방법 논문

포유류 세포에서 Godanti Bhasma에 의해 유발된 식세포작용의 순차적 세포 이벤트 탐색

DOI:

10.3791/68321

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2025년 7월 11일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 포유류 세포에서 Godanti Bhasma(GB) 입자의 식세포 처리를 규명하여 세포 흡수, 액포 역학, 산성화 및 분해를 특성화합니다. 이러한 발견은 근본적인 식균작용 메커니즘에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 GB를 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 유망한 모델 시스템으로 확립했습니다.

초록

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식세포작용(phagocytosis)은 세포가 이물질, 병원균 또는 파편을 집어삼키고 분해하는 중요한 세포 메커니즘으로, 면역 방어와 조직 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. 이 과정의 중단은 다양한 질병과 관련이 있습니다. 식세포작용 경로와 관련된 복잡한 이벤트를 탐색하려면 고급 스마트 입자와 효과적인 모니터링 기술이 필수적입니다. 생체 활성 황산칼슘 입자로 구성된 인도의 전통 의학인 Godanti Bhasma(GB)는 포유류 세포에서 식균작용에 의해 빠르게 내재화되어 상당한 세포질 진공을 유도합니다. GB 유도 식세포작용의 주요 단계는 유세포분석법(FC), 생세포 이미징 및 특정 염색 기술을 사용하여 여기에서 평가되었습니다. 유세포 분석은 입자 내재화와 관련된 식세포 컵과 같은 구조의 형성을 보여주었습니다. 라이브 셀 이미징을 통해 입자 흡수, 액포 형성, 삼킨 물질의 분해 및 액포 회전을 포함한 식세포 과정을 실시간으로 관찰할 수 있었습니다. 액포 산성화를 평가하기 위해 중성 빨간색과 아크리딘 오렌지색으로 염색하는 것이 사용되었습니다. 흥미롭게도, GB 처리된 세포에서 리소좀 억제제 BFA1을 사용한 치료는 중성 적색 흡수가 부족한 것으로 입증되었듯이 진공 상태로 이어지지 않았으며, 이는 진공 형성이 발생하기 위한 산성 환경이 필요함을 강조합니다. 이러한 결과는 이 과정에 관련된 순차적인 세포 이벤트를 규명하기 위한 모델로서 GB 유도 식세포작용의 잠재력을 강조하며, 이는 숙주-병원체 상호 작용, 세포 내 이동을 이해하고 식세포작용과 관련된 장애에 대한 혁신적인 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다.

서론

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식세포작용(phagocytosis)은 대식세포(macrophage) 및 수지상 세포(dendritic cell)와 같은 조직 상주 전문 식세포(professional phagocyte)뿐만 아니라 상피 세포(epithelial cell) 및 섬유아세포(fibroblast)와 같은 비전문적 식세포(non-professional phagocyte)에 의해 수행되는 필수 세포 과정으로, 이물질을 삼키고 분해합니다. 이러한 세포는 이물질, 병원균 또는 세포 파편을 내부화하고 제거하여 면역 방어 및 조직 항상성에 크게 기여합니다1. 이 프로세스는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)2에 결합하는 TLR(Toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 병원체, 파편 또는 입자를 인식하는 것으로 시작됩니다. 이 인식은 원형질막 돌출부가 표적 입자3 주위로 확장되는 식세포 컵의 형성을 유발합니다. 액틴 필라멘트는 이 단계에서 중요한 역할을 하여 입자 흡수4에 필요한 멤브레인 리모델링을 주도합니다. 입자가 식체(phagosome)로 둘러싸여 있으면 막으로 결합된 소포(membrane-bound vesicle)가 형성됩니다. 식체는 성숙을 거치며, 초기 엔도솜, 후기 엔도솜과의 융합을 특징으로 하며, 그 후 가수분해 효소를 포함하는 리소좀의 통합이 이루어집니다5. 카텝신(cathepsin), 라이소자임(lysozyme) 및 뉴클레아제(nuclease)와 같은 이러한 효소는 액포 ATPase(V-ATPase)에 의해 달성된 식체(phagosome) 내의 산성화에 의해 활성화되어 pH를 4.5-5.5로 낮춥니다. 분해 과정은 세포에서 남은 잔여물의 엑소사이토시스(exocytosis)로 끝납니다. 이 역동적이고 복잡한 과정에서의 기능 장애는 심각한 면역 문제를 초래할 수 있습니다 6,7,8.

