토끼 모델에서 유방암 예방을 위한 관내 에탄올 기반 절제 주입의 X선 시각화

유방암(BC)은 미국에서 여성에게 가장 흔하고 두 번째로 높은 암 관련 사망입니다. 2025년 예측에 따르면 316,950건의 새로운 유방암이 발생하고 42,170명의 여성이 BC¹로 사망할 것으로 추정됩니다. 현재 양측 예방적 유방절제술은 BC를 예방하는 가장 효과적인 절차입니다. 그러나 이것은 유방암이 발생하는 상피 세포와 주변 조직을 완전히 제거하는 매우 침습적인 절차입니다. 침습성과 이 절차의 심리적, 사회적 영향으로 인해 고위험 여성의 50% 미만이 위험 감소 유방 절제술을 받습니다². 우리와 다른 사람들은 현재의 예방 및 치료에 대한 대안으로 설치류 모델 ^2,3에서 유방암의 1차 예방 및/또는 국소 치료를 위한 관내(ID) 전달 절차를 개발했습니다. 에탄올(EtOH)은 독성이 낮고 안전성이 낮아 잘 확립되어 있으며 정맥 기형 치료를 위한 경화제 및 일부 암의 국소 치료를 위한 절제제와 같은 여러 임상 응용 분야에 사용됩니다³. 일반적으로 이러한 임상 절차에서 몇 밀리리터의 EtOH가 90-100% 농도로 주입되거나 전달됩니다. 이전 연구에서 70% EtOH를 마우스 및 쥐 모델의 관 트리 시스템에 직접 전달하는 것은 인접한 정상 조직에 대한 손상이 제한된 유방 상피 세포를 화학적으로 절제하고 유방 종양 형성을 예방하는 데 효과적이었습니다 ^4,5,6,7. 이 절차가 내강 상피 세포 표면적 비율이 더 큰 토끼의 더 큰 덕트 트리 시스템으로 확장됨에 따라 EtOH 비율이 더 낮은(10% 내지 70%) 용액의 절제 특성을 탐색합니다. 임상 번역을 살펴보면, 상피 세포 절제에 효과적인 에탄올의 비율이 가장 낮을 것이 가장 내약성이 좋고 안전성 프로필이 가장 좋을 것이라고 추론합니다.

절제 용액이 유방 상피 세포와 직접 접촉했는지 확인하기 위해서는 완전한 관 트리 충전의 확인이 필요합니다. 설치류 모델에 대한 이전 연구에서는 시술 후 microCT 영상에 의한 주입된 관 나무의 X선 시각화를 사용했습니다. 이미징을 위해 동물을 마취, 옮기고, 설정하고, 배치하는 데 필요한 시간 경과로 인해 FDA 승인 Omnipaque(iohexol) 또는 유사한 요오드 함유 속확산 조영제는 설치류의 관 나무 시각화에 적합하지 않았습니다 ^6,8. 우리는 나노입자 기반 조영제, 특히 탄탈륨 산화물 나노결정을 포함하는 조영제가 확산 속도가 느리고 설치류의 관 나무 시각화에 더 적합하다는 것을 발견했습니다 6,7,8,9. 그러나 microCT 영상에 의한 이러한 사후 확인은 주입된 부피의 양을 모니터링하거나 제어할 수 없으며 관 트리 시각화를 위해 덕트 조영술^10,11과 같이 임상적으로 확립된 진단 절차에서 벗어납니다. 따라서 이 ID 절차를 인간에게 번역하는 기술적 타당성을 확립하기 위한 핵심 단계는 유선의 크기와 복잡성이 증가하는 동물 모델에서 주입된 관 나무의 실시간 형광투시 시각화를 시연하는 것입니다. 이 프로토콜은 설치류 ^4,5에서 토끼 모델로 이 절제 절차를 확장합니다. 진화적, 해부학적, 생리학적으로 토끼 유선은 설치류나 소와 양과 같은 다른 대형 동물 모델의 유방보다 인간의 유방과 더 유사합니다 12,13,14. 암컷 토끼는 4쌍의 유선을 가지고 있으며 각 유선에는 4개의 관 나무가 있는 반면, 설치류는 유선당 하나의 관 나무만 가지고 있습니다. 토끼 젖꼭지는 인간 최초의 임상 연구에서 임상 도관 조영술에서 조영제의 ID 투여와 유사한 절차를 사용하여 캐뉼라를 삽입할 수 있습니다^15,16. 따라서 토끼는 이 ID 절제 절차를 인간에게 번역하기 위한 실용적이고 관련성 있는 중간 대형 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 설치류 모델에서 해결할 수 없었던 ID 전달 및 다관 트리 시스템의 생체 내 이미징의 기술적 문제를 해결합니다. 이 프로토콜은 관 나무의 시각화를 위해 현재 임상 실습과 호환되는 기기, 시약 및 재료를 사용합니다. 따라서, iohexol 함유 에탄올 기반 절제 용액의 형광투시 유도 주입에 대해 설명된 절차는 최초의 인간 임상 시험에서 쉽게 구현되고 평가될 수 있습니다.

