방법 논문

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

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DOI:

10.3791/68332

⸱

2025년 6월 20일

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

이 논문에서

요약

학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

초록

생체 내 이미징은 온전하고 행동하는 파리 내에서 신경 활동, 발달 및 가소성을 실시간으로 시각화할 수 있기 때문에 초파리의 신경생물학을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이 기술은 시냅스 기능 및 회로 연결과 같은 동적 프로세스에 대한 귀중한 통찰력을 제공하지만, 고정 또는 생체 외 제제에서는 정확하게 포착할 수 없습니다. 생체 내 이미징을 위한 파리 준비를 위한 대부분의 기술에는 기능 이미징 직전에 파리를 마취하는 것이 포함됩니다. 그럼에도 불구하고, 광범위한 증거는 마취가 여러 가지 인지적 및 생리적 과정에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이러한 이유로 동물 준비 중 마취제를 사용하지 않고 성인 Drosophila melanogaster의 생체 내 이미징은 도전적이지만 매우 바람직한 접근 방식입니다. 여기에 제시된 프로토콜은 진공 시스템에 연결된 작은 금속 튜브에 주둥이를 흡입하여 깨어 있는 파리의 머리를 고정시키는 것입니다. 머리가 고정되어 있는 동안 파리는 마취 없이 기능 이미징을 위해 준비됩니다. 이 프로토콜은 빠르고 재현 가능하여 파리에 해를 끼치 지 않습니다. 이 방법의 주요 장점은 마취제 사용을 피함으로써 신경 활동에 대한 마취의 잠재적인 복잡한 영향을 설명할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 저렴하고 사용자 정의 가능한 도구를 사용하여 저렴하고 적응력이 뛰어납니다. 이를 통해 살아있는 파리를 성공적으로 이미징하여 동적인 인지 과정과 관련된 신경 활동의 빠른 변화를 포착할 수 있습니다.

서론

최근 유전적으로 암호화된 활동 기자의 발전은 신경 활동에 대한 매우 구체적인 실시간 통찰력을 제공함으로써 신경 과학에 혁명을 일으켰습니다. 칼슘 또는 전압 센서 1,2,3,4,5,6,7,8,9와 같은 이러한 리포터를 통해 연구원들은 전례 없는 시간적 정밀도와 공간 해상도로 뉴런 내의 전기 및 화학 신호를 추적할 수 있습니다. 이러한 도구는 서로 다른 뇌 영역에 걸쳐 특정 단일 뉴런을 신경망에 모니터링 할 수 있게 함으로써 뉴런 발화 패턴이 학습, 기억 또는 의사 결정과 같은 인지 과정과 어떻게 관련되는지에 대한 이해를 심화시켰습니다 10,11,12,13,14.

이러한 유전적으로 암호화된 지표를 활용하기 위해 연구원들은 생체 내 이미징을 위해 모델 유기체를 준비하는 고급 방법을 개발했습니다. 종종 "기억 흔적(memory trace)"이라고 불리는 생체 내 기능 이미징에 의한 뉴런 가소성에 대한 첫 번째 보고는 식욕 후각 조절 후 꿀벌의 더듬이 엽에서 발견되었습니다15. 이 발견은 유전적으로 다재다능한 모델 유기체인 Drosophila melanogaster에 대한 연구에 영감을 주어 혁신적인 생체 내 이미징 기술 10,16,17,18의 개발로 이어졌습니다.

초파리는 냄새(조건화된 자극-CS)가 혐오스럽거나 보람 있는 자극(무조건적 자극-미국)과 연관되는 고전적 조건화를 통해 후각 기억을 형성하는 강력한 능력으로 인해 학습과 기억을 이해하는 데 탁월한 모델 역할을 합니다19,20,21,22. 초파리(Drosophila)에서 냄새는 반구당 약 2,000개의 케년 세포 뉴런(Kenyon cell neuron, KC)으로 구성된 연상 기억(sociative memory)을 위한 중요한 뇌 영역인 버섯체(mushroom body, MB)23에서 드물게 나타납니다24. 후각 정보는 KC 축삭을 통해 꽃받침에서 MB 엽으로 전달되며, 이 축삭돌기는 함께 뭉쳐 엽을 형성합니다. 후각 조건화 과정에서 전기 충격이나 설탕 보상과 같은 미국은 뚜렷한 도파민 뉴런(DAN)을 통해 MB 엽으로 전달됩니다: 혐오 자극을 위한 PPL1 뉴런과 보상 자극을 위한 PAM 뉴런 25,26,27,28,29,30. 메모리 획득은 CS와 US 경로의 동시 활성화를 포함하는 것으로 생각되며, 이는 메모리31,32를 인코딩하는 순환 AMP(cAMP)의 시너지 증가를 초래합니다. 이 과정은 KC→MBON 시냅스에서 가소성을 유도하여 시냅스 중량 11,12,13,33,34,35,36,37을 수정합니다. DAN 매개 가소성은 궁극적으로 버섯체 출력 뉴런(MBON)이 학습된 냄새에 대한 접근 또는 회피 행동을 유도하도록 유도합니다34. 현재 모델은 KC에서 MBON으로의 정보 흐름이 KC의 냄새 정체성에서 MBON의 보다 추상적인 정보(예: 이전 경험에 기초한 냄새의 원자가)로 냄새의 표현을 변환한다고 제안합니다34,38. KC와 달리 MBON은 냄새 반응을 광범위하게 조정했습니다. 주어진 냄새는 대부분의 MBON에 대한 반응을 일으킵니다39. MBON의 냄새 조정은 시냅스 가소성에 의해 수정되며 개별 파리마다 크게 다르므로 MBON이 경험에 따라 냄새에 대한 반응을 변경한다는 것을 시사합니다. 34개의 MBON이 있으며, MBON 네트워크의 대다수는 회피 행동34의 두 가지 접근 방식을 주도하는 두 개의 상호 적대적인 부류로 나뉘어져 있는 것으로 보입니다. 이러한 이유로 생체 내 이미징을 사용하여 다른 MBON에 기록하여 메모리 검색을 연구하는 것이 널리 사용되었습니다.