식세포작용의 복잡한 세포 과정을 정확하게 평가하기 위해서는 식세포작용의 주요 세포 이벤트를 모니터링하기 위한 개선되고 쉬운 방법이 필요합니다. 전통적으로 phagocytosis 정량화를 위한 모니터링 방법에는 현미경 시각화를 위해 미리 결정된 시간 간격으로 phagocyte를 고정하거나, 이미징 또는 유세포 분석을 통해 dye-labeled target의 internalization을 측정하거나, 지정된 phagocytosis 기간 후에 남아 있는 target cell의 수를 계산하는 등의 기술이 포함되지만, 이러한 방법은 phagocytosis process9 중에 발생하는 분 단위 변동을 포착하지 못합니다. 더욱이, 염료 흡수(dye uptake)와 같은 간접 지표에 의존하는 방법은 잠재적인 수동 염료 전달(passive dye transfer)로 인해 실제 식세포 현상을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다10.

최근 생세포 이미징, 유세포 분석 및 염색 기술의 발전은 높은 시공간 정밀도로 식세포작용을 모니터링할 수 있는 능력에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 생세포 이미징은 순차적 이벤트 추적11을 통해 동적 프로세스를 지속적으로 관찰할 수 있습니다. 유세포 분석법은 임상 연구에서 포유류 세포를 분석하고 바이오마커를 검출하는 데 널리 사용됩니다12. 그러나 전통적인 FC 방법은 개별 세포의 형태학적 및 공간적 특성을 평가할 수 있는 장비가 없습니다12. 이미징 유세포 분석법(IFC)은 단일 세포에서 자세한 정보를 수집할 수 있는 강력한 대안 역할을 합니다. IFC는 유세포 분석의 분석 기능과 고해상도 이미징을 결합하여 형태학적 및 공간적 세부 정보를 통한 단일 세포 분석을 가능하게 합니다. 형광 라텍스 비드(fluorescent latex beads), 자이모산-APC(zymosan-APC) 및 합성 나노입자(synthetic nanoparticles)를 포함한 다양한 입자가 식세포작용(phagocytosis)을 연구하는 데 일반적으로 사용되며, 수용체 관여(receptor engagement), 식체(phagosome) 형성 및 면역 반응에 대한 통찰력을 제공합니다12.

일반적으로 종말점 분석에 의존하는 기존의 생화학 기술과 달리, 살아있는 세포 이미징은 세포 과정에 대한 지속적이고 역동적인 모니터링을 제공합니다. 이 방법은 높은 시공간 해상도와 식세포작용에서 순차적인 이벤트를 관찰할 수 있는 기능을 제공합니다. 결과적으로, 이는 식세포작용(phagocytosis)의 복잡한 과정을 연구하기 위한 강력한 도구이며, 세포 거동 및 메커니즘에 대한 보다 정확하고 상세한 통찰력을 제공합니다13.

이미징 시스템의 발전 외에도 식세포 이벤트, 특히 식체 내에서 발생하는 분해 단계를 뚜렷하게 강조할 수 있는 스마트 식세포 입자가 필요합니다. 식세포작용 연구는 수용체 관여, 식균 형성 및 면역 반응과 같은 메커니즘을 탐구하기 위해 라텍스 비드, 자이모산, 박테리아, 자가사멸 세포 및 합성 나노 입자와 같은 입자를 활용하는 경우가 많습니다. 이러한 입자는 귀중한 통찰력을 제공하지만 완전한 분해 과정을 추적하거나 phagosome 성숙을 직접 평가하는 데는 한계가 있습니다. 예를 들어, 라텍스 비드는 생분해되지 않으며 분해를 입증할 수 없는 반면, 자이모산 및 박테리아는 종종 복잡한 표지가 필요하며 일관된 분해 프로파일을 생성하지 못할 수 있습니다14,15.

