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방법 논문

Retinitis pigmentosa murine model에서 광수용체 변성 및 보존 분석

621 조회수

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DOI:

10.3791/68324

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2025년 7월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 유리체강내 약물 투여, 저온 유지 절편 및 면역 형광을 포함하여 색소성 망막염의 쥐 모델에서 광수용체 변성 및 보존을 분석하기 위한 최적화된 기술을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 망막 무결성을 보장하고 치료 개입의 효과에 대한 정량적 데이터를 제공합니다.

초록

망막병증은 전 세계적으로 수억 명의 사람들에게 영향을 미치며 시각 장애와 실명의 중요한 원인입니다. 이러한 질병 중 색소성 망막염(RP)은 진행성 망막 변성을 특징으로 하는 유전성 안구 질환으로 전 세계적으로 약 150만 명에서 200만 명에게 영향을 미칩니다. 유전성 망막 이영양증의 동물 모델에 대한 개념 증명 연구는 질병의 병태생리학적 메커니즘, 치료 효과 및 안전성에 대한 연구를 위한 중요한 증거 기반을 형성합니다. 생쥐의 유리체강 내 주사 및 저온 유지 장치 절편은 RP 모델에서 약물 효과를 조사하는 데 널리 사용되는 기술로, 유리체액에 물질을 정확하게 전달하고 망막 변화에 대한 자세한 분석을 위해 고품질 조직학적 샘플을 준비할 수 있기 때문입니다. 또한, 망막 광수용체에서 발현되는 칼슘 의존성 단백질인 리커버린(recoverin)에 대한 항체를 사용하여 면역형광을 통한 세포 계수는 최근 RP 모델에서 망막 변성과 관련된 세포 변화를 연구하는 데 사용되었는데, 이 접근 방식은 치료 개입 후 광수용체 손실 및 잠재적 세포 보존의 평가를 용이하게 하기 때문입니다. 유리체강내 주사는 안구 무결성과 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 최적화되었으며, 가는 바늘을 사용하여 용액을 유리체 챔버에 투여합니다. 약물 효과를 평가하기 위해 사전 정의된 기간이 지난 후, 저온 유지 장치를 사용하여 10μm 두께로 샘플을 절단한 후 recoverin 항체로 면역형광 라벨링을 수행하여 조직학적 처리를 수행합니다. 마지막으로, 세포 계수를 수행하여 광수용체의 보존으로 입증된 바와 같이 약물 치료가 보호 효과를 발휘했는지 여부를 평가합니다. 이러한 기술은 망막병증 연구에서 일관된 데이터를 생성하기 위해 광범위하게 적용되어 왔지만, 정확한 조직 처리 및 처리 품질을 달성하는 데는 여전히 어려움이 있습니다. 이 프로토콜은 유리체강내 주입에서 조직학적 절편 준비에 이르기까지 각 단계를 최적화하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공하여 재현 가능한 고품질 결과를 보장합니다.

서론

시각은 감각 체계의 가장 복잡한 감각 중 하나로, 환경적 시각적 자극을 포착하고 이를 전기화학적 신호로 변환하는 데 필수적이며, 이 신호는 뇌에서 처리되어 이미지를 형성합니다. 노화, 유전적 결함 및 질병과 같은 다양한 생물학적 요인은 시력을 손상시켜 삶의 질과 일상 활동에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

인간의 눈은 세 개의 기본 방으로 구성되어 있습니다. 각막과 공막에 의해 형성된 바깥층은 안구에 구조적 지지를 제공합니다. 중간층에는 홍채, 모양체, 맥락막이 포함되며, 맥락막은 광수용체에 혈액을 공급하는 역할을 합니다. 마지막으로, 내층은 망막(retina)으로 구성되어 있는데, 망막은 빛의 자극을 처리하고, 빛을 뇌로 보내는 전기 신호로 변환하여 이미지 형성을 위해 1,2 하는 구조를 가지고 있습니다.