생체 내 기능 이미징을 위한 초기 방법에는 머리 캡슐 상단에서 큐티클의 일부를 제거하는 수술을 수행한 다음 작은 플라스틱 랩으로 덮는 것이 포함됩니다18. 이것이 초파리에서 생체 내 이미징의 시작을 의미했지만, 그 이후로 파리 준비 기술과 현미경으로 자극을 전달하여 학습 및 기억과 같은 과정을 조사하는 데 상당한 발전이 있었습니다. 그러나 오늘날에도 생체 내 이미징을 위한 파리 준비를 위한 대부분의 기술에는 파리를 마취하는 것이 포함됩니다. 이 관행은 마취가 기억력과 다른 인지 및 생리적 과정에 어떻게 영향을 미치는지를 보여주는 광범위한 증거와 전체 연구 분야가 있기 때문에 문제를 제시합니다. 예를 들어, 실험실 환경에서 매우 일반적으로 사용되는 다양한 마취제(이산화탄소, 이소플루란, 세보플루란 및 콜드 쇼크)의 효과를 이해하기 위한 연구가 수행되었습니다. 연구진은 마취에 오래 노출될수록 회복 시간이 증가하고, 운동 활동이 변화하며, 생산력이 감소하고, 수분 및 지질 저장에 영향을 미칠 수 있음을 발견했다40. 또한, 훈련 직후 냉쇼크 마취를 실시하면 단기 기억이 완전히 파괴될 수 있다고 보고된 바 있다21. 이 초기 연구에서 초파리에는 6-8시간 이내에 감소하는 통합되지 않은 기억(마취에 민감한 기억)과 학습 후 점진적으로 형성되고 약 24시간동안 지속될 수 있는 일종의 통합 기억(마취 내성 기억)이 있는 것으로 알려져 있습니다. 이를 바탕으로 마취는 인지 처리와 뉴런의 활동에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 결국 적절한 기억 표현을 가능하게 합니다.

마취가 기억력에 미치는 영향은 초파리 에만 국한되지 않습니다.수많은 인간 및 기타 포유류 연구에서 유사한 결과가 입증되었습니다. 예를 들어, 한 대학 병원에서 실시한 단면 연구에서는 전신 마취 후 24시간이 지난 환자에서 단기 기억력이 현저히 감소하는 것으로 나타났다42. 생쥐를 대상으로 한 또 다른 연구에서는 전신 마취가 포유류의 학습과 기억에 관여하는 중요한 뇌 영역인 해마의 CA1 영역에서 스파이크 역학, 상관 관계 세포 앙상블, 척추 역학 변화를 크게 감소시키는 것으로 나타났습니다43. 이러한 어려움을 극복하기 위해 이 연구의 목표는 생체 내 이미징을 위한 파리 준비 중 마취 사용을 제거하여 파리의 몸을 완전히 자유롭게 하는 새로운 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 접근 방식은 보다 정확한 신경 활동 기록을 가능하게 하고, 더 긴 기록을 위해 파리 건강을 개선하며, 다른 접근 방식에 비해 마취로 인해 발생할 수 있는 혼란스러운 영향을 제거합니다. 이 프로토콜은 초파리의 뉴런 활동을 기록하기 위해 고안되었으며, 특히 학습 경험 중과 후에 뉴런이 어떻게 가소성을 나타내는지 살펴봅니다. 그러나 해부 프로토콜은 다재다능하며 라이브 이미징 연구의 다양한 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 장비 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 유전자 변형 과일 파리, Drosophila melanogaster

  1. 원하는 Gal4 및 UAS 구조를 각각 운반하는 암컷 처녀와 수컷 파리(12시간 명암 주기에서 60% 상대 습도에서 25°C에서 자름)를 교차시켜 원하는 유전적으로 암호화된 활동 리포터를 발현하는 특정 뉴런을 생성하는 파리를 생성합니다.
  2. 위 교배종의 자손은 폐식 후 2-5일 범위가 될 때까지 나이를 먹습니다. 이미징 챔버는 남녀 모두에게 적합하도록 맞춤 제작되었기 때문에 남성과 여성 모두 사용할 수 있습니다.