우리의 이전 연구는 주로 황산칼슘으로 구성된 전통적인 아유르베다 제형인 GB가 phagosome 성숙 및 분해를 연구하는 데 이상적인 입자로서 유용성을 보여주었습니다16. GB는 시간이 지남에 따라 식체의 산성 환경 내에서 용해되어 입자 분해를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 또한, 강력한 액포 형성을 유도하는 GB의 능력은 초기 형성에서 산성화 및 최종 해결에 이르기까지 식체체 성숙의 뚜렷한 단계에 대한 조사를 용이하게 합니다. 다른 입자와 달리 GB는 외부 라벨링의 필요성을 없애고 phagosomes의 전체 수명 주기를 연구할 수 있는 자체 유지 시스템을 제공하여 phagocytosis 및 관련 장애의 역학을 이해하는 데 이상적인 모델입니다16.

이 연구는 전문(RAW 264.7) 및 비전문(HeLa 및 3T3-L1) 식세포 세포주 모두에서 Godanti Bhasma(GB)를 사용하여 입자 유도 식세포작용 및 액포 형성을 평가하도록 설계된 표준화되고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 다양한 세포 유형에 걸쳐 세포 흡수 메커니즘, 액포 생물 발생 및 세포 내 입자 처리를 연구하기 위한 강력한 플랫폼을 제공하는 것입니다. GB는 10mg/mL의 농도로 DMEM에 현탁시켰으며, 균일성을 보장하기 위해 더 큰 입자는 침전시키는 동안 상부 분획을 실험용으로 수집했습니다. 유세포 분석 분석을 위해 12웰 플레이트에서 웰당 2 x 105 개의 세포의 밀도로 세포를 파종하고 각 웰에 300μL의 GB 작업 현탁액을 첨가했습니다. 이미징 기반 분석을 위해 96웰 플레이트 또는 챔버 슬라이드에 웰당 5,000-10,000개의 세포를 파종했습니다. 이 방법은 GB를 다양한 세포 유형에서 액포 형성 및 입자 내재화를 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델로 확립합니다.

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프로토콜

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1. 세포 배양 및 파종

  1. 10% 열 비활성화 FBS 및 항생제(100μg/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 완전한 DMEM 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 모든 시약과 장비를 소독하십시오.
  2. DMEM을 사용하여 25cm2 플라스크 및 35mm 배양 접시에서 3T3-L1, HeLa 및 RAW 264.7 세포를 배양합니다. 5% CO2 가 포함된 가습 인큐베이터에서 배양물을 37°C로 유지하고 48시간마다 배지를 교체합니다.
  3. 계대배양을 위해 PBS로 세포를 2x 세척한 다음 500μL의 Trypsin-EDTA를 사용하여 부착 세포를 분리하고 5분 동안 배양합니다. Trypsin-EDTA 용액을 중화하기 위해 DMEM 1mL를 추가하고, 피펫을 추가하여 단일 세포 현탁액을 생성하고, 새로운 DMEM으로 부피를 10mL로 조정합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고 펠릿을 1mL의 새 배지에 재현탁합니다.
  4. 10μL의 세포 현탁액과 0.4% 트리판 블루(1:1)를 혼합하고, 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수하고, 밀도를 Cells/mL = Avg. count x 104 x 2로 계산합니다.
  5. 96웰 플레이트의 경우: 100μL의 세포 현탁액(10,000개 세포 포함)을 각 웰에 분배합니다. 캐비티 슬라이드의 경우 세포 현탁액(5000개 세포 포함)의 50μL를 두 개의 캐비티에 시딩하고 중간 캐비티는 비워 둡니다. 시딩된 각 캐비티에 50μL의 DMEM을 추가합니다.
  6. 플레이트와 슬라이드를 37°C에서 5% CO2 에서 24시간 동안 배양하여 세포 부착 및 안정화를 허용합니다. 실험을 진행하기 전에 20배 배율의 도립 현미경으로 세포를 검사하여 형태, 밀도 및 오염을 평가합니다.

