에 대한 보다 상세하고 역동적인 평가를 제공합니다 7,8. 이 접근법을 통해 특정 면역 세포 집단과 그 기능 상태를 식별할 수 있으며, 이는 허혈성 뇌졸중의 병태생리학을 이해하는 데 중추적인 역할을 합니다.

면역 세포 유형의 개별 기여도에 대한 제한된 통찰력을 제공할 수 있는 조직학적 염색 또는 벌크 RNA 염기서열분석과 같은 대체 기술과 비교할 때 이 유세포 분석법은 몇 가지 이점을 제공합니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 유세포 분석을 통해 여러 마커를 동시에 고처리량 분석할 수 있어 면역 세포 표현형 및 기능을 보다 포괄적으로 특성화할 수 있음을 보여주었습니다 9,10,11,12,13. 또한 다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 다양한 신경퇴행성 질환에 적응할 수 있는 이 방법의 능력은 신경면역 상호 작용을 다루는 광범위한 문헌에서 다양성과 관련성을 보여줍니다.

이 방법의 적용을 고려하는 연구자에게는 연구의 구체적인 목표를 평가하는 것이 필수적입니다. 이 기술은 허혈성 뇌졸중 또는 관련 신경퇴행성 질환과 관련하여 면역 반응에 대한 상세한 시간 분석이 필요한 조사에 특히 적합합니다. 사용자는 유세포 분석에 대한 기초적인 이해와 쥐 모델에 대한 경험을 보유하여 이 프로토콜을 효과적으로 구현하고 결과 데이터를 해석하는 것이 좋습니다. 신경면역 상호작용을 연구하기 위한 강력한 틀을 제공함으로써, 이 방법은 뇌졸중 병리학에서 면역 관여의 복잡성을 설명하기 위한 지속적인 노력에 크게 기여합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 베이징 우호 병원, 캐피탈 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 용액에 멸균 여과를 적용하고 사용되는 모든 튜브를 멸균할 것을 권장합니다.

1. 시약 및 완충액 준비

  1. 소화 효소 혼합물: 콜라겐분해효소 IV를 용해시켜 0.25%의 농도를 얻고 DNase I을 희석하여 최종 농도 2 U/mL에 도달합니다.
  2. MACS(Magnetic Activated Cell Sorting) 완충액: 소 혈청 알부민(BSA) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 용해시켜 1x PBS에서 각각 0.5% 및 2mM의 농도에 도달합니다.

2. 국소 허혈성 뇌졸중 모델

참고: C57BL/6 J 마우스(8-10주령)를 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 국소 허혈성 뇌졸중 모델을 확립했습니다14. 마우스는 체중 10g당 0.2mL의 용량으로 1.25% 아베르틴 용액을 사용하여 대안적으로 마취시킬 수 있습니다.