2. 흡인기 구축(5분 워크플로)

  1. 면도날을 사용하여 6mm 실리콘 튜브를 약 8인치 길이로 자릅니다. p200 피펫 팁을 잡고 마우스피스용 면도날을 사용하여 약 절반을 자릅니다(그림 1A). 절단 팁을 튜브에 삽입합니다. 파리가 통과할 수 있도록 p1000 피펫 팁을 충분히 자릅니다.
  2. 작은 면 조각을 가져 와서 실리콘 튜브를 덮으십시오. 이것은 파리가 실험자의 입으로 흡인하는 것을 방지하기 위한 것입니다. 자른 p1000 팁을 면으로 덮인 튜브에 놓습니다.
  3. p1000 피펫 팁을 새로운 p200 피펫 팁으로 덮습니다. p200 피펫 팁을 절단하기 위한 적절한 길이를 결정하려면 먼저 p200 피펫 팁을 제거하고 p1000 피펫 팁으로 플라이를 흡인합니다. p200 팁을 다시 부착합니다. 플라이를 부드럽게 불어 두드려 p200 팁 안으로 들어갈 수 있는 한 멀리 이동합니다.
    1. 더 이상 전진할 수 없게 되면 해부 현미경을 사용하여 면도날을 사용하여 파리의 머리가 끝나는 지점과 흉부가 시작되는 지점을 표시합니다. 플라이를 p1000 피펫 팁으로 다시 흡입하고 표시된 위치에서 p200 피펫 팁을 자릅니다.

3. 금속 튜빙 흡입기 구축(5 - 10분 워크플로우)

  1. Dremel 도구와 다이아몬드 톱날을 사용하여 22X 게이지 피하 금속 튜브를 원하는 크기(~10cm)로 자릅니다. 금속 튜브의 끝을 Dremel 420 절단 휠로 버프하여 매끄럽고 깨끗한 개구부를 만듭니다. 이 개구부는 파리의 주둥이를 수용할 것입니다.
  2. 15mL 원심분리 튜브에 튜브를 감아 원하는 곡선 모양을 만듭니다(그림 1A). 곡선은 파리의 몸체가 챔버와 일직선이 될 수 있도록 갈고리 모양을 만들어야 합니다.
  3. Dremel 도구를 사용하여 12TW 게이지 피하 금속 튜브 조각(~7cm 길이)을 자릅니다(이 튜브는 2μL 피펫 팁에 맞아야 함). 2μL 피펫 팁을 사용하여 면도날을 사용하여 22X 게이지 금속 튜브에 맞도록 끝을 자릅니다. 더 큰 금속 튜브를 2 μL 피펫 팁의 다른 쪽 끝에 끼웁니다.
  4. 소량의 수지와 에폭시 접착제 경화제를 함께 혼합하십시오. 작은 금속 튜브가 파이펫 팁과 만나는 곳과 더 큰 금속 튜브가 파이펫 팁에 연결되는 곳에 혼합물을 적용합니다. 어셈블리를 미세 조작기의 홀더에 연결하기 전에 접착제가 밤새 완전히 경화되도록 하십시오. 필요에 따라 각도를 조정합니다.

4. 현미경으로 학습 및 기억 실험을 위한 충격 및 냄새 전달 피펫 제작(10분 워크플로우)

  1. Dremel 다이아몬드 도구를 사용하여 1/100 유리 피펫의 1mL를 3mL 표시에서 절단합니다. 크기가 24.5mm x 8mm이고 두께가 1/8인치인 작은 직사각형 아크릴 시트 조각을 자릅니다.
    참고: 또는, 이 조각은 쇼크 그리드를 더 잘 수용하기 위해 3D 프린팅될 수 있습니다(stl 및 obj 파일은 보충 파일 1 및 보충 파일 2에서 찾을 수 있음).
  2. 이전 단계에서 직사각형 아크릴 조각에 맞도록 구리 쇼크 그리드를 자릅니다. 구리 그리드의 반대쪽 끝에 있는 두 개의 전선을 납땜합니다. 구리 격자를 직사각형 아크릴 조각에 놓고 파리의 복부와 다리가 충격 격자에 맞도록 구부립니다(그림 1I).
  3. 전기 테이프 조각을 사용하여 구리 그리드를 직사각형 플라스틱에 테이프로 붙입니다. 뜨거운 글루건을 사용하여 유리 피펫을 쇼크 그리드에 단단히 부착하여 직선이고 적절한 중앙에 있는지 확인합니다. 디지털 멀티미터를 사용하여 구리 그리드가 파리의 다리에 충격을 효과적으로 전달하기 위해 작동하는지 확인합니다.