이 방법은 토끼의 하나 이상의 유선에 있는 4개의 관 트리 모두에 조영제를 함유한 에탄올 기반 절제 용액을 단일 세션에서 성공적으로 캐뉼라하고 순차적으로 주입하기 위해 우리 실험실에서 구현되었습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3). 이 방법은 형광투시 테이블에 토끼(4개월 처녀)의 27G 뭉툭한 바늘을 사용하여 캐뉼라가 있는 젖꼭지 개구부에 절제 용액을 직접 주입하는 것입니다. 이 절차는 전신 마취(이소플루란) 하에 시술 전후 항염증 치료(케토프로펜, 비스테로이드성 항염증제)와 함께 동물에게 수행됩니다. 형광투시 이미징을 통해 관 트리의 충전을 실시간으로 모니터링하고, 분배량의 속도와 양을 제어하고, 각 개별 트리 시스템에서 ID 전달이 얼마나 성공적인지 결정할 수 있습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3). 이 형광투시 기술은 절제 치료의 이미지 유도를 위해 의도된 임상 적용에 더 가깝고 환자에게 부과되는 전체 방사선량을 제한하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 FDA 승인 Omnipaque(iohexol)가 토끼관 나무의 초기 충전을 시각화하는 데 적합한 조영제임을 보여줍니다(그림 3). 육안적 검사 및 조직학적 분석을 통한 관찰은 70%의 에탄올 농도가 관 나무 안팎에서 급격한 조직 손상을 일으키고 유선 구조를 넘어 확장되는 것을 보여줍니다(그림 3). 10-40% 범위의 에탄올 농도는 70% 에탄올보다 부수적인 조직 손상이 적은 적절한 상피 세포 절제를 제공합니다(그림 4). 절제 용액당 적절하게 강화된 그룹 크기 및 시간 제한 조직 수집으로 이 절차를 사용하는 종단 연구는 인간 환자의 임상 평가를 위한 절제 용액의 최적 매개변수를 설정하는 데 필요합니다.

설명된 모든 실험은 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 토끼(Oryctolagus cuniculus)는 AAALAC 인증 시설에서 실험 동물 관리 및 사용 가이드 및 USDA 동물 복지법에 따라 보살핌을 받았습니다.

참고: 이 방법은 상업적 출처에서 얻은 연령(4개월에서 > 1세) 및 체중(2.6-4.2kg)에 이르는 처녀(미산부) 및 은퇴한 사육자(다산) 뉴질랜드 백색 동물에서 수행되었습니다. 우리의 경험에 따르면 젖꼭지의 크기를 예측하는 데 체중으로 결정되는 동물의 크기가 동물의 나이보다 더 신뢰할 수 있습니다. 일반적으로 체중이 3.3kg 이상인 동물은 캐뉼라 삽입에 적합한 젖꼭지를 가지고 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 생후 4-5개월이고 체중이 3.3kg 이상인 처녀 동물에 초점을 맞추고 있으며, 이는 장기 효능, 상처 치유, 독성 및 안전성 연구에 더 적합하기 때문입니다.

