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방법 논문

RNA-seq는 방사선 유도 뇌 손상의 메커니즘으로 Th17 세포 분화 경로를 밝힙니다.

561 조회수

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DOI:

10.3791/68322

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2025년 6월 20일

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1Beijing Institute of Radiation Medicine

이 논문에서

요약

이 연구는 방사선 유발 뇌 손상이 있는 마우스에서 Th17 세포 분화 경로의 활성화를 조사하는 것을 목표로 합니다.

초록

방사선 요법은 두경부 악성 종양에 대한 널리 보급된 치료 방식입니다. 그러나 이는 항상 방사선으로 인한 정상 대뇌 조직 손상을 초래하여 방사선 유발 뇌 손상(RBI)으로 치이게 됩니다. 방사선 유발 신경염증에 대한 광범위한 연구에도 불구하고 RBI와 Th17 세포 분화 경로 간의 연관성은 여전히 충분히 이해되지 않고 있습니다. C57BL/6 마우스는 RBI 모델을 개발하기 위해 30 Gy 두개골 방사선 조사를 한 번 실시했습니다. 인지 기능은 Morris water maze(MWM), open field test, novel object recognition test 및 rotarod test를 통해 평가되었습니다. 뇌 조직의 조직병리학적 변화는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 분석되었습니다. 미세아교세포(IBA-1) 및 성상세포(GFAP)의 활성화를 평가하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다. RNA 염기서열분석은 차등적으로 발현된 유전자를 확인하기 위해 수행되었으며, Simple Western 및 qPCR은 Th17 세포 분화에 관여하는 주요 신호 분자를 검사하는 데 사용되었습니다. RBI 마우스는 특히 공간 학습과 기억 유지에서 현저한 인지 결함을 보였다. 조직학적 검사는 방사선 조사된 마우스의 피질과 해마 내에서 미세아교세포와 성상세포의 활성화를 나타냈습니다. RNA 염기서열분석 분석은 RBI 그룹의 피질에서 Th17 세포 분화 경로의 상당한 농축을 확인했습니다. Simple Western 및 qPCR 분석을 통한 추가 검증을 통해 RBI 마우스의 피질에서 TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 및 P-STAT3 의 상향 조절을 확인했습니다. 이러한 발견은 Th17 세포 분화 경로가 방사선 유발 뇌 손상의 발병기전에 중추적인 역할을 했음을 시사합니다. Th17 세포에 의해 매개되는 신경염증은 방사선 유발 인지 기능 장애의 기저에 있는 중요한 메커니즘일 수 있습니다.

서론

방사선 요법은 원발성 두경부 종양과 전이성 두경부 종양 모두에 중요한 치료법이지만, 방사선 유발 뇌 손상(RBI)은 중추 신경계 손상을 특징으로 하는 심각한 합병증으로 발생할 수 있습니다. RBI 발병률은 종양 유형과 치료 방식에 따라 다르며, 수막종1에 대한 정위 방사선 요법 후 28%-50%, 비인두 암종의 경우 1.9%-5% 2,3, 저등급 신경교종의 경우 1%-24% 4,5, 뇌 전이의 경우 8%-20% 6,7. RBI는 급성, 조기 지연, 후기 지연 유형으로 분류되며, 인지 기능 장애, 특히 기억 장애, 학습 결핍이 늦은 지연 형태로 두드러집니다. 두경부암의 장기 생존자의 50%-90%에 영향을 미치는 방사선 유발 인지 기능 장애(RICD)는 삶의 질에 상당한 영향을 미치지만8 이 병의 발병기전은 여전히 잘 알려져 있지 않으며 효과적인 예방 및 치료 전략이 부족하다.