5. 접착제 용융을 위한 백금 저항기 조립(Myristic acid) (20분 워크플로)

  1. 와이어 스트리퍼를 사용하여 200mm의 와이어를 원하는 길이로 자르고 두 와이어의 한쪽 끝을 벗겨냅니다. 백금 와이어를 약 60mm 자릅니다(이 길이는 접착제를 녹이는 데 사용할 루프를 만들기에 충분해야 함).
  2. 납땜 건을 사용하여 백금선의 한쪽 끝을 전선에 납땜합니다. 열수축 튜브를 전선에 통과시키고 분젠 버너를 사용하여 납땜된 부품을 덮기 위해 튜브를 와이어로 수축시킵니다.
  3. 2.55mm ID 고무 튜브 20mm 조각 2개를 자르고 백금 와이어를 통과시킵니다(이 프로세스를 용이하게 하기 위해 백금 와이어를 똑바로 유지). 납땜 건을 사용하여 백금선의 다른 쪽 끝을 다른 전선에 납땜합니다. 이 새로운 납땜 부품을 덮기 위해 새 열 수축 튜브를 사용하십시오.
  4. BD tb 1mL 주사기의 플런저를 제거하고 이전 단계의 와이어를 배럴에 통과시킵니다. 백금은 주사기 배럴 끝에서 튀어나와 있어야 합니다. 노출된 전선이 없어야 하며 작은 고무 튜브가 맨 끝을 제외하고 백금 와이어를 덮고 있어야 합니다.
  5. 와이어 스트리퍼를 사용하여 전선의 다른 쪽 끝을 소량 벗겨냅니다. 납땜 건을 사용하여 단단히 연결될 때까지 각 와이어를 바나나 플러그에 납땜합니다.
  6. 에폭시 접착제를 사용하여 주사기 배럴의 상단과 바닥을 접착하여 와이어와 배럴을 함께 접착합니다. 이렇게 하면 주사기 내부의 전선에 대한 장력을 피할 수 있고 저항기의 수명이 더 길어집니다. 접착제를 밤새 경화시키십시오.
  7. 완성된 저항을 DC 전원 공급 장치에 연결합니다.

6. 레코딩 챔버 구축 - (2일 워크플로우)

  1. 보충 파일 3에 따라 검은색 심 시트(두께 0.0125인치)를 레이저로 절단합니다. 챔버 중간에 있는 개구부의 크기는 파리의 크기에 맞게 수정할 수 있습니다(파일의 크기는 일반적으로 암컷과 수컷에 적합합니다).
  2. 챔버의 기초 역할을 할 유리 현미경 슬라이드를 가져옵니다. 수지와 에폭시를 함께 혼합하십시오. 검은 색 아크릴 챔버를 가져 와서 에폭시 접착제를 사용하여 네오디뮴 3mm x 2mm 자석을 네 모서리 모두에 부착합니다. 한 번에 하나의 자석을 붙이고 접착제가 종이 클립으로 경화되는 동안 잡고 있는 것이 좋습니다.
  3. 이전에 챔버에 접착된 각 자석에 두 개의 새 자석을 놓습니다. 에폭시를 사용하여 마지막으로 부착된 자석을 유리 슬라이드에 붙이고 종이 클립을 사용하여 큐레이팅하는 동안 제자리에 고정합니다.
    참고: 접착제가 선별된 후 챔버가 완성되고 더 많은 자석을 추가하여 실험을 위한 챔버 높이를 조정할 수 있습니다. 보충 파일 4, 보충 파일 5 및 보충 파일 6 은 조립된 기록 챔버를 보여줍니다.

7. 마취 없는 생체 내 박리 프로토콜 - (5 - 7분 워크플로우)