  1. 3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취하고 가스 마취 장치로 1.5%의 용량을 유지합니다. 온열 패드를 사용하여 전체 시술 동안 체온을 37°C로 유지하십시오.
    참고: 이 연구는 절차를 시작하기 전에 수술 평면의 도달을 확인하는 것의 중요성을 강조합니다. 이 단계는 대상 부위에 대한 최적의 접근을 보장하고 수술 중 잠재적인 합병증을 최소화하는 데 중요합니다.
  2. 전기 면도기를 사용하여 오른쪽 눈과 오른쪽 귀 사이의 털을 다듬습니다. 해부 현미경으로 눈에 인접한 지정된 부위에 수직 절개를 만듭니다.
  3. 모든 조직을 부드럽게 분리하여 두개골을 드러내고 수직 "Y"자 모양의 혈관 구조를 특징으로 하는 우측 중대뇌동맥(MCA)의 원위 가지를 식별합니다. 전기 드릴을 사용하여 두개골을 관통하고 조심스럽게 제거하십시오.
  4. 마이크로 집게로 수막을 섬세하게 절제합니다.
  5. 우측 중대뇌동맥(MCA)의 원위부를 노출시킨 후 10-0 봉합사를 사용하여 우측 MCA의 원위부 분지의 영구적인 결찰술을 시행합니다.
  6. 조직을 원래 상태로 재배치하고 조직 접착제로 얼굴 피부 절개 부위를 봉합합니다.
  7. 마우스를 누운 방향으로 놓고 전기 면도기로 목 부분의 털을 다듬습니다.
  8. 목 부위를 수평으로 절개하고 턱밑샘을 부드럽게 잡아당깁니다.
  9. 마이크로 집게로 경동맥초를 조심스럽게 절개하여 총경동맥을 식별하고 미주신경에서 분리합니다.
  10. 총경동맥을 통해 4-0 봉합사를 꿰매고 슬립노트로 고정합니다.
  11. 반대쪽 총경동맥에 대해 10단계를 반복합니다. 양측 총경동맥(CCA)을 7분 동안 일시적으로 폐색합니다.
  12. 턱밑샘 조직을 원래 위치로 교체하고 목 절개 부위를 조직 접착제로 봉합합니다.
    참고: 가짜 수술 그룹은 뇌졸중 그룹과 동일한 절차를 거쳤으며, 원위 MCA와 CCA가 의무화되지 않은 상태로 유지되었다는 단 한 가지 예외가 있습니다.
  13. 수술 과정 내내 그리고 수술 후에도 호흡 및 체온을 포함하여 마우스를 모니터링합니다. 마우스가 완전히 깨어날 때까지 보온 패드에 마우스를 올려 두십시오.

3. 뇌 관류 및 해부

  1. 50mL 주사기를 준비하고 끝에 26G 바늘을 붙입니다. 주사기에 식염수를 채웁니다.
  2. 마우스에 깊은 마취를 달성하기 위해 1.25% 아베르틴을 두 번 투여합니다.
    알림: 다음 단계로 진행하기 전에 마우스가 완전히 마취되었는지 철저히 확인해야 합니다.
  3. 폼 보드에 마우스를 누운 방향으로 놓고 앞다리와 뒷다리를 확장하고 26G 바늘로 제자리에 고정합니다.
  4. 마우스가 완전히 마취되면 안과 겸자로 복부 피부를 잡고 옆으로 절개하여 간을 드러냅니다. 심장이 노출되도록 갈비뼈의 양쪽을 따라 절단하십시오.
  5. 26G 바늘을 좌심실에 삽입하고 귓바퀴를 절단한 다음 주사기를 눌러 혈액이 흘러나오도록 합니다.
  6. 귓바퀴에서 배출되는 혈액이 맑게 나타날 때까지 관류 과정을 계속하십시오.
  7. 스트레이트 수술 용 가위를 사용하여 척수 바로 위의 마우스를 참수합니다.
  8. 두개골을 드러내기 위해 머리 피부에 후방-전방 절개를 만듭니다. 측벽과 두개골 기저부의 접합부에서 두 개의 측면 절개를 만듭니다.
  9. 시상 봉합선을 따라 두개골을 절단하고 안와 사이를 절개합니다.
  10. 겸자를 사용하여 각 반구를 덮고 있는 두개골을 제거하여 뇌를 노출시키고 이를 마우스 스틸 뇌 매트릭스로 옮깁니다. 그런 다음 뇌를 2mm 두께의 연속적인 코로나 절편으로 절단합니다.