신경염증은 RBI의 주요 병리학적 특징으로, 혈액뇌장벽 파괴를 악화시키고 해마의 신경 발생을 방해합니다. 전염증성 사이토카인 IL-179를 생산하는 것으로 알려진 CD4+ T 세포의 하위 집합인 Th17 세포는 다발성 경화증 및 파킨슨병을 포함한 다양한 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다10,11. 이러한 세포는 특정 염증 상태에서 혈액뇌장벽을 통과하여 신경염증을 유발할 수 있다12. 2005년 발견 이후, Th17 세포는 병원체에 대한 면역 반응과 염증성 질환에 대한 관여 모두에서 역할을 하는 것으로 주목을 받았으며, RBI 및 관련 인지 기능 장애의 메커니즘을 연구하기 위한 잠재적인 표적이 되었습니다13.

이 연구에서는 수컷 쥐만 사용되었습니다. 여성을 제외하는 것은 프로게스테론 수치가 주기의 여러 단계에 걸쳐 최대 10배까지 변할 수 있기 때문에 발정 주기와 관련된 신경염증 변동으로 인해 발생할 수 있는 잠재적인 교란 효과를 피하기 위한 것입니다14. 또한, 본 연구의 실험 모델은 환자의 약 72%가 남성인 두경부암 방사선 치료의 임상적 맥락을 반영하도록 설계되었다15. 이와 일관되게 방사선 유발 뇌 손상(RBI)의 기전을 조사한 발표된 대부분의 연구는 수컷 설치류를 활용하여 기준선 병리학적 특징을 확립했습니다16.

RBI를 연구하기 위해 다양한 모델이 사용되었지만, 조직병리학적 염색 및 단순한 웨스턴 블로팅 페이스와 같은 전통적인 방법론은 감도, 처리량 및 정확도 측면에서 한계를 가지고 있습니다17. RNA 염기서열분석(RNA-Seq) 및 고처리량 단백질체학(high-throughput proteomics)과 같은 최근의 발전은 RBI18의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 보다 강력한 통찰력을 제공했습니다. 이러한 기술을 통해 유전자 발현 변화 및 단백질 변형을 포괄적으로 이해할 수 있어 이전 방법보다 더 정확한 데이터를 제공할 수 있습니다19. 특히 Simple Western은 모세관 전기영동과 화학발광을 통한 단백질 검출의 장점을 결합한 새롭고 자동화된 기법으로, 최소한의 시료량과 향상된 재현성으로 고처리량 분석을 용이하게 합니다20. 기존의 웨스턴 블로팅과 비교했을 때, Simple Western은 멤브레인 전달의 필요성을 없애고 정량적 단백질 발현 데이터를 제공하여 특히 저농도 단백질 검출에서 감도와 재현성 측면에서 여러 가지 이점을 제공합니다21,22.

RNA 추출 및 준비에 대한 실용적인 지침은 고품질 염기서열분석 및 정량화의 성공에 매우 중요합니다. 최적의 RNA 추출을 위해 고품질 RNA 분리 키트를 사용하고 농도가 100-1000ng/μL 범위 내에 있고 RNA 무결성 수(RIN)가 7.0 이상으로 유지되어 분해를 방지하는 것이 좋습니다. Simple Western을 사용하여 단백질 분석을 수행할 때 단백질 샘플이 모세관당 약 1-5μg의 농도로 적절하게 변성 및 로드되었는지 확인하는 것이 중요합니다. qPCR 검증을 위해 최소 1μg의 RNA에서 합성된 고품질 cDNA를 사용하여 일관된 역전사 조건을 보장합니다. 게놈 DNA 오염 또는 RNA 분해와 같은 RNA 준비의 일반적인 위험은 RNAse-free 장비를 사용하고 RNA 분해를 방지하기 위해 즉시 상 분리를 수행하여 피해야 합니다.

본 연구는 이러한 방법을 접목하여 RBI의 쥐 모델에서 Th17 세포 분화 경로가 활성화되는지, 그리고 이것이 방사선 유발 인지 기능 장애의 발병에 어떻게 기여하는지 조사하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

여기에서 수행되는 실험 절차는 ARRIVE 지침(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)을 엄격히 준수합니다. Beijing Institute of Radiation Medicine의 Institutional Animal Care and Use Committee(승인 번호)로부터 승인을 받았습니다. AF/SC-08/02; 날짜: 2024년 2월 25일).