1. 수술 전 준비

1. 특히 회복 절차 및 장기 연구를 위한 동물의 경우 도착 후 최소 1주일 동안 새 시설에서 동물을 적응시킵니다. 이 첫 주 동안 토끼를 매일 모니터링/확인하고 적응 과정을 돕기 위해 기관 지침에서 권장하는 대로 간식, 영양 강화를 공급하십시오.
2. 승인된 주거 시설에서 토끼(~ 4개월 된 뉴질랜드 화이트)를 구입하십시오. 시술 전에 체중을 기록하십시오.
   참고: 마취에 필요한 계산을 준비하기 위해 시술 전날 체중을 기록할 수 있습니다. 은퇴한 육종가(1세 >, > 3.5kg)도 젖꼭지가 더 크고 개별 관을 더 쉽게 캐뉼라 삽입할 수 있으므로 사용할 수 있습니다(그림 3). 이러한 이유로 은퇴한 육종가는 관내 절차에 익숙해지고 최적화하기 위해 초기 실험에 사용될 수 있습니다.
3. 이소플루란 투여 20분 전에 케타민 35mg/kg과 자일라진 5mg/kg을 근육주사하여 동물을 진정시킵니다.
   참고: 마취는 토끼의 체중에 따라 시행되며 각 약물의 범위는 케타민의 경우 15-35mg/kg, 자일라진의 경우 2-5mg/kg입니다. 제모 및 삽관을 진행하기 전에 동물이 진정제를 투여받았는지 확인하십시오. 이는 동물과 직원의 복지와 안전을 위한 것입니다. 진정 확인이 된 후 토끼를 영상/수술대에 등쪽으로 놓을 수 있습니다.
4. 진정의 임상 징후(즉, 조용한 태도, 부분적으로 감겨 있고 분홍색 눈)가 나타난 후 진통을 위해 케토프로펜 5mg/kg을 피하 주사합니다.
   참고: 진통제는 토끼의 체중에 따라 투여되며 케토프로펜의 범위는 2-5mg/kg입니다.
5. 적절한 장비(예: 기관내관 또는 성문상 기도 장치)로 토끼를 삽관하고 토끼를 마취하도록 적절하게 테스트되고 인증된 이소플루란 기계(1-2% 이소플루란, 1.0L/min 산소)에 연결합니다. 동물의 호흡을 주의 깊게 모니터링하여 마취가 이소플루란의 1-2%로 유지되는지 확인하십시오. 절차 전반에 걸쳐 SpO₂, 심박수, 호흡수 및 체온을 통해 토끼의 산소 포화도를 모니터링합니다.
   알림: 삽관 튜브의 크기는 토끼의 체중과 크기를 기준으로 합니다. 그러나 크기 범위가 항상 정확한 것은 아니므로 특정 토끼에게 가장 잘 맞는 크기를 확인하기 위해 다양한 크기를 갖는 것이 도움이 됩니다. 노즈콘 마스크는 마취 목적으로 기관내관 대신 사용할 수도 있으며¹⁷, 이 마스크는 삽관에 의해 제공되는 동물의 기도를 보호하지 않는다는 점을 알고 있습니다. 토끼의 체온을 유지하기 위해 수건 아래에 37°C로 설정된 온수 순환 담요(보온 담요)를 놓습니다.
6. 응급 약물 투여가 가능하도록 25G 정맥 카테터를 변연 귀 정맥에 배치하고 고정합니다.
   알림: 토끼 정맥의 크기에 따라 24에서 26의 게이지 범위를 사용할 수 있습니다.
7. 눈 자극과 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 윤활제를 바르십시오.
8. 전기 면도기로 두 번째와 세 번째 젖꼭지 주변의 털을 면도하십시오. 면봉 어플리케이터를 사용하여 젖꼭지 부위에 제모 크림을 발라줍니다. 크림이 해당 부위에 15초 동안 닿도록 합니다.
   알림: 면도기로 젖꼭지가 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. 무선 진공청소기는 깨끗한 시술 부위를 유지하는 데 도움이 될 수도 있습니다.
9. 거즈 패드를 멸균 식염수로 적시고 제모 크림을 바르고 15초 동안 동물의 털을 풀어주는 데 사용합니다. 모피를 제거한 젖꼭지 영역에 대한 가시성과 접근성이 좋은지 확인하십시오. 필요한 경우 반복합니다.
   알림: 크림은 토끼에게 10-30초 사이의 가능한 한 짧은 간격으로 남아 있어야 하며 피부에 화학적 화상을 입지 않도록 완전히 제거해야 합니다.