  1. 흡인기에서 p200 피펫 팁을 제거합니다. 흡인기(aspirator)를 바이알에 삽입하고 p1000 피펫 팁으로 플라이 하나를 흡입합니다. p200 피펫 팁을 흡인기에 다시 장착합니다. 흡인기를 부드럽게 불어 튕겨 파리가 p200 피펫 팁 상단에서 머리부터 고정되도록 합니다.
  2. 해부실을 매니퓰레이터 홀더에 놓습니다. 진공 청소기를 플라이 홀딩 튜브에 연결하고 필요에 따라 유량 수준을 조정합니다(~500mL/분). 빠른 커넥터를 사용하여 진공 청소기를 쉽고 빠르게 연결-분리할 수 있습니다(그림 1A).
  3. 진공 금속 튜브를 움직여 현미경을 통해 볼 때 시야의 중앙에 놓습니다. 플라이를 붙일 준비가 되었을 때 챔버가 금속 튜브 위에 직접 올라갈 수 있도록 챔버가 올바르게 배치되었는지 확인합니다. 파리의 주둥이를 진공 홀더에 부드럽게 흡인합니다(그림 1A).
  4. 파리가 올바른 위치에 있으면 파리의 머리가 챔버 개구부와 정렬되도록 매니퓰레이터를 움직입니다.
  5. DC 전원 공급 장치를 켭니다. 전류는 0.40-0.50 사이의 범위로 설정해야 합니다. 더 높은 전류는 미리스틱 산의 점도가 너무 낮아지는 지점까지 녹을 수 있으며, 이로 인해 접착제가 파리의 머리 위로 퍼질 위험이 증가할 수 있습니다.
  6. 백금 저항성을 사용하여 용융된 미리스트산을 사용하여 눈과 흉부의 측면을 챔버에 붙입니다(그림 1B). 머리의 큐티클에 접착제가 붙는 것을 방지하려면 특히 눈 옆구리를 붙일 때 가능한 한 적은 접착제를 사용하십시오.
  7. 눈과 흉부가 접착되면 진공 튜브를 분리하고 매니퓰레이터를 사용하여 진공 튜브에서 기록 챔버를 분리합니다. 챔버를 거꾸로 뒤집고 백금 저항을 사용하여 아래에서 주둥이를 붙입니다(그림 1C). 바닥에서 눈을 접착하는 것은 선택 사항이며 해부 중에 파리를 제자리에 유지하는 데 도움이 될 수 있지만 필수는 아닙니다.
  8. 모든 것이 접착되면 DC 전원 공급 장치를 끄고 챔버를 똑바로 세운 다음 유리 측면 베이스에 부착합니다. 가위를 사용하여 작은 테이프 조각을 잘라 파리의 머리 바로 앞뒤로 바릅니다(그림 1D).
  9. 머리가 90에서 실험자를 향하도록 챔버를 돌립니다. 해부 바늘을 사용하여 눈의 측면을 따라 수직으로 자릅니다(그림 1E). 챔버가 수평으로 배치되도록 돌립니다. 절개 바늘을 사용하여 큐티클을 가로질러 자릅니다(그림 1E).
    참고: 방금 만든 큐티클 "창"이 절개 바늘을 사용하여 들어 올릴 수 있는지 확인하십시오. 저항 없이 들어 올려지면 해부 바늘을 덮개에 다시 끼웁니다. 식염수는 절단 중에 선명한 시야를 방해할 수 있는 빛의 굴절을 방지하기 위해 13단계와 14단계에서 사용되지 않습니다.
  10. 파리의 머리 꼭대기에 100μL의 식염수를 추가합니다(그림 1F). 날카로운 집게를 사용하여 창을 조심스럽게 제거합니다(그림 1G). 날카로운 집게를 사용하여 남아 있는 지방이나 기관을 조심스럽게 제거합니다. 뇌는 이제 이미징을 할 준비가 되어야 합니다(그림 1H-1J).

8. 혐오적 후각 조건화를 통한 학습유도 가소성의 시각화 (20분 워크플로우)

  1. 레이저와 침수 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 준비된 플라이를 현미경의 스테이지에 놓습니다. 선택적으로 매크로 렌즈가 있는 카메라를 사용하여 파리에 초점을 맞추고 파리가 건강하고 움직이는지 확인합니다.
  2. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 쇼크 그리드/악취 피펫의 위치를 조정하여 파리가 쇼크 그리드에 안착하도록 합니다.
    참고: 쇼크 그리드가 다리와 복부에 약간 닿기 때문에 파리는 여전히 자유롭게 움직일 수 있어야 합니다(파리는 집어넣으면 그리드에서 다리와 복부를 제거할 수 있어야 합니다). 냄새 전달 피펫은 파리의 더듬이를 향해야 합니다.
  3. 거친 Z 조정 손잡이를 사용하여 뇌의 Z축을 스캔하고 관심 있는 뇌 영역을 찾습니다. 프레임 크기를 512 x 512픽셀로 조정합니다. 스캐닝 주파수는 최소 2Hz로 원하는 속도로 조정해야 합니다. 마지막으로 녹음 시간을 설정합니다.
  4. 맞춤형 또는 상용 냄새 전달 시스템을 사용하여 관심 뉴런 기록을 시작하고 동시에 "사전 훈련" 냄새 전달을 시작합니다(그림 2C). 녹음을 2분으로 설정합니다. 사전 교육 냄새 프레젠테이션은 5초 첫 번째 냄새 펄스(CS-)에 대한 반응을 기록한 다음 30초 인터 자극 간격으로 5초 두 번째 냄새 펄스(CS+)에 대한 반응을 기록하는 것으로 시작합니다.
  5. 사전 훈련 반응을 수집한 후 냄새 전달 시스템에서 훈련 프로토콜을 시작하기 전에 5분 동안 기다립니다. 이 예에서는 교육 중에 CS+만 제시되었습니다. CS+ 냄새는 냄새 전달 시스템을 트리거한 후 30초에 시작하여 1분 동안 표시됩니다. 충격 자극기는 냄새가 나는 동안 12, 90V 충격을 동시에 전달하도록 프로그래밍되어 있습니다.
  6. 훈련 후 5분 또는 15분 정도 기다렸다가 훈련 후 응답을 받습니다. 6단계에서 사전 학습 응답을 기록한 것과 동일한 방식으로 학습 후 응답을 기록합니다. 후속 이미지 분석을 위해 모든 파일을 적절한 형식으로 저장합니다.