1. 마우스 두개골 방사선 조사

  1. 연구에서 6-8주 된 총 10마리의 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하여 5마리의 동물을 RBI 그룹에 할당하고 5마리를 대조군에 할당했으며, 대조군은 RBI를 받지 않은 빈 대조군 마우스로 구성됩니다. 조절된 온도, 습도 및 12시간의 명암 주기를 포함하여 통제된 환경 조건에서 마우스를 유지합니다. 실험을 시작하기 전에 1주일 동안 쥐를 적응시킵니다.
  2. 체중 50mg/kg에서 1% 펜토바르비탈 나트륨의 복강내 주사를 사용하여 동물을 마취합니다. 단단한 발 꼬집기에 대한 반사 반응이 없는지 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 각막 건조를 방지하기 위해 마취 시작 직후 양쪽 눈에 수의학 안과 연고를 바르십시오.
  3. 전용 목재 구속 장치를 사용하여 동물을 엎드린 방향으로 배치하고 3mm 두께의 납(Pb) 차폐판(순도 99.9%)으로 신체의 비표적 부위를 덮어 국소 방사선 조사를 보장합니다.
  4. 2 x 2cm2 조사 필드를 고유한 여과(1.5mm Al + 0.25mm Cu)로 시준합니다. 통합 레이저 십자선(λ = 635nm ± 0.5mm 정확도)으로 필드를 두개골 정중선에 정렬하고 통합 CMOS 카메라 시스템과 IR 백라이트로 실시간 위치를 확인합니다. 320 kVp/12.5 mA, SSD = 50 cm 매개변수로 X-RAD 320 시스템을 사용하여 1.325 Gy/분의 속도로 30 Gy X-ray 선량으로 두개골 부위를 조사합니다.
  5. isocenter에 위치한 추적 가능한 이온화 챔버를 사용하여 매주 선량 보정을 수행합니다. 3.2mm Cu HVL 여과를 통해 빔 매개변수를 320kVp/12.5mA로 유지하여 1.325Gy/min(± 3% 변동)의 선량률을 달성합니다. Gafchromic EBT3 필름을 사용하여 매일 빔 균일성을 확인합니다(필드 내 > 95%).
  6. 수술 후 통증을 관리하기 위해 3일 동안 하루에 한 번 meloxicam(1-2mg/kg, 피하)을 투여합니다. 동물을 예열된 회복실에 넣고 완전한 의식을 회복하고 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 때까지 지속적으로 모니터링합니다. 회복 기간 동안 동물을 방치하지 마십시오.
  7. 연구 기간 동안 매주 모든 마우스의 체중을 기록하십시오. 순응 1주일과 방사선 조사 후 3주를 포함하여 총 4주 동안 마우스를 관찰합니다.