2. 관내 주입

1. BSL2 조직 배양 후드에서 멸균 조건에서 원액에서 적절한 부피를 혼합하여 절제 용액을 준비합니다.
   참고: Iohexol(350mg 요오드/mL)은 빛에 민감하기 때문에 어두운 곳에 보관해야 합니다. 이 실험 동안 다양한 EtOH 농도가 사용되었습니다. EtOH의 다른 비율을 테스트하려면 원액을 필요한 농도의 절제 용액으로 희석합니다. 다른 비율의 EtOH, PBS 또는 멸균수로 절제 용액에서 동일한 농도의 요오드를 유지하기 위해 부피 차이를 채울 수 있습니다.
2. 이 예에서는 5mL 튜브에 10% EtOH, 280mg 요오드/mL iohexol, 1% 식용 염료의 신선한 절제 용액을 준비합니다. 최종 부피 5mL의 경우 4mL의 iohexol 스톡(350mg 요오드/mL), 500μL의 100% EtOH(200 프루프), 450μL의 PBS, 50μL의 스톡 블루 식용 색소를 추가합니다.
   참고: 각 관 트리는 최대 400μL로 채울 수 있지만 일반적으로 3.5kg 미만의 동물의 경우 250-350μL입니다. 식용 염료 대신 최대 0.2%의 Evans Blue를 사용할 수 있습니다. Evans Blue는 주입 직후 전체 마운트 또는 기타 조직 분석을 의도하는 경우 선호되는 옵션이 될 수 있습니다.
3. 미세하고 뾰족한 집게로 관 개구부를 덮고 있는 각질을 제거합니다.
   알림: 토끼는 젖꼭지에서 각질화된 플러그가 돌출되어 제거하지 않으면 성공적인 캐뉼라 삽입을 방해할 수 있습니다. 국소 리도카인은 주사 부위 주변의 자극을 최소화하는 데 도움이 되도록 젖꼭지 주위에 도포할 수도 있습니다(표 1).
4. 클로르헥시딘 거즈 패드로 주입 부위를 닦습니다.
   참고: 클로르헥시딘은 캐뉼라 삽입 전에 주사 부위를 소독하기 위한 세척제로 사용됩니다(표 1).
5. 28G 바늘(길이: 12.7mm)의 경사를 젖꼭지 측면에 삽입하고 200μL의 0.9% 식염수를 200μL/min의 속도로 천천히 주입합니다. 이를 통해 덕트 개구부를 더 잘 시각화할 수 있습니다.
   참고: 200μL의 식염수를 모두 젖꼭지에 주입해야 하는 것은 아닙니다. 하나 이상의 관 개구부에서 식염수가 나오는 것을 보면 주사를 중지하십시오.
6. 1mL 루어 잠금 주사기를 사용하여 준비된 절제 용액 1mL를 흡인합니다. 12인치 남성-여성 연장선의 여성 "날개 달리는" 끝에 주사기를 부착합니다. 27G 뭉툭한 끝 바늘(길이: 12.7mm)을 연장선의 수 끝에 조심스럽게 부착합니다. 솔루션으로 라인을 프라이밍하십시오. 알코올 거즈 패드로 바늘을 깨끗이 닦아냅니다. 또한 주사기에 절제 용액을 기울이면 기포가 형성될 수 있으므로 주의하십시오.