신경 망막은 광수용체(photoreceptor), 양극성 세포(bipolar cell), 수평 세포(horizontal cell), 무축삭 세포(amacrine cell), 신경절 세포(ganglion cell)와 같은 특수 세포를 포함한 여러 세포층으로 구성되어 있습니다. 또한 망막에는 미세아교세포(microglia), 성상세포(astrocyte), 뮐러(Müller) 세포와 같은 신경교세포(glial cell)와 색소성 상피 세포(pigmented epithelial cell)가 포함되어 있습니다. 망막의 비신경 부분에 위치한 후자는 광수용체에 대한 구조적 무결성, 보호 및 지원을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 3,4. 신경 부분에는 빛 포착 및 처리에 직접 관여하는 감각 및 신경 세포가 있습니다 5,6,7.

망막은 시력에 필수적이기 때문에 실명으로 이어질 수 있는 병리학의 영향을 받는 경우가 많습니다. 이러한 질환 중 색소성 망막염(RP)은 주요 유전성 망막병증 중 하나로 두드러지며, 80개 이상의 유전자가 이 병인과 관련이 있습니다 8,9. RP는 이질적인 질환으로, 주로 상염색체 우성 또는 열성 방식으로 유전되지만, X-염색체 연관 또는 자발적 돌연변이로 인해 발생할 수도 있습니다10.

전 세계적으로 유병률이 3,000명 중 1명에서 7,000명 중 1명으로 추정되며, 인구와 지역에 따라11,12, RP는 일반적으로 청소년기 또는 초기 성인기에 나타나며 야간 시력 저하 및 주변 시야 상실과 같은 초기 증상을 보입니다. 질병이 진행됨에 따라 중심 시력이 손상되어 잠재적으로 완전한 실명으로 이어질 수 있습니다 9,13.

RP에 대한 치료법은 아직 없지만, 개발 중인 다양한 치료법은 질병 진행을 늦추거나 역전시킬 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 이러한 접근 방식 중에는 유전, 세포 및 약물 요법과 전자 장치가 있습니다. RP에 대한 이해를 높이고 새로운 중재를 평가하기 위해 망막 변성의 쥐 모델이 널리 사용되었습니다. 종종 rd(망막 변성)라고 하는 이러한 모델은 RP에 대한 분자 기초와 치료법을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 색소성 망막염 연구에 사용된 다양한 모델 중 Pde6βrd10/rd10 (rd10) 마우스 균주는 포스포디에스테라제14의 막대 특이적 β 서브유닛을 암호화하는 유전자에 미스센스 돌연변이를 나타내며, 인간에서 발생하는 것과 유사한 광수용체의 느린 퇴화를 나타냅니다15.

유리체강 내 약물 투여는 다양한 연구에서 널리 사용되어 왔다 16,17,18. 이 프로토콜은 특히 광수용체 세포의 생존과 관련하여 망막에 대한 약물 효과를 연구하는 연구자에게 적합합니다. 이러한 방식으로 이 프로토콜의 주요 목표는 색소성 망막염(RP)의 쥐 모델에서 유리체강 내 주입을 통한 약물 전달을 최적화하고 광수용체 세포 마커인 리커버린을 위한 면역형광을 사용하여 광수용체 생존을 평가하는 것입니다. 유리체강 내 주사는 국소 약물 투여를 가능하게 하여 전신 부작용을 최소화하고 망막 생체 이용률을 높이며 다른 장기의 부작용을 줄입니다. 반면, 리커버린에 대한 면역형광은 광수용체 생존에 대한 특정 분석을 가능하게 하여 이 치료 전략의 효능을 평가하는 효과적인 도구를 제공합니다. 그러나 적용 가능성은 동물 모델 선택, 주입 정밀도 및 처리 기간과 같은 요인에 따라 달라지며, 이 방법을 다른 실험 환경에 적용할 때 고려해야 합니다.