2. 동물 행동 분석

  1. RBI 3주 후에 행동 실험을 수행합니다.
  2. 모리스 물 미로
    1. 분유를 사용하여 원형 수영장(직경: 120cm, 높이: 50cm)에 불투명한 물(20-22°C)을 채워 물에 잠긴 플랫폼을 가립니다. 고정된 사분면에 수면 아래 1cm 떨어진 숨겨진 플랫폼(직경: 10cm)을 놓습니다.
    2. 시험 전에 최소 30분 동안 마우스를 시험장에 적응시킵니다. 각 마우스를 4개의 의사 무작위로 선택된 시작점(N, S, E, W) 중 하나에서 물 속으로 넣어 훈련 단계를 시작합니다.
    3. 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 마우스가 최대 60초 동안 수영할 수 있도록 합니다. 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 플랫폼으로 안내하고 15초 동안 그대로 두십시오.
    4. 15분의 시험 간 간격으로 마우스 한 마리당 하루에 4번의 시험을 수행합니다. 저체온증을 예방하기 위해 시험 사이에 따뜻한 수건으로 각 마우스를 완전히 말리십시오. 학습 습득을 평가하기 위해 5일 연속으로 교육을 계속합니다.
    5. 프로브 시험 당일에는 플랫폼을 제거하고 마우스가 60초 동안 자유롭게 수영할 수 있도록 합니다. 목표 사분면에서 보낸 시간, 플랫폼 횡단 및 수영 경로와 같은 매개변수를 기록합니다.
    6. 자동화된 비디오 추적 시스템을 사용하여 실험자가 그룹 할당에 눈이 멀어 모든 임상시험을 추적하고 분석합니다.
  3. 오픈 필드 테스트
    1. 실험 전 최소 30분 동안 마우스를 실험실에 적응시킵니다. 불투명 플라스틱으로 만든 개방 필드 장치(50cm x 50cm x 40cm)를 사용하십시오. 강한 그림자를 피하고 스트레스를 최소화하기 위해 경기장을 균일하게(일반적으로 25-30lux) 조명합니다.
    2. 냄새 신호를 제거하기 위해 각 동물을 테스트하기 전에 70% 에탄올로 경기장을 청소하십시오. 열린 필드의 중앙에 마우스를 부드럽게 놓고 테스트를 시작합니다. 마우스가 10분 동안 경기장을 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
    3. 자동 추적 시스템을 사용하여 운동 활동과 위치를 기록합니다. 중앙 영역을 전체 영역의 내부 20%-25%로 정의합니다. 중앙 구역에서 보낸 시간과 총 이동 거리를 측정합니다.
    4. 세션이 끝나면 마우스를 홈 케이지로 되돌리고 장치를 철저히 청소하십시오.
  4. 새로운 물체 인식 테스트
    1. 실험 전 최소 30분 동안 마우스를 실험실에 적응시킵니다. 균일한 조명(50-50lux)이 있는 야외 경기장(50cm x 50cm x 40cm)을 사용하십시오. 후각 신호를 제거하기 위해 동물 사이에 70% 에탄올로 경기장을 철저히 청소하십시오.
    2. 각 마우스를 빈 경기장에 놓고 10분 동안 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다. 이 단계에서는 물건을 놓지 마십시오.
    3. 24시간 후 두 개의 동일한 개체(A 및 A')를 경기장의 반대쪽 모서리(벽에서 최소 8cm)에 놓습니다. 마우스를 경기장 중앙에 부드럽게 놓고 10분 동안 탐색하도록 합니다.
    4. 자동화된 비디오 시스템을 사용하여 개체 상호 작용을 기록합니다. 객체 탐색은 마우스의 주둥이가 객체를 향하고 있는 동안 객체로부터 2cm 이내에 있는 것으로 정의합니다.
    5. 시험이 끝나면 마우스를 홈 케이지로 되돌리고 경기장과 물체를 청소하십시오.
    6. 1시간의 유지 간격 후 익숙한 물체(A) 하나와 새로운 물체(B) 하나를 같은 위치에 놓습니다. 마우스를 경기장으로 되돌리고 5분 동안 탐색하도록 합니다.
    7. 이전과 동일한 기준을 사용하여 각 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 기록합니다. 인식 지수를 다음과 같이 계산합니다.
      인식 지수(%) = [소설 물체에 대한 시간 / (소설 물체에 대한 시간 + 친숙한 물체)] x 100
  5. 로타로드 테스트
    1. 테스트 전 최소 30분 동안 마우스를 실험실에 적응시킵니다. 막대 직경이 ~3cm이고 받침대 위로 높이가 ~30cm인 전동 회전 장치를 사용하십시오.
    2. 회전 모드를 가속 속도(4분 동안 40rpm에서 5rpm으로)로 설정합니다. 각 마우스를 배치하기 전에 70% 에탄올로 막대 표면을 청소하십시오.
    3. 마우스를 회전하는 막대의 중앙에 앞을 향하도록 부드럽게 놓습니다. 회전을 시작하고 즉시 타이밍을 시작하십시오.
    4. 시스템에 의해 자동으로 떨어지는 대기 시간을 기록합니다. 넘어질 때 부상을 방지하기 위해 마우스를 안전하게 잡으십시오. 피로를 방지하기 위해 시도 사이에 최소 15분의 휴식 시간을 허용합니다.
    5. 마우스당 하루에 3회 연속 시험을 수행하고 최종 결과로 대기 시간을 평균화합니다. 모든 테스트가 일관된 조건에서 맹검 실험자에 의해 수행되는지 확인합니다. 테스트 후 마우스를 가정용 케이지로 되돌리고 장치를 철저히 소독하십시오.