   참고: 이들은 관 트리(들)를 완전히 채우는 것을 목표로 하는 권장 부피입니다: 각 나무에서 최대 300 μL, 경추 및/또는 사타구니 유선(1^번째 및 4^번째 쌍)당 최대 1.2 mL, 각 나무에서 최대 400 μL 및 흉부 및/또는 복부 유선(2^번째 및 3^번째 쌍)당 최대 1.6mL. 다른 응용 분야의 경우 덕트 트리를 과도하게 채우는 것을 방지하기 위해 실험 요구 사항 및/또는 형광투시 지침에 따라 더 작거나 더 큰 부피를 사용하는 것이 적절할 수 있습니다. 확장 라인을 사용하면 유속을 더 많이 제어하고 동시 주입 및 라이브 형광 투시 이미징을 할 수 있습니다. 비교를 위해, 9-12주령 마우스 모델⁴ 에서 권장되는 관내 주입량은 자궁경부 및 사타구니에서 최대 30 μL, 흉부 및 복부 유선에서 최대 50 μL, 쥐 모델⁵: 자궁경부 및 사타구니에서 최대 100 μL, 흉부 및 복부 유선에서 최대 300 μL이다.
7. 10배 확대 램프를 사용하여 덕트 개구부를 찾는 데 도움이 됩니다. 손가락을 사용하여 젖꼭지를 부드럽게 잡고 바늘을 관 구멍에 캐뉼라를 삽입합니다. 팁이 젖꼭지 안에 완전히 들어갈 때까지 27G 뭉툭한 끝 바늘을 부드럽게 계속 삽입합니다. 젖꼭지에 바늘을 넣으려면 젖꼭지를 젖꼭지 쪽으로 밀어 넣는 대신 젖꼭지를 바늘 쪽으로 가져옵니다. 덕트 개구부의 경로를 따라가도록 주의하십시오.
   알림: 일부 토끼의 경우 젖꼭지 구멍에 바늘을 삽입하려고 할 때 저항을 느낄 수 있습니다. 조심스럽게 약간의 압력을 가하여 상단 상피 세포층을 뚫습니다. 우리의 경험에 따르면 캐뉼라 삽입을 위한 관 개구부를 명확하게 식별하려면 확대 장치가 필요합니다. 이것은 돋보기, 렌즈, 확대경 또는 이와 유사한 장치일 수 있습니다.
8. 바늘이 완전히 삽입되면 약 200μL/min의 일정한 속도로 300μL의 용액을 천천히 주입합니다. 주입 후 30초 동안 기다렸다가 캐뉼라 나무에서 바늘을 제거합니다. 이렇게 하면 주입된 부피가 관트리 내에 유지되고 누출 가능성이 줄어듭니다.
   참고: 일반적으로 한 명의 연구원이 캐뉼라를 삽입하고 바늘을 잡고 두 번째 연구원이 주사기를 잡고 플런저를 원하는 속도로 밀어 넣습니다. 주입 속도의 급격한 변화로 인해 관 나무가 파열되거나 손상될 수 있으므로 주사기 펌프를 사용하여 유량을 보다 제어할 수 있습니다.
9. 이미지에 외부 조영제 용액이 들어가지 않도록 적신 거즈 또는 EtOH 물티슈로 엎질러진 용액을 닦아냅니다.