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프로토콜

이 프로젝트와 그 안에서 수행되는 모든 프로토콜은 국립 동물 실험 통제 위원회(National Council for the Control of Animal Experimentation)의 동물 관리 지침을 따르며 동물 사용 윤리 위원회(CEUA - UFF)의 1464280219 번호로 승인되었습니다.

1. 동물

  1. 광수용체 변성을 겪는 rd10 murine strain과 C57 Black/6 strain (rd10의 배경)을 사용합니다. 이러한 균주를 12시간/12시간의 명암 주기로 유지하며 물과 음식에 대한 자유로움 을 제공합니다.

2. 마취

  1. 증류수에 희석한 케타민 80mg/kg과 자일라진 8mg/kg의 용량으로 준비된 마취제로 복강 내 주사를 수행합니다. 케타민은 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDA) 수용체 억제제로 작용하여 진통 효과를 제공하고 자일라진은 마취제 역할을 합니다.
  2. 복강내 주사의 경우 주입하는 부피를 10μL x 무게(g)로 계산합니다.
  3. 복부에 명확하게 접근할 수 있도록 마우스를 제지하십시오. 복강의 오른쪽 하단 사분면을 70% 알코올로 청소하고 베벨이 위를 향하도록 바늘을 삽입해야 합니다.
  4. 통증 반사가 없는지 확인하려면 동물의 꼬리나 발을 부드럽게 꼬집습니다. 반응이 없으면 동물이 적절하게 마취되었음을 나타냅니다.

3. 유리체강 주사

  1. 동물을 마취한 상태에서 눈을 노출시키고 10배 배율의 양안 실체 현미경을 사용하여 주사가 수행될 각막과 공막 사이의 회색 띠인 변연 영역을 식별합니다.
  2. 주사를 수행하려면 다른 사람의 도움이 필요합니다. 양안 입체 현미경 아래에서 한 사람이 동물을 잡고 바늘을 삽입하는 동안 보조자는 주사기 플런저를 눌러 물질을 눈에 주입해야 합니다.
  3. 먼저 바늘이 고정된 초미세 주사기(31G x 6mm)를 사용하여 바늘을 너무 깊게 삽입하지 않도록 주의하면서 가장자리 부위에 구멍을 뚫습니다. 경사의 절반만 삽입하면 충분합니다.
  4. 그런 다음 관심 액체/약물 1μL가 들어 있는 휴대용 사전 멸균 마이크로 주사기(베벨이 없는 게이지 26 S)를 인슐린 주사기로 뚫린 구멍에 삽입합니다.
  5. 보조자가 주사기 플런저를 천천히 눌러 전체 볼륨이 약 30초 동안 투여되도록 합니다.
  6. 같은 동물의 다른 쪽 눈에 대해서도 이 과정을 반복하고 시간을 기록합니다.
  7. 실험 그룹이 두 개 이상인 경우 각 그룹이 제대로 식별될 수 있도록 동물의 귀를 표시합니다.
  8. 건조를 방지하기 위해 동물의 각 눈에 0.01M PBS 용액 1방울을 사용하십시오.
  9. 이 절차가 끝나면 동물이 깨어날 때까지 온도를 37°C로 설정한 가열 패드에 동물을 올려 놓습니다. 1-2시간이 소요될 수 있습니다. 마취 상태에서 동물을 지속적으로 모니터링하고 깨어나면 분석 시간까지 동물을 우리로 되돌려 놓습니다.
  10. 트리판 블루(trypan blue)와 같은 눈에 보이는 염료를 사용하여 초기 교육 세션을 수행하여 작업자가 마우스에서 유리체강내 주입 기술을 개선할 수 있도록 지원합니다.
    참고: 염료는 바늘 경로의 시각화를 용이하게 하여 주입 깊이와 각도를 정밀하게 조정할 수 있어 안구 구조 손상 위험을 줄이고 절차의 안전성을 높입니다.