3. 동물 안락사 및 샘플 준비

  1. RBI 후 5주 후에 조직 샘플을 수집합니다.
  2. 펜토바르비탈나트륨(100mg/kg)과 멸균 주사기를 준비합니다. 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사합니다. 마우스가 호흡을 멈추고 심장 박동이 멈출 때까지 기다렸다가 죽음을 확인합니다.
  3. 후두 접합부에서 빠르게 목을 베고 가는 가위를 사용하여 두개골 봉합사를 침체적으로 절개한 다음, 신경 연결을 끊기 전에 수막의 무결성을 보존하면서 구부러진 집게로 양측 두개골 플랩을 조심스럽게 들어 올립니다.
  4. 멸균 면도날을 사용하여 시상 이등분을 위해 60초 이내에 온전한 뇌를 미리 냉각된 매트릭스로 옮깁니다. 정밀 기기로 전후 치수(8.2 ± 0.3mm), 중간 너비(4.5 ± 0.2mm) 및 조직 질량(112 ± 8mg)을 즉시 기록합니다.
  5. 얼음 위에서 피질과 해마 조직을 해부합니다. RNA 염기서열분석, qPCR 및 Simple Western을 위해 좌반구를 액체 질소에서 급속 동결합니다.
  6. 조직학을 위해 4% 파라포름알데히드(PFA)에 오른쪽 반구를 고정합니다. 고정된 뇌를 70%에서 100%까지 등급이 매겨진 에탄올로 탈수하고 각 단계는 30분 동안 지속됩니다.
  7. 2시간 동안 자일렌으로 뇌를 맑게 합니다. 용융된 파라핀을 60°C에서 4시간 동안 조직에 침투시킵니다. 제거된 뇌를 파라핀 블록에 삽입하고 실온에서 응고시킵니다. 마이크로톰을 사용하여 5μm 두께의 관상 절편을 절단합니다.

4. Hematoxylin와 eosin 염색

  1. 슬라이드를 자일렌에 5분, 3회 담궈 조직 절편을 분리합니다. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈(100%, 95%, 70% 및 증류수)를 통해 각 섹션을 각각 5분 동안 재수화합니다.
  2. 원하는 염색 강도에 따라 Hematoxylin으로 섹션을 5분 동안 염색합니다. 흐르는 수돗물에 섹션을 5분 동안 헹구어 과도한 헤마톡실린을 제거합니다.
  3. 원하는 대비를 얻기 위해 몇 초 동안 에탄올에 1% 염산의 단면을 구별합니다. 흐르는 수돗물에 5분 동안 다시 헹굽니다. Eosin으로 섹션을 1분 동안 염색합니다.
  4. 증류수로 섹션을 잠시 헹굽니다. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈(70%, 95%, 100%)를 통해 각 섹션을 각각 5분 동안 탈수합니다.
  5. 크실렌의 단면을 5분, 3회 동안 지웁니다. 장착 매체를 사용하여 커버슬립으로 섹션을 장착합니다. 20x 대물렌즈가 장착된 Nikon Eclipse Ni-U 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.