3. 형광투시 영상

1. 각 관 트리를 주입한 후 형광투시 이미지를 촬영합니다. 형광투시의 매개변수는 형광투시 X선 기기에서 30fps, 67kV 및 17.3mA입니다. 그러나 실험 및 이미징 요구 사항에 따라 이를 조정하십시오.
2. 형광투시 이미지를 사용하여 관 트리를 완전히 채우기 위해 추가 부피가 필요한지 여부를 결정합니다.
   참고: 형광투시 영상은 절제 용액의 주입과 동시에 실시간으로 이루어질 수 있습니다. 유해한 엑스레이로부터 직원을 보호하기 위해 이미징이 진행되는 동안 금속 또는 플라스틱 겸자를 사용하여 젖꼭지를 고정할 수 있습니다. 이를 통해 덕트 트리의 충전을 모니터링할 수 있습니다. 라이브 형광투시법은 폐포 말단의 증가된 부피를 기반으로 주입을 중단할 시기를 안내할 수 있습니다. 주입 후 형광투시를 통해 관트리가 완전히 채워졌는지 또는 누출이 있었는지 확인할 수 있습니다. 확증적 형광투시법은 일반적으로 동일한 유선 내에서 각 덕트를 주입한 후에 수행됩니다.

4. 수술 후 관리 및 회복

1. 마지막 관내 주입 후 이소플루란의 흐름을 중단하십시오.
2. 0.5mg/kg의 아티파메졸을 근육 주사합니다.
   참고: 회복 시간은 동물마다 다르지만 토끼는 주사 후 5-20분 후에 회복 징후를 보이기 시작해야 합니다.
3. 마취에서 완전히 회복될 때까지 따뜻한 담요 위에서 동물에게 지속적인 열 지원을 제공합니다. 마취에서 제거하기 전에 최대 5분 동안 산소 흐름을 유지합니다.
   알림: 회복의 징후에는 씹기, 기침, 코 경련 및/또는 안구 운동과 같은 입 움직임이 포함됩니다. 토끼는 교정 반사가 있어야 하며 회복 캐리어에 다시 배치하기 전에 흉골 위치를 유지할 수 있어야 합니다. 회복제는 토끼의 체중에 따라 0.1-1 mg/kg 아티파메졸 범위로 투여됩니다.
4. 케토프로펜 5mg/kg을 피하 주사합니다.
5. 토끼가 흉골 자세를 유지할 수 있게 되면 정맥 카테터를 제거합니다. 과도한 출혈을 멈추기 위해 카테터를 제거한 곳에 거즈 패드를 잡습니다.
   알림: 카테터 제거는 토끼가 운송 캐리어에 있을 때 수행할 수 있습니다.
6. 토끼를 적절한 사육 시설로 다시 운반하십시오.
7. 시술 후 최소 3일 동안 5mg/kg의 케토프로펜을 피하 주사를 계속합니다.
8. 시술 후 최소 3일 동안 하루에 한 번 토끼의 불편함, 고통, 통증 및 자해의 징후가 있는지 모니터링합니다. 토끼가 이러한 임상 징후 중 하나라도 나타나면 케토프로펜 치료를 연장할 수 있습니다. 거식증의 징후를 평가하기 위해 체중을 기록하고 모니터링합니다.
   참고: 케토프로펜은 토끼의 체중을 기준으로 2-5mg/kg 범위로 투여됩니다. 염증을 줄이고 흉터를 최소화하기 위해 관내 주입 후 최대 5일 동안 24시간마다 투여할 수 있습니다. 피부 궤양 또는 기타 상처 치유 관련 문제의 부작용을 최소화하려면 주사 부위에 리도카인을 국소적으로 바르십시오. 케토프로펜 치료 후 불편함, 고통, 통증 또는 부상의 지속적인 징후를 보이는 모든 동물은 안락사시켜야 합니다.