4. 유세포 분석을 위한 단세포 현탁액 및 항체 염색으로 피질 조직의 소화

  1. 500μL의 분해 효소 혼합물을 12웰 플레이트의 각 웰에 주입합니다.
  2. 경색 조직을 섬세하게 분리하고 마이크로 겸자를 사용하여 소화 효소 혼합물로 전달합니다(그림 1).
  3. 안과용 가위로 조직을 가능한 가장 작은 조각으로 미세하게 조각하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
  4. P1000 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 흡인 및 분주하여 조직을 개별 세포로 해리한 다음 용액을 70μm 세포 여과기에 통과시킵니다. 12웰 플레이트와 세포 여과기를 칼슘과 마그네슘이 함유된 얼음처럼 차가운 HBSS로 계속 헹굽니다.
  5. 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용한 다음 상층액을 조심스럽게 버립니다.
    참고: 생산된 펠릿은 매우 느슨하고 쉽게 제거된다는 점을 감안할 때 세포 손실을 방지하기 위해 펠릿을 방해하지 마십시오.
  6. 1mL의 1x PBS에 펠릿을 재현탁하고 5단계를 반복합니다. 그 후, 펠릿을 150μL의 1x PBS에 재현탁시키고 현탁액을 바닥이 둥근 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 500 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 다시 원심 분리하십시오.
  7. 96웰 플레이트를 단단히 잡고 신속하게 뒤집어 상층액을 버립니다.
  8. 세포 생존율 형광 염료를 1x PBS에서 1:100의 비율로 희석한 다음 펠릿을 150μL 분취액으로 재현탁합니다. 빛을 차단한 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
  9. 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상층액을 버립니다. 세포 표면 항체 칵테일을 MACS 완충액에서 희석합니다. 세포를 세척하지 않고 세포 표면 항체 칵테일을 첨가하고 4 °C에서 15-20 분 동안 추가로 배양합니다.
  10. 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 150μL의 MACS 완충액에 재현탁합니다.
  11. 단계 4.10을 반복하고 현탁액을 1.5mL 원심분리 튜브 또는 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관으로 옮깁니다.

5. 유세포 분석 및 분류

  1. 수동 기법 또는 온라인 설계 도구를 활용하여 기기 구성에 따라 multicolor 유세포 분석 패널을 설계하여 항체에 접합된 형광단의 선택을 최적화하고 스펙트럼 중복을 최소화합니다.
    참고: multicolor 유세포 분석 패널을 설계할 때 몇 가지 중요한 고려 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 시작하기 전에 레이저와 필터를 포함하여 사용 중인 기기의 구성을 숙지하는 것이 중요합니다. 둘째, 저농도 항원에 대해서는 항체에 밝은 형광단 라벨을 사용하고, 발현이 높은 항원을 표적으로 하는 항체에는 희미한 형광단 라벨을 선택합니다. 마지막으로, 데이터에서 생존 불가능한 세포와 파편을 효과적으로 제외하기 위해 패널에 세포 생존도 염료를 포함하는 것이 필수적입니다. 특히, 존재 비중이 낮거나 특성이 불량한 항원의 적절한 게이팅을 보장하기 위해서는 FMO(fluorescence minus one) 대조군을 활용해야 한다15. FMO 대조군은 관심 세포를 제외한 모든 계통 마커를 포괄하며, 양성 염색 세포와 음성 염색 세포 간의 정확한 묘사를 용이하게 합니다16.
  2. 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 검출기의 설정을 조정하여 관심 세포가 스케일에 적절하게 표시되고 필요에 따라 게이트될 수 있도록 합니다.
  3. FSC 및 SSC를 꼼꼼하게 미세 조정하여 이물질이나 외부 소음을 제거합니다. FSC의 면적과 높이를 모두 보여주는 점도표 내에서 doublet을 단일 세포와 구별합니다. cell viability fluorescence dye-negative 신호를 기반으로 생존 가능한 세포를 분리합니다.
    알림: 다양한 기기의 설정은 약간의 변동이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 일부 세포 분류기는 FSC의 너비와 높이를 사용하여 이중 세포와 단일 세포를 구별하는 반면, 다른 세포 분류기는 동일한 목적으로 FSC의 면적과 높이를 사용합니다.
  4. 각 채널에 대한 보상을 조정합니다.
    참고: 세포 샘플과 상업적으로 이용 가능한 보상 비드는 모두 형광 유출 보상을 위해 사용될 수 있습니다.
    1. 자동 형광 대조군(염색되지 않은 세포)과 염색된 세포 양성 대조군을 비교하여 염색된 세포가 각 파라미터에 대해 적절하게 확장되었는지 확인합니다. 또한 다중 색상 세포 샘플을 분석하고, 2색 도트 플롯을 모니터링하고, 보상 설정을 상향 또는 하향으로 조정하여 세포 집단이 서로 수직 또는 수평으로 정렬되도록 하여 보상을 미세 조정합니다.
    2. CD45 및 CD11b 신호를 활용하여 림프구(CD11b-CD45높음), 미세아교세포(CD11b+CD45int), 골수성 세포(CD11b+CD45높음) 및 성상세포(CD11b-CD45-GLAST+)를 구별합니다17,18.
    3. 가짜 뇌 조직을 자동 형광 제어 및 림프구 구별을 위한 참조로 사용합니다. 특정 표적을 검사 중인 경우 뇌졸중 후 뇌 조직과 함께 FMO 대조군을 활용합니다.
  5. 제어 및 샘플 데이터 수집을 시작하고 저장되었는지 확인합니다.
    참고: 여기에 설명된 미니 뇌졸중 모델이 작은 경색(inadct)을 초래한다는 점을 감안할 때, 일반적으로 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 모델보다 더 적은 수의 세포가 수집됩니다. 일반적으로 5 × 105 세포를 수집하면 각각 약 5 × 103 microglia와 1 × 105 성상교세포가 생성됩니다.
  6. 원하는 세포 집단을 선택하여 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관 또는 15mL 원추형 원심분리 튜브로 분류합니다.
    참고: PBS 500μL를 추가하고 튜브를 꼼꼼하게 헹구어 세포의 생존력을 보장하고 세포 펠릿 형성을 돕습니다.