9. 이미지 분석

  1. 기록을 분석하려면 뉴런 영역 주위에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이는 배경 형광의 영향을 제한하기 위해 가능한 한 정확해야 합니다.
  2. 측정 툴을 사용하여 기록의 각 프레임에 대한 ROI 내의 평균 형광 강도 데이터를 추출합니다. 이 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.
  3. MATLAB 또는 데이터 분석 프로그램에서 데이터를 열어 각 냄새 추적에 대한 ΔF/Fo 값을 계산합니다. 데이터를 결합하여 평균 ΔF/Fo 전체 개별 파리 기록을 얻고 훈련 전후 평균 냄새 반응 추적의 그래프를 만듭니다(그림 2E, F).

결과

여기서, 마취 없이 성체 초파리의 생체 내 이미징을 활용하여 잘 특성화된 버섯체 출력 뉴런(MBON γ2α'1)12에서 가소성을 유발하는 혐오적 후각 조건화를 조사합니다. 칼슘 지시약 GCaMP6f2 는 적색 형광 단백질 TdTom과 함께 MB 출력 뉴런에서 발현되며, 수상돌기는 MB γ과 α 엽의 구획을 신경 분포시키고 분할 Gal4 라인 MB077C34 (그림 2A, B)를 사용하여 MBON γ2α'1을 유전적으로 표적으로 합니다.

혐오적 후각 조건화 후 가소성을 관찰하기 위해 파리를 컨포칼 현미경 아래에 놓고 복부와 다리를 충격 그리드의 중앙에 정렬하고 냄새 전달 피펫을 파리의 안테나를 향하게 합니다. 먼저, 칼슘 냄새 반응은 4-메틸 시클로헥산올(MCH)의 5초 펄스에 이어 3-옥탄올(OCT)의 5초 펄스에 기록되었으며, 30초의 자극 간 간격으로 구분되었습니다. 5분 후, 파리는 12, 90V 충격과 함께 1분 OCT(CS+) 펄스를 동시에 제시하여 훈련을 받았습니다. 이 연상 조건화 일정은 강력한 행동 혐오 기억을 생성합니다. 마지막으로, 컨디셔닝 5분 및 15분 후, MCH 및 OCT에 대한 칼슘 반응이 훈련 전과 같이 기록되었습니다. MBON γ2α'1은 컨디셔닝 전에 MCH와 OCT 모두에 대해 칼슘 과도 현상에 의해 강력하게 반응합니다(그림 2D-F). 그럼에도 불구하고, 이전 결과와 일치하는12, CS+(OCT)에 대한 5분 후 조건화 칼슘 반응은 완전히 저하되어 있습니다(그림 2D-F). 또한, CS-(MCH)에 대한 반응은 유의하게 강화되었다. 훈련 후 15분 후에는 CS+에 대한 칼슘 반응이 현저히 저하되고 CS-가 강화되었기 때문에 유사한 결과가 나타났습니다. 이러한 결과는 두 냄새에서 관찰된 기억 추적이 최소 15분 동안 지속됨을 나타냅니다(그림 2D-F). 이러한 반응은 5초 펄스 동안의 평균 냄새 반응을 사용하여 정량화되고 플라이 내에서 비교되었습니다. 이러한 냄새 반응의 변화는 GCaMP6 형광 전후 혐오 교육의 변화를 의사 색상으로 표현하여 시각화할 수도 있습니다(그림 2E). 대조적으로, 준비 중 파리를 마취하면 CS+와 CS- 모두에 대한 가소성이 감소하는 것으로 나타났습니다. CS+에 대한 부분적인 우울증만이 마취된 동물에서 관찰되는데, 이는 훈련 후 반응이 여전히 존재하기 때문입니다. 또한 CS- 반응은 훈련 후에도 크게 다르지 않습니다(그림 2G,H). 이를 더 잘 관찰하기 위해 유도 가소성을 CS+/CS-의 비율로 계산하고 마취되지 않은 파리가 마취된 동물에 비해 가소성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2I). 이러한 대표적인 결과는 이 프로토콜이 현미경으로 학습과 기억을 연구하는 데 적합하며 장기간 뉴런에서 이미징하는 동안 파리의 건강을 보장한다는 것을 나타냅니다. 이 프로토콜은 충분히 다재다능하며 다른 유형의 생체 내 이미징 및 기타 관심 뉴런에 적용할 수 있습니다.