5. 조직 분석

1. 안락사 용액(펜토바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨)을 100mg/kg으로 정맥 주사합니다. 60초 후에는 발가락/귀를 꼬집는 것, 호흡 또는 심장 박동의 징후, 각막 반사 및/또는 동공 자극으로 생명의 징후를 확인합니다.
2. 부검을 수행하여 유선 조직을 얻고 10% 중성 완충 포르말린¹⁸에서 24-36시간 후에 일상적인 파라핀 포매 절차를 처리합니다. 그런 다음 원하는 분석 판독값을 지원하기 위해 세포 유형 특이적 마커로 표준 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및/또는 면역조직화학적 염색을 수행합니다¹⁸. 적절한 폐기 프로토콜(예: 소각)을 통해 시체를 폐기하십시오.
3. 병리학자와 상의하여 유선 조직을 분석하십시오. 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 절제율 및 부수적 조직 손상의 정량화를 지원합니다.
   참고: 조직 분석은 생체 이미지 분석용 QuPath Open 소프트웨어(https://qupath.github.io/)를 사용하여 주입 후 1시간 이내에 4개월 된 뉴질랜드 흰 토끼에 대해 수행되었습니다(그림 4). 이 분석은 H&E 염색 조직만을 기반으로 합니다. QuPath 또는 유사한 컴퓨터 소프트웨어는 병리학자의 입력 및 보정이 필요합니다. 일부 세포는 형태학적 특징만을 사용하여 잘못 분류될 수 있습니다(그림 4). 사이토케라틴 및 α-평활근 액틴과 같은 세포 유형 특이적 마커를 사용하여 컴퓨터 지원 분류를 개선할 수 있습니다⁶. 궁극적으로 세포 분류 분석은 병리학자가 선별하고 검증해야 합니다.

암컷 토끼의 8개 유선에는 각각 독립적인 젖꼭지 구멍에서 열리는 4개의 관 나무가 있습니다(그림 2). 설치류 간 유선당 관 나무의 크기와 수의 차이(유선당 1개의 관만)로 인해 토끼는 인간 번역을 위한 좋은 중간 모델입니다. 우리는 4개월 된 뉴질랜드 흰 토끼의 모든 유선의 전체 관 트리를 채우기 위해 최대 400μL의 10-70% EtOH 용액을 주입할 수 있습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4 4,8,9). 한 번의 세션에서 최대 4개의 유선에 있는 최대 8개의 관 나무에 절제 용액을 주입할 수 있습니다. 일반적인 실험 설계는 최대 4개의 유선에 있는 단일 유선 내의 2-3개의 관 트리에 요오드 기반 X선 조영제를 포함하는 특정 절제 용액을 주입하는 것으로 구성됩니다(그림 2, 그림 3). 이오헥솔 함유(요오드 90-300mg/mL) 절제 용액의 경우, 각 주입 중 및/또는 후에 형광투시를 수행하여 각 관 트리에 부분 또는 전체 양의 주입 용액을 주입하는 개별 성공 여부를 결정합니다(그림 2, 그림 3). 유선 조직을 수집하면 제형의 변화가 유방 상피 세포의 파괴에 어떤 영향을 미치는지 평가할 수 있습니다(그림 4). 이러한 이미징 분석은 주변 조직 손상을 최소화하면서 최대 절제를 달성하는 데 가장 적합한 솔루션을 이해하는 데 도움이 되는 정보를 제공합니다. 우리는 10% EtOH 용액이 더 높은 비율의 EtOH를 함유한 절제 용액과 비슷한 절제 속도를 제공한다는 것을 확인했습니다(그림 4).