6. 선택된 세포 집단에서의 유전자 발현 분석

참고: 총 RNA 추출은 제조업체의 지침에 따라 상업용 키트를 사용하여 대안적으로 수행할 수 있습니다.

  1. 5.6 단계의 세포를 500 × g 에서 4 °C에서 3 분 동안 원심 분리 한 다음 상층액을 버립니다. TRIzol 시약 1mL에 세포를 재현탁합니다.
    참고: 분류된 세포의 수는 배양된 세포 또는 조직에 비해 상당히 적습니다. 결과적으로, 더 높은 원심분리 속도는 더 조밀한 세포 펠릿을 형성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 단계에서 얻은 세포는 세포 배양 또는 단일 세포 RNA 염기서열분석 파이프라인과 같은 후속 응용 분야에 활용될 수 있습니다.
  2. nucleoprotein complex의 dissociation을 용이하게 하기 위해 샘플을 5분 동안 RT에 두었습니다.
  3. 샘플에 클로로포름 0.2mL를 추가하고 튜브를 고정합니다. 튜브를 15초 동안 세게 흔든 다음 RT에서 2분 동안 배양합니다.
  4. 시료를 10,000g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. RNA는 상부 수성상에만 남아 있습니다.
  5. 상부 수성상을 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮기고 계면을 방해하지 않도록 주의하십시오.
    참고: 수성상의 부피는 약 500μL여야 합니다.
  6. 0.5mL의 이소프로판올을 주입하고 튜브를 여러 번 뒤집어 부드럽게 혼합하여 수성상에서 RNA를 침전시킵니다. RT에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.
  7. 샘플을 10,000g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 수집합니다.
  8. 상층액을 디캔팅하고 흡인으로 잔류 액체를 철저히 제거합니다.
  9. RNA 펠릿을 75% 에탄올로 한 번 세척하고 최소 1mL의 75% 에탄올을 추가합니다. 샘플을 철저히 혼합한 다음 7500 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  10. 에탄올의 모든 흔적을 제거하십시오. RNA 펠릿을 5분 동안 자연 건조합니다.
  11. 위아래로 피펫팅하여 RNase가 없는 물 10μL에 RNA를 용해시킵니다.
  12. 제조업체의 지침에 따라 Real-Time PCR을 진행합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는 미니 뇌졸중 모델 내에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포의 기능을 평가하기 위한 정교한 프로토콜을 제시합니다. 미니 뇌졸중은 우측 중대뇌동맥(MCA)의 원위 분지의 영구적인 결찰에 의해 유도되었으며, 이어서 양측 총경동맥(CCA)의 7분 폐쇄가 이어졌습니다. 이 방법론은 작고 일관된 병변 부피와 현저히 낮은 사망률을 특징으로 하는 경증의 뇌졸중을 산출합니다. 또한, 장기적인 신경면역 상호작용을 조사할 수 있는 이 모델의 능력은 뇌졸중 후 회복 과정에서 염증의 역할을 조사하는 데 매우 적합합니다.