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그림 1: 마취제를 사용하지 않은 초파리의 생체 내 이미징 준비.(A) 상단 패널: 흡인기기 준비와 관련된 단계를 보여주는 다이어그램. 하단 패널: 플라이 포지셔닝 중 micromanipulator에 유지된 챔버를 보여주는 다이어그램. 파리의 주둥이는 흡인기(aspirator)를 사용하여 500mL/분의 속도로 진공에 연결된 금속 튜브의 입구에 놓습니다. 챔버는 이후에 플라이 위에 위치합니다. (B) 눈과 흉부의 측면은 맞춤형 백금 저항기를 사용하여 미리스틱 산으로 접착됩니다. (C) 금속 튜브에서 파리의 주둥이를 제거하고 주둥이를 제자리에 붙일 수 있도록 챔버를 뒤집어 녹음 중 움직임을 최소화합니다. (D) 챔버는 유리 슬라이드 베이스에 부착됩니다. 테이프는 챔버 상단에 적용되어 안테나를 덮고 뒷면에는 식염수가 누출되는 것을 방지합니다. (E) 겹눈 근처의 큐티클을 따라 두 개의 수직 절단이 이루어진 다음 흉부 근처의 큐티클을 가로질러 세 번째 절단하여 뇌에 대한 "창"을 만듭니다. (F) 100-200 μL 사이의 식염수를 절단 부위의 파리 머리에 첨가합니다. (G) 뇌를 노출시키기 위해 날카롭고 가는 집게를 사용하여 큐티클 창을 들어 올리고, 당기고, 분리한다. (H) 지방과 기관 조직을 제거하여 현미경으로 뇌 세포를 명확하게 시각화할 수 있습니다. (I) 준비된 플라이를 현미경 아래에 놓고 몸체를 쇼크 그리드 상단에 정렬하도록 배치합니다. (J) MBON γ2α'1의 발현 패턴을 보여주는 의사 색상 이미지. 관심 영역은 수지상 아버를 둘러싼 점선으로 윤곽이 그려져 있습니다. 눈금 막대 : 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 혐오적 후각 조건화에 따른 MBON γ2α'1의 학습 유도 가소성. (A) GCaMP를 표현하는 MB077C-splitGal4 드라이버의 표현 패턴. 뇌를 해부하여 anti-GFP로 염색하고 anti-nc82로 대조염색했습니다. 눈금 막대 : 50 μm. (B) 세포체, 확장 과정 및 수지상 아버를 강조하는 MBON γ2α'1의 의사 색상 이미지. 수지상 영역은 칼슘 반응이 수집된 영역을 나타냅니다. 눈금 막대 : 50 μm. (C) 혐오적 훈련 프로토콜의 개략도. 파리는 MCH 및 OCT의 5초 펄스에 노출되었으며 그 사이에 30초의 깨끗한 공기가 노출되었습니다. 5분 간격 후, 파리는 OCT를 12개의 90V 전기 충격과 연관시키도록 훈련되었습니다. MCH 및 OCT에 대한 칼슘 반응의 기록은 훈련 후 5분 및 15분에 수행되었습니다. (D) MCH(상단 패널) 및 OCT(하단 패널)에 대한 냄새 반응 추적은 사전 교육과 교육 후 5분 및 15분에 표시됩니다. 두꺼운 검은색 막대는 냄새가 나는 시기를 나타냅니다. (E) MCH 및 OCT에 대한 반응으로 MBON γ2α'1 사전 훈련 및 5분 및 15분 훈련 후 수상돌기 아버의 유사 색상 이미지. 형광의 강화는 CS-(MCH)에 대해 관찰되는 반면 형광은 CS+(OCT)에 대해 폐지됩니다. 스케일 바: 20μm. (F) MCH에 대한 평균 냄새 반응은 훈련 후 5분 및 15분에 유의하게 강화되는 반면 OCT(CS+)에 대한 반응은 크게 억제됩니다. 비모수 Wilcoxon 쌍체 검정, N = 12. (G) MCH(상단 패널) 및 OCT(하단 패널)에 대한 냄새 반응 추적은 훈련 전 및 훈련 후 5분 동안 마취된 파리에 대해 표시됩니다. 두꺼운 검은색 막대는 냄새가 전달됨을 나타냅니다. (H) 마취된 동물에서 MCH에 대한 평균 냄새 반응은 훈련 후 상당한 강화를 나타내지 않으며 OCT에 대한 반응은 마취되지 않은 동물에 비해 부분적인 억제만 나타냅니다. (I) CS+/CS- 비율로 계산되는 훈련에 의한 가소성은 마취 없이 준비된 파리에 비해 마취된 파리에서 현저히 낮다. 비모수 Wilcoxon 쌍체 검정, N = 8-12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: Grid_holder(STL). 전기 그리드를 유지하는 데 사용되는 맞춤형 설계 구성 요소의 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: Grid_holder (OBJ). 전기 그리드를 유지하는 데 사용되는 맞춤형 설계 구성 요소의 OBJ 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: Chamber_LaserCut. 어도비 일러스트 레이터 파일은 수컷과 암컷 파리 모두의 기록 챔버의 상단 구성 요소를 레이저로 절단하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: Recording_chamber (STL). 맞춤형으로 설계된 녹음실의 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 5: Recording_chamber (OBJ). 맞춤형으로 설계된 녹음실의 OBJ 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 6: Recording_chamber_animation. 조립된 녹음실의 애니메이션을 보여주는 MP4 비디오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

학습과 기억 뒤에 있는 신경 회로를 이해하는 것은 신경 과학 분야의 핵심 목표입니다. 초파리에서 사용할 수 있는 유전자 툴킷은 행동 검사의 단순성 및 다양성과 결합되어 이러한 과정을 연구하는 데 이상적인 모델 유기체입니다. 다양한 실험실에서 발표된 연구에서는 마취를 사용하지 않고 기능적 영상 촬영을 위해 파리를 준비하기 위한 다양한 프로토콜을 설명했습니다 44,45. 그러나 이러한 프로토콜은 매우 다양하며 구축 또는 사용 방법에 대한 지침이 제한된 고도로 전문화된 맞춤형 도구에 의존하는 경우가 많습니다. 이 프로토콜에서는 전신 마취의 교란 효과를 피하는 파리에서 생체 내 기능 이미징을 수행하는 방법이 제시됩니다. 또한 이 접근 방식을 사용하면 동일한 플라이 내에서 실시간 뉴런 활동을 캡처할 수 있으므로 다양한 자극에 노출되기 전과 후의 신경 반응을 직접 비교할 수 있습니다.