5. 면역형광

  1. 실온에서 15분 동안 슬라이드를 4% PFA에 담가 조직을 고정합니다. 과도한 PFA를 제거하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)로 슬라이드를 5분, 3회 세척합니다.
  2. PBS에 0.3% Triton X-100을 함유한 슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양하여 조직을 투과시킵니다. 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 5% 일반 혈청으로 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
  3. 항체 사양에 따라 1:2000 희석으로 차단 버퍼에 희석한 IBA-1 및 GFAP를 사용하여 하룻밤 동안 4°C에서 배양합니다. PBS에서 슬라이드를 5분, 3회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다.
  4. Alexa Fluor 488에 접합된 Goat Anti-Rabbit IgG 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 어두운 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS에서 슬라이드를 5분, 3회 세척하여 과도한 2차 항체를 제거합니다.
  5. DAPI가 포함된 페이드 방지 장착 매체로 슬라이드를 장착합니다. 투명한 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
  6. 20x 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 형광 이미지를 캡처합니다.
  7. ImageJ를 사용하여 형광 강도를 정량화합니다. 크기 임계값이 50-200 μm2 (microglia) 및 100-500 μm2 (astrocyte)인 ImageJ의 Analyze Particles 도구를 사용하여 정량 분석을 수행합니다. 롤링 볼(Rolling Ball) 알고리즘을 사용하여 배경을 뺍니다(반경 = 50픽셀).

6. qPCR 분석

  1. RNA 추출 키트를 사용하여 조직에서 총 RNA를 추출합니다. 균질화, 용해 및 RNA 정제에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
  2. 분광 광도계를 사용하여 추출된 RNA를 정량화하여 농도를 측정하고 순도(A260/A280 비율)를 평가합니다. RNA 농도가 cDNA 합성(100-500ng/μL)에 적합한지 확인합니다.
  3. 바이오분석기를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. RNA가 분해되지 않고(18S 및 28S rRNA의 날카로운 띠) RNA 무결성 수(RIN)가 7 이상인지 확인합니다.
  4. 1μg의 RNA, 역전사 완충액, oligo-dT, dNTP, RNase 억제제 및 역전사효소와 20μL 반응 혼합물을 준비합니다.
  5. cDNA를 합성하기 위해 42°C에서 60분 동안 배양합니다. 85°C에서 5분 동안 가열하여 역전사효소를 비활성화합니다.
  6. cDNA, 마스터 믹스, 순방향 프라이머, 역방향 프라이머(표 1) 및 뉴클레아제가 없는 물을 96웰 PCR 플레이트에 결합합니다. 20 μL 반응당 2 μL의 cDNA를 사용하고 200 nM의 최종 프라이머 농도를 보장합니다. 증발을 방지하기 위해 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
유전자프라이머 시퀀스(5'-3', 정방향/역방향)
재질 보기 TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
재질 보기 TGF-β3GGACTTCGGCC카카아가
태그
일리노이 -6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
로어레이TCCACTACGGGGT탓카트
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
일리노이-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
카가아트그ccctggttttttggt
갭디(GAPDH)아그가트그트
GGGGTCGTTGATGGCAACA

표 1: qPCR 염기서열 프라이머.

  1. 반응 플레이트를 Real-Time PCR 기기에 놓고 열 순환기를 프로그래밍합니다. 다음 사이클링 조건을 사용하십시오: 95°C에서 3분 동안 초기 변성 후 15초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 40회 사이클.
  2. 표적 유전자의 발현을 GAPDH로 정규화합니다. ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 발현 수준을 계산하고 데이터를 통제 그룹과 비교하여 접힘 변화로 표시합니다.