미세아교세포에 의한 신경염증은 허혈성 뇌졸중의 병태생리학에서 중심적인 역할을 한다19. 허혈성 뇌졸중 후 미세아교세포의 동적 변화를 규명하기 위해 초기에 유세포분석을 사용하여 미세아교세포를 분리하고 Real-time PCR을 통해 순도를 확인했습니다. 그림 2...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 활용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포의 기능을 평가하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 양측 총경동맥(CCA)의 7분 폐색과 함께 우측 중대뇌동맥(MCA)의 원위 분지의 영구 결찰을 통한 국소 허혈성 뇌졸중을 확립하는 것이 포함됩니다. 이 수술적 접근법은 병변 부피가 일정하고 사망률이 낮은 경증의 뇌졸중을 유발하기 때문에 신경면역 상호작용에 대한 장기적인 조사에 적합하다14. 변형으로 인해 뇌졸중 중증도가 일관되지 않을 수 있으며, 이는 후속 면역학적 평가의 타당성을 손상시킬 수 있기 때문에 수술 단계의 정확한 실행이 필수적이다24.

여기에 설명된 기술에 대한 수정은 세포 해리 및 정제를 최적화하는 데 필요했습니다. 미세 절개된 경색된 뇌 조직에서 단일...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국국립자연과학재단(No. 82201622)과 내몽골자연과학재단(No. 2020MS03017)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 미세 원심분리기 튜브둥지 615601실험실 자료
1× PBS코 닝21-040-CM시약
96웰 투명 라운드 바닥 TC 처리 마이크로플레이트코 닝3799실험실 자료
APC 항마우스 CD19바이오레전드152410항체
APC/Cyanine7 항마우스 CD45바이오레전드103116항체
아버틴 (1.25%)난징 아이베이 생명공학 M2920시약
BD FACS아리아 IIBD642510설비
브릴리언트 바이올렛 421 항마우스 CD4바이오레전드100437항체
브릴리언트 바이올렛 605 항 마우스/인간 CD11b바이오레전드101237항체
BSA시그마-알드리치A1933-1G화학
콜라게나제 IV시그마-알드리치C4-28-100MG효소
DNase I뉴잉글랜드 바이오랩스M0303L효소
EDTA시그마-알드리치EDS-100G화학
Falcon 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관코 닝352052실험실 자료
매  15 mL 원추형 원심분리기 튜브코 닝352095실험실 자료
플로우조 V10BD소프트웨어
GLAST (ACSA-1) 항체, PE밀테니 바이오텍130-118-344항체
이소플루란RWD 생명 과학R510-22-10시약
PE/시아닌7 항마우스 CD3바이오레전드100220항체
PE/Dazzle 594 마우스 방지 NK-1.1바이오레전드156518항체
트리졸 시약써모 피셔 사이언티픽 Inc.15596026시약
UltraPure DNase/RNase-free 증류수써모 피셔 사이언티픽 Inc.10977015시약
Vetbond 티슈 접착제3분1469SB실험실 자료
좀비 아쿠아 고정 가능한 생존 가능성 키트바이오레전드423102아민 반응성 형광 염료

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
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