이 프로토콜을 완료할 때 중요한 단계에는 파리의 주둥이가 진공 튜브에 제대로 배치되었는지 확인하는 것이 포함됩니다. 이 단계는 후속 접착이 올바른 지점에서 발생하도록 하고 머리가 관심 있는 뉴런을 시각화할 수 있는 올바른 각도에 있는지 확인합니다. 파리의 건강을 유지하기 위해 최소한의 접착제 도포가 필수적입니다. 플라이를 제자리에 고정하는 데 필요한 최소한의 양을 사용하는 것이 이상적입니다. 이 프로토콜은 또한 몸 전체가 자유롭도록 눈의 옆면만 붙이는 것과 같이 특정 요구 사항에 맞게 일부 수정을 허용합니다. 유사하게, 관류 챔버는 링거 관류 또는 약물 전달을 용이하게 하기 위해 기록 챔버의 상단에 부착될 수 있습니다. 마지막으로, 회전하는 플로팅 트레드밀은 이전에 보고된 바와 같이 플라이 아래에 배치되어 운동 방향성46,47을 분석할 수 있습니다.

이 프로토콜에는 생체 이미징을 위해 파리를 준비하기 위해 미세 수술 중에 파리가 받는 스트레스를 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 작은 파리를 다루고, 접착제를 조금씩 바르고, 뇌 조직이나 신체를 손상시키지 않고 머리 캡슐을 조심스럽게 열려면 상당한 전문 지식이 필요하며, 이는 세심한 연습과 반복을 통해서만 얻을 수 있습니다. 이 방법은 세포 수준에서 인지 과정을 연구하는 데 특히 유용하지만, 생체 내 이미징은 전기생리학적 기록과 비교할 때 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 또한, 당사의 프로토콜은 이미징 전에 마취를 사용하지 않지만, 파리는 여전히 물리적 챔버에 국한되어 있어 항상 세포 반응을 변화시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 당사의 방법론은 최적의 생체 내 이미징을 위해 파리의 건강을 보존할 수 있는 가장 가까운 방법을 제공합니다. 마취를 사용하고 파리를 제한하는 기존 방법과 비교하여, 우리의 방법은 최소한의 움직임으로 세포에서 이미지를 얻을 수 있으면서도 파리가 가능한 한 자유롭게 움직이도록 하는 것을 목표로 합니다.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 1R01GM147917-01A1에 대한 National Institute for General Medical Science와 30442에 대한 Brain and Behavior Research Foundation의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.102 mm 백금 와이어Surepure Chemetals2690
0.25 OD, 0.125 ID, 백금 경화 실리콘 튜브VWR89068-474
0.3 mm ID 실리콘 튜브 피셔 사이언티픽11-189-14
바나나 플러그아마존
블랙 아크릴 시트 챔버 0.0125 정밀브랜드44250
염화칼슘시그마-알드리치746495
구리 충격 그리드
DC 전원 공급 장치피셔 사이언티픽S35740
드레멜 도구 3000-1드레멜3000-N/18
초파리 멜라노가스터 / ;; uas-tdtomBDSC36328
초파리 멜라노가스터 / ; UAS-GCp6F;BDSC42747이 uas 라인은 ;; uas-td-tom은 두 삽입물을 모두 포함하는 스톡을 생성합니다.
파리 멜라노가스터/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
에폭시 접착제 Gorilla4200102
가스 유량계 1.5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
유리 1 mL 혈청학적 피펫 Fisher Scientific50-232-9516
유리 슬라이드Fisher Scientific 12-550-A3
포도당시그마-알드리치G7528
HEPES시그마-알드리치H4034
피하 12TW 게이지 튜브마이크로 그룹316H12TW
하 22X 게이지 튜브마이크로 그룹304H22X
염화 마그네슘 육수화물그마 알드리치M9272
Myristic AcidAcros Organics156961000
네오디뮴 자석 3X2mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 팁Genesee Scientific 23-165RL
P200 팁Genesee Scientific 23-150RL
공압 푸시 커넥터 6mm OD마존B07ZHG8Y1Y
염화칼륨시그마-알드리치P3911
PTFE 튜브 6mm OD아마존
면도날 아마존B08LYD6645
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761
염화나트륨피셔 사이언티픽S271-500
인산나트륨 이염기성시그마-알드리치S0876
자당시그마-알드리치S9378
트레할로스시그마-알드리치T0167
백금 저항기용 맞춤형 초 피 시 아

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