7. RNA 염기서열분석

  1. 제도적 동물 관리 프로토콜에 따라 마우스를 마취하고 안락사시킵니다. 순환하는 혈액을 제거하기 위해 즉시 차가운 PBS로 관류하십시오.
  2. 얼음 위에서 뇌를 해부합니다. 멸균 해부 도구를 사용하여 대뇌 피질을 분리하십시오. RNA 무결성을 보존하기 위해 해부 시간을 최소화합니다.
  3. 피질 조직을 액체 질소로 급속 동결합니다. RNA 추출을 즉시 수행하지 않는 경우 -80 °C에서 보관하십시오.
  4. 눈에 보이는 단편이 남지 않을 때까지 전동 균질기를 사용하여 1mL의 RNA 추출 시약에서 동결된 피질(30-50mg)을 균질화합니다.
  5. 클로로포름 상 분리를 수행합니다. 클로로포름 200μL를 넣고 15초 동안 세게 흔든 다음 실온에서 2-3분 동안 배양한 다음 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리합니다.
  6. 상층을 새 튜브로 옮기고 동일한 부피의 70% 에탄올을 첨가한 후 실리카 컬럼 기반 키트를 사용하여 RNA 정제를 진행합니다.
  7. 온-컬럼 DNase 분해를 사용하여 RNA 정제 중에 게놈 DNA를 제거합니다. 30-50 μL에서 총 RNA를 수집하고 즉시 사용할 수 있도록 얼음에 보관하십시오.
  8. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 정량화합니다. A260/A280 비율이 ~2.0인지 확인합니다. Bioanalyzer에서 1μL의 RNA를 분석합니다. 시퀀싱을 위해 RIN이 8.0보다 큰지 확인합니다.
  9. poly(A) 선택 프로토콜과 stranded library prep kit를 사용합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 300-400bp 라이브러리를 생성합니다. 상업용 키트로 라이브러리를 정화하십시오.
  10. Bioanalyzer를 사용하여 단편 크기를 확인하고 풀 라이브러리로 등몰로 정량화합니다. Illumina 플랫폼을 사용하여 paired-end 염기서열분석(2x, 150bp)을 수행합니다.
  11. Trim Galore를 사용하여 어댑터를 트리밍하고, FastQC로 품질을 평가하고, STAR를 사용하여 마우스 게놈(GRCm39)에 대한 리드를 정렬하고, featureCounts를 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. DESeq2를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자를 식별합니다.
  12. DESeq2의 출력을 사용하여 유의하게 다르게 발현된 유전자 DEG(조정된 p-값 0.05 및 |log2FC| > 1<)를 필터링합니다. 초기하 검정을 기반으로 Phyper를 사용하여 GO 및 KEGG 경로 농축 분석을 수행합니다. 수정된 P 값이 0.05≤ 통계적으로 유의한 경로를 식별합니다.

8. 간단한 서양 분석

  1. 프로테아제 및 포스파타제 억제제로 RIPA 완충액의 쥐 대뇌 피질을 균질화한 다음 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 에서 원심분리하여 파편을 제거합니다. BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
  2. 단백질 샘플을 샘플 버퍼와 혼합하고 95°C에서 5분 동안 배양하여 완전한 변성을 보장하여 단백질 샘플을 변성시킵니다.
  3. 3μL의 변성 단백질 샘플을 Simple Western 모세관에 로드합니다. 오버플로를 방지하기 위해 샘플이 제대로 로드되었는지 확인하십시오. 모세혈관을 Simple Western 기기에 넣습니다.
  4. 분리된 단백질을 p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 및 IL-17을 포함한 1:50 희석된 1차 항체로 30분 동안 배양합니다.
  5. 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 각각 5분씩 3회 세척 버퍼로 모세관 시스템을 세척합니다. 차단 buffer에 희석된 HRP 접합 2차 항체를 추가하고 30분 동안 배양합니다.
  6. 과도한 2차 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼로 각각 5분씩 3회 세척을 수행합니다. Simple Western 시스템에서 검출 프로그램을 실행하여 화학발광을 사용하여 단백질을 자동으로 검출합니다.
  7. Compass for Simple Western 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. electropherogram에서 상대적인 피크 면적을 비교하여 단백질 발현을 정량화합니다. 데이터를 GAPDH 단백질로 정규화합니다.