4. 안락사와 안구 준비

  1. 주사 후 특정 치료 기간 후, 5% 이소플루란 과다 투여를 흡입하여 동물을 안락사시킵니다. 호흡이 멈춘 후 최소 1분까지 노출을 계속하십시오. 죽음을 확신하려면 동물의 목 뒤를 잡고 경추 탈구가 이루어질 때까지 꼬리를 단단히 당깁니다.
  2. 눈을 제거하기 전에 측두극을 표시하십시오. 마커 또는 뜨거운 바늘/핀을 공막의 측두 영역에 조심스럽게 적용하여 표시가 눈에 잘 띄고 정확한지 확인합니다. 이 단계는 단면 프로세스 중 방향에 대한 기준점으로 사용됩니다.
  3. 다음으로 눈을 노출시키고 멸균 메스와 홍채 절제술 가위로 주변 조직을 잘라 결합 조직과 근육 조직을 분리하고 안구를 노출시킵니다. 생쥐의 경우 눈 근육을 조심스럽게 절개하는 것이 어려울 수 있습니다. 시술을 용이하게 하기 위해 멸균 메스로 눈 피부의 양쪽 모서리를 옆으로 절개하십시오.
  4. 중간 끝의 구부러진 집게를 사용하여 시신경을 잡고 눈구멍에서 눈을 부드럽게 제거하고 즉시 실온(RT)에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액에 5분 동안 조직을 고정합니다.
  5. PFA 용액에 고정한 후 중간 팁 곡선 집게를 사용하여 눈을 유리판으로 옮깁니다. 이 플레이트는 해부 플랫폼으로 작동하며 0.1M pH 7.4 농도의 인산염 완충액이 포함되어 있는지 확인합니다.
  6. 다음으로, 10배 배율의 양안 입체 현미경 아래에 플레이트를 놓고 메스를 사용하여 가장자리(각막 경계) 바로 위를 작게 절개합니다. 그 후, 각막을 분리하기 위해 미세 홍채 절제술 가위로 변두를 따라 둘레 절단을 수행합니다.
  7. Dumont #5 겸자를 사용하여 홍채 및 수정체와 함께 각막을 제거합니다. 마지막으로 4% PFA 용액에 55분 동안 눈을 다시 고정합니다. 그 후, 인산염 완충액 0.1 M, pH 7.4로 눈을 3 번 씻으십시오.

5. 냉동 보존 및 동결

참고: 망막 조직 저온 유지 절편은 앞서 설명한 바와 같이 약간의 조정을 가하여 수행하였다19.

  1. 0.1M 인산염 완충액, pH 7.4에 희석된 10%, 20%, 30%의 자당 구배로 눈을 극저온 보존합니다. 가장 낮은 농도(10%)부터 시작하여 점차 가장 높은 농도(30%)로 증가시키는 자당 용액에 눈을 담그십시오. 각 단계는 눈이 용기 바닥에 안착할 때까지 필요한 시간 동안 지속되며, 이는 다음 농도를 사용할 수 있음을 나타냅니다. 최종 농도에서 눈을 4°C에서 약 12시간 동안 보관합니다.
  2. 다음 날, 초과 30% 자당을 제거하고 실험 그룹에 따라 배열된 직경 2cm의 원형 알루미늄 용기에 눈을 넣습니다.
    참고: 실험 그룹의 수에 따라 적절한 크기의 알루미늄 호일 용기를 만드십시오.
  3. 10배 배율의 양안 입체 현미경에서 피펫이나 여과지를 사용하여 안구 내부와 주변의 과도한 자당을 제거하고 조직 구조가 손상되지 않도록 필요한 주의를 기울입니다.
  4. 눈 내부 또는 주위에 기포가 형성되지 않도록 주의하면서 최적 절단 온도(OCT) 동결 매체에 눈을 삽입하고 상온에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
  5. OCT 1시간 후 이전에 표시된 기준점이 위를 향하도록 눈을 배치합니다. 얼리기 위해 작은 스티로폼 상자 안의 적절한 알루미늄 판에 알루미늄 호일 용기를 놓습니다.
  6. 호일 용기 주변의 알루미늄 플레이트에 액체 질소를 조심스럽게 붓습니다. 질소가 표면 전체에 고르게 퍼지는지 확인하십시오. 이것은 균일한 조직 동결을 촉진합니다. 액체 질소가 호일 용기 내부의 눈에 직접 닿지 않도록 하십시오. 그런 다음 저온 유지 장치를 사용하여 눈 절개를 진행합니다.