2. 세포 배양을 위한 GB 원액/칵테일 준비

  1. GB를 조달하고 분말 100mg의 무게를 정확하게 측정하십시오. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 10mL에 분말을 현탁시킵니다.
  2. 현탁액을 소용돌이치고 더 큰 입자가 가라앉을 수 있도록 1분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 현탁액의 상단 5mL를 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  3. 이 5mL 준비된 GB 현탁액을 후속 세포 배양 실험을 위한 원액으로 지정합니다. 현탁액을 세포에 첨가하기 전에 입자의 균일한 분산을 보장하기 위해 현탁액을 철저히 소용돌이치십시오.

3. 유세포 분석

  1. 트립신화로 RAW 264.7, HeLa 또는 3T3-L1 세포를 수확하고, 완전한 DMEM으로 중화하고, 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 1mL의 신선한 배지에 재현탁하고, 10μL와 0.4% 트리판 블루(1:1)를 혼합하고, 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수하고, 밀도를 계산하고, 2 x 105 cells/mL로 조정합니다.
  2. 12웰 플레이트에 웰당 2 x 105 개의 세포를 파종하고 24시간 동안 배양합니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 배양하십시오.
  3. GB 현탁액(웰당 300μL)으로 30분, 1시간 및 12시간의 다양한 기간 동안 세포를 처리합니다. 처리 후 PBS로 세포를 5배 세척하여 과도한 입자를 제거합니다.
  4. 1.3단계와 같이 세포를 트립신화하고 PBS로 철저히 세척합니다. 준비된 현탁액을 유세포 분석기의 샘플 포트에 로드합니다. 소프트웨어를 실행하고 적절한 획득 설정을 선택합니다. 이미징을 위해 명시야 모드를 선택합니다.
  5. 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 시스템이 플로우 셀을 통과하는 개별 세포의 이미지를 캡처할 때 최소 10,000개의 이벤트에 대한 데이터를 수집합니다.
  6. 면적 대 종횡비 산점도를 사용하여 온전한 단일 세포를 게이트할 수 있습니다. 이렇게 하면 doublet과 clusters를 제외하는 데 도움이 됩니다. 이미지 라이브러리에서 해당 이미지를 봅니다. 소프트웨어 이미지 라이브러리에서 개별 세포 이미지를 수집하여 치료로 인한 형태학적 변화를 연구합니다.
  7. 입자 분석의 경우 12웰 플레이트에 웰당 2 x 105 개의 세포를 시딩하고 24시간 동안 배양합니다. 세포를 GB 현탁액(웰당 300μL)으로 1시간, 7시간, 14시간 및 24시간 동안 다양한 기간 동안 처리합니다.
  8. 처리 후 배양 플레이트를 1분 동안 부드럽게 흔든 후 배양 배지를 1.5mL 튜브에 모읍니다. PBS로 세포를 5회 세척하여 세포 외 입자를 제거합니다.
  9. 500μL의 RIPA 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트)을 추가하여 세포를 완전히 용해시킵니다.
  10. 입자가 포함된 배양 배지와 용해된 세포 샘플을 유세포 분석기를 통해 별도로 실행합니다. 샘플을 시스템의 샘플 포트에 로드합니다. 소프트웨어를 실행하고 적절한 획득 설정을 선택합니다. 입자 분석을 위해 명시야 모드를 선택합니다.
  11. 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 시스템이 플로우 셀을 통과하는 개별 입자의 이미지를 캡처할 때 최소 20,000개의 이벤트에 대한 데이터를 수집합니다.
  12. 면적 대 종횡비 산점도를 사용하여 모든 입자를 게이트합니다. 산점도 도구를 사용하여 입자 수를 분석할 수 있습니다.