9. 통계 분석

  1. GraphPad Prism 9.0.0을 엽니다. 소프트웨어. 파일 > 데이터 로드를 위해 데이터 가져오기 를 클릭합니다. 데이터를 SD± 수단으로 제시합니다. 두 그룹 간의 비교를 위해 쌍체를 이루지 않은 t-검정을 사용합니다.
  2. Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 정규성을 평가합니다. 정규성을 위반하는 경우(p < 0.05) 그룹 간 비교를 위해 Mann-Whitney U 검정을 적용합니다. 정규성이 충족되면(p ≥ 0.05) 독립 표본 t-검정을 수행하여 그룹 차이를 평가합니다.
  3. p-값으로 결과를 보고합니다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. 중요하지 않은 경우 n.s., p < 0.05인 경우 *, p < 0.005인 경우 **, p < 0.0005인 경우 ***, p < 0.0001인 경우 **** 표기법을 사용합니다.

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결과

RBI 마우스의 인지 장애
30 Gy의 전뇌 방사선 조사에 노출된 후, 생쥐의 체중을 매주 모니터링했습니다. 인지 기능은 4주차 동안 평가되었습니다(그림 1A). 초기 측정은 대조군과 RBI 그룹의 체중이 비슷하다는 것을 나타냈습니다. 그러나 방사선 조사 후 1주에서 3주 사이에 RBI 그룹은 체중이 크게 감소했으며(그림 1B), 이는 전뇌 방사선 조사가 마우스의 성장과 발달에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.

MWM(Morris Water Maze) 테스트 결과는 시간이 지남에 따라 대조군의 탈출 대기 시간이 점진적으로 감소하는 것으로 나타난 반면, RBI 그룹은 탈출 시간에 큰 변화를 보이지...

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토론

프로토콜 내의 중요한 단계
이 프로토콜은 생쥐에서 RBI를 유도한 후 신경염증 및 Th17 세포 분화 경로에 대한 포괄적인 평가를 포함합니다(그림 6). 중요한 단계는 30Gy 선량으로 C57BL/6 마우스의 두개골 방사선 조사이며, 이는 RBI1에 대해 잘 확립된 모델입니다. 이온화 챔버를 사용한 정확한 선량 보정으로 재현성보장 28. MWM을 포함한 행동 분석은 인지 장애를 평가합니다29, RNA 염기서열분석은 유전자 발현 변화, 특히 Th17 세포 분화 경로의 활성화에 대한 통찰력을 제공합니다30 RBI8에 대한 자세한 분자 이해를 제공합니다.

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 베이징 방사선의학회(Beijing Institute of Radiation Medicine)에서 지원했습니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12-230 kDa 분리 모듈, 8 x 25 모세관 카트리지SimpleWesternProteinSimpleSM-W004
ProteintechHRP-60004용 1:500 희석/항체
Abcamab72601:2000 Immunofluorescence
anti-IBA-1 항체Abcamab1788461:2000 Immunofluorescence
anti-IL-17 A/F 항체ThermoMA5-237481:10 희석/항체 SimpleWestern
anti-IL-1β 항체CST122421:50 희석/항체 SimpleWestern
anti-IL-6 항체ThermoMA5-238001:5 희석/항체 SimpleWestern
Anti-Mouse Detection Module용 항체SimpleWestern
anti-P-STAT3(Try705) 항체ThermoMA5-15193을 위한 1:2 희석/항체 SimpleWestern
anti-RORProteinSimpleDM-0012차 항체
; t 항체Thermo14-6988-821:5 희석/SimpleWestern
anti-STAT3 항체Thermo7100771:20 희석/SimpleWestern
anti-TGF β-1,2,3 항체ThermoMA5-237951:10 희석/항체 SimpleWestern
BAC 분석ThermoA55860단백질 분석
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaSimpleWesternProteinSimplePS-ST01EZ-8
LAbcamab1500771:1000 면역형광
RNeasy KitQiagen74134RNA 추출
SuperScript IV First-Strand 합성 시스템Thermo Fisher Scientific18091050역전사
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
트리졸 시약Invitrogen15596026RNA 추출
anti-GAPDH 항체용 SimpleWestern anti-GFAP 항체용 희석/항체 를 위한 ProteinSimple DM-002 2차 항체 SimpleWestern Anti-Rabbit Detection Module&gamma를 위한 Goat Anti-Rabbit IgG H&를 위한

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