6. 슬라이드 준비

  1. 폴리-L-라이신(200μg/mL)을 젖빛 가장자리 유리 슬라이드에 펴 바릅니다.
  2. 슬라이드가 마를 때까지 12시간 동안 기다렸다가 사용할 준비를 합니다.

7. 저온 유지 장치 절편

  1. 저온 유지 장치에서 얼어붙은 블록을 플랫폼에 놓습니다.
  2. 핸드휠을 돌려 10μm 두께의 섹션을 만듭니다.
  3. 컷에 모든 눈이 동일하게 나타나도록 블록의 위치를 조정합니다.
  4. 명시야 현미경을 사용하여 시신경이 식별될 때까지 계속 절단합니다.
  5. 폴리-L-라이신 전처리된 슬라이드의 단면을 수집합니다.
  6. 분석할 때까지 슬라이드를 -20°C에서 보관하십시오.

8. 면역형광

참고: 면역형광은 앞서 설명한 바와 같이 일부 조정19,20과 함께 수행되었습니다.

  1. 저온 유지 장치의 절편에서 얻은 슬라이드를 0.01M PBS에 100μL의 0.5% Triton X-100과 함께 RT에서 15분 동안 배양하여 세포 원형질막을 투과시킵니다.
  2. 여분의 Triton X-100을 제거하기 위해 RT에서 각각 5분 동안 0.01M PBS로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
  3. 0.01 M PBS에 100 μL 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 RT에서 30분 동안 배양하여 비특이적 항체 결합 부위를 차단합니다.
  4. 차단 후, 광수용체 세포를 라벨링하기 위해 BSA 1%에 희석된 1:1500 농도의 100μL의 안티리커버린으로 절편을 4°C(냉장고)에서 밤새 배양합니다.
  5. 다음 날, 항토끼 다클론 2차 항체 488 또는 항토끼 다클론 2차 항체 568 1:500으로 BSA 1%에 희석한 100μL로 절편을 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
  6. RT에서 각각 5분 동안 0.01M PBS로 슬라이드를 두 번 세척합니다.
  7. RT에서 2-3분 동안 100μL의 DAPI 1mg/mL(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 절편을 배양합니다.
  8. RT에서 0.01M PBS로 5분 동안 슬라이드를 한 번 세척합니다.
  9. 마지막으로, pH 7.4의 0.1M 인산염 완충액에 40mL의 글리세롤에 2.5g의 n-프로필 갈레이트를 함유한 장착 매체로 섹션을 처리합니다. 그들은 퇴색 방지 시약과 장착 매체로 작용하여 샘플을 보존합니다. 슬라이드 위에 커버슬립(24mm 50mm)을 놓고 매니큐어로 섹션을 밀봉합니다. 그런 다음 현미경으로 샘플 보기를 진행하십시오.