그림 1: 관내 절차의 작업 흐름. ID 절차의 주요 단계가 강조 표시됩니다. 자세한 내용은 동영상을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 관내 캐뉼라 삽입 및 주입의 주요 단계. (A) 캐뉼라 삽입을 위한 관 개구부를 확장하기 위해 유두에 수직으로 식염수를 주입합니다(정중면 보기). (B) 관 나무(D1)의 캐뉼라 삽입 및 충전은 절제 용액(중앙평면 보기)에서 파란색 염료로 추적할 수 있습니다. (C) 실시간 형광투시 영상은 절제 용액에서 이오헥솔로 관 나무 충전(D1)을 정확하고 고해상도로 모니터링합니다(등쪽 평면도). 덕트 트리 개구부는 왼쪽에서 오른쪽으로 번호가 매겨져 있으며, 위쪽 사분면(D1, 왼쪽 위쪽 사분면)에서 시작하여 아래쪽 사분면(D4, 오른쪽 아래쪽 사분면)에서 끝납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 젖꼭지 크기 및 여러 관에 대한 절제 용액의 성공적인 전달. 뉴질랜드 흰 토끼의 젖꼭지 크기의 전형적인 표현. 젖꼭지 크기는 토끼의 체중과 나이에 따라 다릅니다. 유선은 왼쪽 상단(L1, 왼쪽 경추)에서 오른쪽 하단(R8, 오른쪽 사타구니)까지 번호가 매겨집니다. 모든 이미지는 등쪽 평면에 표시됩니다. (A) 유두가 작고 캐뉼라 삽입이 어려운 2.8kg 처녀 토끼(위), 캐뉼라 삽입에 적합한 젖꼭지가 있는 3.5kg 처녀 토끼(가운데), 유두가 더 큰 4.1kg 다산토끼(아래)로 캐뉼라 삽입이 훨씬 쉽습니다. (B) 주입된 용액의 파란색 식용 색소는 관내 전달 및 관 나무 충전의 생체 내 증거로 사용될 수 있습니다. 실패한 주입은 빨간색 윤곽선(지방 패드 전달, 상단)으로 표시되고 성공적인 주입은 파란색 윤곽선(관내 전달, 중간 및 하단)으로 표시됩니다. 70% EtOH 용액은 10% 용액(연한 파란색, 하단 패널)에 비해 주입 후 몇 분 후에 피부에 더 많은 손상(홍반)을 유발합니다(진한 파란색, 중간 패널). (C) 형광투시법은 관내 전달의 생체 내 증거를 제공합니다. 주입 실패(지방 패드 전달, 상단 패널). D1 관 첫 번째와 D2 관 트리 두 번째(왼쪽 하단 패널)의 성공적인 순차적 주입. 라이브 형광투시법은 D3 관 트리(오른쪽 하단 패널)의 충전(흰색 화살표)에 대한 이미지 지침을 제공합니다. iohexol 함유 절제 용액으로 채워진 연장선과 젖꼭지를 고정하는 겸자도 보입니다. 스케일 바는 다양한 배율의 이미지에서 1cm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 에탄올 기반 절제 용액을 사용한 관내 시술 후 뉴질랜드 흰 토끼의 유선 조직 분석. (A-B) 10% EtOH 절제 처리를 받은 다른 동물의 우측 사타구니 유선과 비교하여 절제 처리가 없는 4개월 된 동물의 우측 사타구니 유선의 대표적인 H&E 염색. 조직 조각은 정중면을 따라 절단되므로 D1 및 D3(왼쪽 관 트리)이 동일한 조직 절편에 표시됩니다. 전체 조직 보기(A) 및 고배율 보기(B)는 H&E 염색에 대한 EtOH 절제의 형태학적 및 색채학적 효과를 표시하고(상단 패널) 컴퓨터 지원 훈련 분류기(하단 패널)를 기반으로 추론된 상피 및 간질 세포 클래스를 표시합니다. 검은색 스케일 바는 A 에서 1mm에 해당하고 흰색 스케일 바는 B에서 100μm에 해당합니다. (C) 그래프 막대는 다양한 농도의 EtOH로 처리되거나 처리되지 않은 상태로 방치된 관 트리(그룹당 n > 4개)의 세포 클래스 분포를 표시합니다. 별표는 10% EtOH 처리 그룹의 일치하는 세포 클래스와 비교하여 그룹당 각 세포 클래스의 짝을 이루지 않은 Welch's t-테스트의 p-값을 나타냅니다(* <0.05, ** < 0.01, **** <0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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