4. 타임랩스 현미경 검사

  1. 35mm 접시에 3T3-L1 세포(3.0 x 104)를 2mL의 DMEM과 함께 37°C에서 5% CO2 에 70% 포화도에 도달할 때까지 배양합니다.
  2. 300μL의 GB 현탁액을 예열된 새로운 2mL 배양 배지에 완전히 혼합한 다음 세포 및 GB와 함께 배양 접시를 이미징 현미경 스테이지에 놓습니다.
  3. 10x 대물렌즈를 선택합니다. Bright 버튼을 사용하여 명시야 조명을 켭니다. 영화 버튼을 클릭하여 타임랩스 모드로 들어갑니다. 간격 시간을 5분으로 설정합니다. Rec 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다.
  4. 16시간에서 24시간 동안 5분 간격으로 이미지를 캡처하여 CO2 인큐베이터에서 표준 조건에서 지속적인 이미징을 보장합니다.
  5. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 캡처된 이미지를 타임랩스 비디오로 컴파일합니다. 이 기술은 내부화에서 입자의 완전한 분해에 이르기까지 식세포작용의 다양한 단계를 구별할 수 있습니다.

5. 중성 적색 염색

  1. 96웰 플레이트와 캐비티 슬라이드에서 24시간 동안 세포를 성장한 후 GB 입자 현탁액을 철저히 혼합하고 각 웰 또는 캐비티에 현탁액 30μL를 추가합니다.
  2. 액포 형성을 유도하기 위해 24 시간 동안 5 % CO2 와 함께 37 ° C에서 배양하십시오. 처리되지 않은 우물 또는 공동을 음성 대조군으로 사용하십시오.
  3. 중적색(NR) 염색의 경우 무혈청 DMEM에서 0.5mg/mL NR 용액을 준비하고 0.2μm 필터를 통해 여과합니다.
  4. 96웰 플레이트 및 캐비티 슬라이드의 액포 이미징: 배지를 제거하고 60μL의 NR 염료를 첨가한 다음 37°C에서 15분 동안 배양합니다. PBS로 3x 세척하여 과도한 염료를 제거한 다음 현미경 이미징을 진행합니다.
  5. 20x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 액포를 검사하여 액포의 크기, 형태 및 액포 수를 평가합니다.

6. 액포 형성 및 산성화 억제를 위한 Bafilomycin A1 치료

  1. 100μg의 BFA를 50μL의 DMSO에 용해시킨 후 950μL의 DMEM에 희석하여 100μg/mL(160.5nM) 농도의 Bafilomycin A1(BFA1)의 원액을 준비합니다. 이 스톡 1μL를 1.6mL의 DMEM에 희석하여 0.1nM의 작업 용액을 얻습니다.
  2. 완전히 혼합하고 100μL의 작동 BFA 용액을 96웰 플레이트의 세포가 포함된 웰에 추가합니다. 또한 30μL의 GB 입자 현탁액을 추가하여 액포 및 식체 형성 억제를 평가합니다.
  3. 식체(phagosome) 산성화를 억제하려면 100μL의 작동 BFA 용액을 미리 형성된 액포(이전에는 GB 입자로 처리)가 있는 웰에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 모든 웰을 24 시간 동안 배양합니다.
  4. 각 웰에 60μL의 중적색(NR) 염료를 첨가하고 추가로 15분 동안 배양한 다음 액포 형성 및 산성화를 분석합니다.