9. 형광 현미경 photomicrography

  1. 면역조직화학 기법을 사용하여 표지된 세포의 이미지를 획득하려면 청색, 녹색 및 적색 필터가 장착된 형광 광학 현미경을 사용하십시오. 또한 슬라이드 현미경 촬영을 위한 카메라를 부착하십시오. 현미경 사진을 얻으려면 현미경으로 동시에 시각화할 수 있도록 열려 있어야 하는 LAS V3.7(Leica) 소프트웨어(이미징 소프트웨어)가 있는 컴퓨터를 사용하십시오.
  2. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 처음에는 가장 낮은 배율 대물렌즈와 파란색 필터를 사용합니다.
  3. 파란색으로 표시된 세포(세포핵)가 명확하게 시각화될 때까지 거친 초점 손잡이와 미세한 초점 손잡이를 사용하여 초점을 조정합니다.
  4. 이미징을 위해 원하는 망막 영역을 선택합니다. 배율을 최대 40배 대물렌즈까지 점진적으로 높이고 필요에 따라 초점을 조정합니다.
  5. 초점을 조정한 후 바이패스 핀을 당겨 현미경 이미지를 이미징 소프트웨어로 전송합니다. 원하는 필터(A4(파란색), L5(녹색) 및 TX2(빨간색))를 선택합니다. Exposure, Gain 및 Gamma 매개변수를 조정하여 이미지가 선명하고 현미경으로 관찰된 것과 최대한 가깝게 만듭니다.
  6. 400× 배율에서 113 × 113μm 영역의 4개 필드를 캡처하여 망막 주변에서 중심까지의 방향을 따릅니다. 이 필드 중 두 개는 주변 영역을 나타내고 두 개는 망막의 중앙 영역을 나타내는지 확인합니다.
  7. 주변 시야 현미경 사진을 얻으려면 눈 가장자리에서 약 50μm 떨어진 곳에서 이미지를 캡처합니다. 중심장 현미경 사진의 경우 시신경에서 50μm 떨어진 인접 영역을 선택하고 이미지를 획득합니다. 정량화를 위해 오른쪽 눈과 왼쪽 눈을 모두 사용하여 처리당 총 8개의 분석된 필드를 생성합니다.
  8. 모든 현미경 사진을 완료한 후 면역 표지된 세포의 수동 정량화를 진행합니다.

10. 세포 정량화

  1. ImageJ v.1.54g 프로그램을 엽니다. 프로그램 내에서 파일, 열기를 차례로 클릭하고 컴퓨터에 저장된 이미지를 선택합니다.
  2. 이미지가 이미 열려 있는 상태에서 Multi-point 를 클릭합니다. 이 도구를 사용하여 계산할 각 셀을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 셀을 정량화합니다.
  3. 외핵층(ONL)에서 공동 국소화된 세포, 즉 리커버린(recoverin)과 DAPI에 대해 양성인 세포를 정량화합니다.
  4. 개수가 완료되면 마우스 왼쪽 단추를 두 번 클릭하여 표시된 총 셀 수를 확인합니다.
  5. recoverin-positive cells의 수를 결정한 후 Excel quantification table에 cells 수를 입력하고 다음 photomicrograph로 이동합니다.
  6. 각 동물에 해당하는 8개의 필드에 대해 모든 단계를 반복합니다.
  7. 전체 망막에 대한 단일 실험점에 해당하는 이 8개 필드의 평균을 계산합니다(n= 1). 주변 망막 그래프의 경우, 총 4개의 필드(왼쪽 눈에서 2개, 오른쪽 눈에서 2개)로 구성된 주변 필드의 평균을 사용합니다. 이 평균은 말초 망막에 대한 하나의 실험점(n= 1)에 해당합니다. 주변 그래프와 동일한 방식으로 망막 그래프의 중심을 만들고 영역만 변경합니다.

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결과

광수용체(photoreceptor), 리커버린 양성 세포(recoverin-positive cells)를 라벨링하기 위한 면역형광 기술을 통해 rd10 및 C57Bl6 동물에서 광수용체의 퇴행 패턴을 관찰할 수 있었으며, C57Bl6 동물은 건강한 것으로 간주되었습니다(그림 1). 보시다시피, 리커버린 양성 세포에 대한 라벨링은 광수용체가 발견되는 외핵층(ONL)에만 국한되며, rd10 및 야생형 동물 모두에서 이러한 세포 내부의 분절에 대한 라벨링을 포함합니다. 개발이 진행됨에 따라 두 동물 모두에서 형광 면역 염색이 보존되는 것을 관찰할 수 있지만 rd10 동물에서 ONL 두께가 감소하는 것을 관찰할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 다양한 세포 유형의 패턴을 관찰하는 데 효과적입니다.

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토론

망막은 접근하기 어려운 섬세한 조직입니다. 따라서 이 조직을 표적으로 하는 약물 치료를 수행하는 데 사용되는 기술을 고려해야 합니다. 유리체강 내 주사는 특히 연령 관련 황반변성 21, 당뇨병성 망막병증22, 색소성 망막염23과 같은 안과 질환의 치료에서 약물을 망막에 직접 전달하기 위해 잘 정립되고 널리 사용되는 기술입니다. 본 임상시험계획서에 따라 수많은 연구에서 망막층을 검사하기 위해 면역조직화학(immunohistochemistry)과 함께 유리체강내 주사를 사용했다 16,17,18. 이러한 발견은 이전 연구에서 입증된 바와 같이 망막 연구에서 이러한...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 리우데자네이루 주 연구 지원을 위한 카를로스 샤가스 필류 재단(FAPERJ)의 지원을 받는 연구 펠로우십 기간 동안 수행되었으며, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil(CAPES) - 금융 코드 001의 일부 자금 지원도 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787차단 완충액용 용액
1% BSASigma-AldrichA4503차단 용액
1% Human BD Fc 블록BD Biosciences564220차단 완충액에 필요한 Fc 블록
150W LED 램프광조사용 Amazon B07VH3CVSF LED 광원
1x PBS Gibco10010-023차단 완충 및 세척 단계 용액
20갤런 저장 용기광조사 공정용 Amazon B001B1C4G0 용기
40W RGBW 투광 LED 램프 AmazonB08QFPJSMDRGB 광원
IBEX 이미징용 Ag85BAbcamab43019/NA항체. 표 1을 참조하십시오.
알파-평활근 액틴 DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA항체. 표 1을 참조하십시오.
아비딘/비오틴 차단 키트Abcamab64212아비딘 및 비오틴 차단 용액
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714고정 용액
BOND 탈랍 용액라이카 바이오시스템NC0221076탈파라핀화 용액
BOND 에피토프 회수 용액 1라이카 바이오시스템NC0235529구연산염 기반 pH 6 에피토프 회수 용액( ER1)
BOND 에피토프 회수 용액 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA 기반 pH 9 에피토프 회수 용액(ER2)
BOND 연구 검출 시스템Leica BiosystemsNC0396648자동 연구용 염색 시약
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNA자동 연구 염색 플랫폼
BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077완충액
CD15BD Biosciences347420/AB_400298IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD4 알렉사 플루어 488R& D SystemsFAB8165G/AB_2728839IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD45 피코에리트린(PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
나귀 항염소 IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838항체. 표 1을 참조하십시오.
나귀 항마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 항마우스 IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
나귀 항토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834항체. 표 1을 참조하십시오.
EasyDip 염색 시스템Newcomer Supply5300KIT슬라이드 염색 시스템
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02마운팅 미디어
HoechstBiotium40046IBEX 이미징용 핵 염색. 표 1을 참조하십시오.
Imaris 파일 변환기 x64 10.2.0Imaris Oxford Instruments무료 파일 변환기
ImarisViewer 소프트웨어 x64 10.2.0Imaris Oxford Instruments무료 이미지 처리 소프트웨어
ImmEdge 펜벡터 연구소H-4000소수성 장벽 펜
리튬 붕소화물 (1 그램)STREM Chemicals93-0397염료 불활성화용 화학 물질, 이 화학 물질의 작은 분취량(1g)을 구입하십시오.
미칸 비오틴R& D SystemsBAF2846IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
마이크로 커버 안경VWR48393-241유리 슬라이드 커버
범사이토케라틴 Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
PELCO BioWave Pro 마이크로파 시스템Ted Pella Inc36500-230비가열 과학용 전자레인지
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062과학용 전자레인지를 위한 완전 자동화된 온도 제어
SimpleITK오픈 소스 소프트웨어등록 및 채널 처리 소프트웨어
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227IBEX 이미징용 라벨링 시약. 표 1을 참조하십시오.