7. 아크리딘 오렌지(AO) 염색

  1. 캐비티 슬라이드에서 배양된 세포를 50μL의 GB로 처리하고 표준 실험 조건에서 밤새 배양합니다.
  2. 처리 후 37°C에서 15분 동안 아크리딘 오렌지 용액(1mg/mL)으로 세포를 배양하여 액포 및 산성 소포 소기관의 선택적 염색을 가능하게 합니다.
  3. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 3회 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거하고 배경 형광을 최소화합니다.
  4. 20x 대물렌즈와 450-492nm의 청색 여기 필터 범위가 장착된 형광 현미경으로 슬라이드를 빠르게 분석하여 세포 형태와 아크리딘 오렌지 흡수를 평가하여 액포 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

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결과

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이 연구는 포유류 세포의 GB 입자에 대한 주요 세포 반응을 강조합니다. 이미징 유세포 분석기를 사용하여 3T3-L1 세포에서 GB 입자의 내부화를 조사했습니다(그림 1). 세포는 30분에서 12시간 사이의 시간 동안 입자에 노출되었습니다. 30분 후, 세포 표면의 입자를 관찰하고(그림 1B), 부착 부위에서 세포막이 안쪽으로 접히기 시작했는데, 이는 내재화가 시작되었음을 나타냅니다(그림 1C). 부착 부위 주위에 형성된 식세포 컵으로 보이는 원형 막 확장(그림 1C). 결국, 입자는 더 큰 막으로 둘러싸인 액포 내부에서 발견되어 역동적인 액포 과정을 보여주었습니다(그림 1D).

이전 연구에서 MTT 분석 결과는 0...

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토론

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식세포작용(phagocytosis)은 중요한 면역 방어 기전으로 작용하여 입자, 병원균 및 세포사멸 세포를 삼키고 제거할 수 있습니다. 식체형성 및 성숙 과정을 이해하기 위해서는 고급 이미징 기술과 결합된 스마트 생체 적합성 입자가 액포 진행, 산성화 및 삼킨 물질의 분해와 같은 동적 이벤트를 연구하는 데 필수적입니다18,19. 우리는 phagocytosis 분석 시스템을 위해 생체 적합성 모델 입자인 GB를 사용했습니다. 주사 전자 현미경 (SEM) 분석은 GB 입자가 0.5에서 5 μm 범위의 이종 크기 분포를 나타내는 것으로 나타났습니다16. 이러한 변동성을 줄이기 위해 더 큰 입자가 침전되도록 하여 현탁액을 표준화했으며 모든 후속 실험에는 상위 분획만 사용되었습니다. 이 방법은 입자 크기의 균일성을 보장하고 세포 흡...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 인도 정부 과학기술부의 과학 및 공학 연구 위원회(SERB) 핵심 연구 보조금(CRG/2022/009045)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25 cm2 배양 플라스크NEST, 인도707001
96웰 및 6웰 플레이트Tarsons India Pvt. Ltd., 인도 콜카타; Thermo Scientific, 인도980040; 140675
아크리딘 오렌지SRL, 인도82407
항생제 및 트립신-EDTA 용액High Media, 인도628242; 655111
세포주 - HeLa, 3T3-L1 및 RAW-264.7국립 세포 과학 센터(NCCS), 푸네, 마하라스트라
배양 접시(35mm) SPL Lifesciences, 인도101350
덜베코' 변형 이글 배지(DMEM)MP Biomedicles, 인도1033126
소 태아 혈청(FBS)High Media, 인도651257
유세포 분석기Millipore, 미국양막Amnis 이미징 유세포 분석기,
형광 현미경DiGi Lab, 인도모델: DiGi 110 Infinity
고단티 바스마파탄잘리 아유르베드240002
중성 적색 염료CDH, 인도593630
타임랩스 현미경나노엔텍(주)  한국 서울.줄리JuLi 스마트 형광 세포 분석기,
타임랩스 현미경리즈 마이크로 IMA. 영국S.No. LIM225552358A58EA PRIME 도립 현미경

참고문헌

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