광시야 현미경라이카 마이크로시스템즈 NA라이카 마이크로시스템즈 썬더 이미저(LED8 광원 및 LAS X 소프트웨어(3.7.1.21655). 형광 이미징의 경우, 외부 필터 휠(PN: 11536075)과 2개의 추가 단일 대역 필터(PN: 8118215)가 있는 맞춤형 쿼드 밴드 필터를 사용하여 패스당 7개의 염료 채널을 이미지화했습니다. 필터 여기, 이색성 및 방출선은 (1) 쿼드 밴드 큐브: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31에서 이색성, 여기 또는 방출 필터 없음; (2) 외부 필터 휠 위치 1: 434/32, 위치 2: 520/40, 위치 3: 585/20, 위치 4: 720/60, 위치 5: 통과; (3) 단일 대역 1— 585/22 여기, 594 이색성, 625/30 방출; (4) 단일 대역 2— 635/20 여기, 647 이색성, 667/30 방출.
Zeiss 광학 렌즈 클리너AmazonB00GPVQVCOMicroscope 대물렌즈 클리너
항체
Ag85BAbcamab43019다클론 토끼 IgG, 사이클 1
알파-평활근 액틴 DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, 사이클 1
CD4 Alexa Fluor 488R&;D 시스템FAB8165G클론 염소 IgG, 사이클 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B, 사이클 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, 사이클 1
나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo FisherA32814다클론 당나귀, 사이클 1
당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787다클론 당나귀, 사이클 1
당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794다클론 당나귀, 사이클 1
HoechstBiotium40046핵 라벨, 사이클 1
CD15BD Biosciences347420MMA, 사이클 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, 주기 2
CD45 피코에리트린(PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, 주기 2
당나귀 항마우스 IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020다클론 당나귀, 주기 2
루미칸 비오틴R& D SystemsBAF2846Polyclonal Goat IgG, 주기 2
범사이토케라틴 Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, 주기 2
스트렙타비딘 Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N/A, 주기 2
HoechstBiotium40046주기 2
Solutions
차단 완충액(사이클 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3% BSA
Sigma-AldrichA45031% 부피%
Human BD Fc BlockBD Biosciences5642201
% 1x PBS Gibco10010-02397.7% 부피
1차 항체 염색 용액 #1(사이클 1)
차단 완충액(사이클 1)위항체 첨가 후 부피까지 보충
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
Primary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 1)
Blocking Buffer (Cycle 1)위를 첨가한 후 부피까지 보충
; AF488R& D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
2차 항체 염색 용액 #1(사이클 1)
차단 완충액(사이클 1)위항체 첨가 후 부피까지 보충
Donkey Anti-Goat AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
당나귀 안티 토끼 AF 플러스 555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_27628341:100
나귀 안티 마우스 AF 플러스 647Thermo Fisher ScientificA32787/AB_27628301:50
1차 항체 염색액 #3(사이클 1)
차단 완충액(사이클 1)위추가 후 볼륨까지 보충 항체
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA free Blocking Buffer (Cycle 2) 
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3% 부피 인간
BD Fc 블록BD Biosciences5642201% 부피
1x PBS Gibco10010-02398.7% 부피
1차 항체 염색액 #4 (Cycle 2)
BSA free Blocking Buffer (Cycle 2)위항체 첨가 후 부피까지 보충
CD15BD Biosciences3474201:30
루미칸 비오틴R& D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
2차 항체 염색 용액 #2(주기 2)
BSA 프리 차단 완충액(주기 2)위항체 추가 후 부피까지 보충
나귀 항마우스 IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200
조직 조직 광조사용 IBEX 이미징용 즈 즈 세척 IBEX 이미징용 당IBEX 이미징용 당IBEX 이미징용 당 루 다 당 Scientific 참조 참조 항체 CD4  참조 당 참조 참조 참조 당

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