이 프로토콜은 인간 황반과 유사한 망막 특징을 가진 원뿔 우세 종인 13-라인 땅다람쥐의 광운동 반응을 측정하는 방법을 설명합니다. 플랫폼 디자인은 핸들링을 향상시키고 불안을 줄여 동물이 올려진 플랫폼에 머무르는 능력을 향상시켜 시각 기능의 변화를 비침습적으로 평가할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
광운동 반사(OMR)는 동물의 대비 감도와 시력에 대한 행동 평가를 제공합니다. 생쥐나 쥐는 일반적으로 손으로 작은 원형 플랫폼에 직접 놓입니다. 그러나 이와 같이 동물을 다루면 스트레스와 불안이 자극되어 데이터를 해석할 때 교란 요인이 발생할 수 있습니다. 익숙한 터널/튜브에서 생쥐나 쥐를 집어드는 것과 같은 혐오감이 없는 취급 방법이 불안을 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다. 이는 동물이 스트레스, 과잉 활동 또는 운동 기능 장애가 높아져 플랫폼에 머물 수 없게 되는 연구에서 특히 중요합니다. Kiyoharu J. Miyagishima 박사와 Francisco M. Nadal-Nicolás 박사가 이끄는 팀은 반폐쇄형 격리를 제공하기 위해 기존 OMR 플랫폼을 재설계했습니다. 이를 통해 색을 볼 수 있는 몇 안 되는 포유류 중 하나인 13줄의 땅다람쥐의 시운동 반사를 처음으로 기록할 수 있게 되었습니다. 그것은 인간의 황반과 유사한 고밀도의 원뿔을 가진 시각적 줄무늬를 가지고 있어 원뿔 시각 시스템에 미치는 영향을 연구하기 위한 매력적인 모델을 제공합니다.
서론
땅다람쥐는 인간의 시각을 밀접하게 모방하는 주간 생활 방식과 원뿔이 우세한 망막으로 인해 시각 기능을 연구하기 위한 독특하고 가치 있는 모델을 제공합니다1. 이것은 영장류에 비해 사용의 실질적인 이점(더 작은 크기, 낮은 사육 비용)과 결합되어 망막 손상, 질병 또는 색각 변화에 대한 약물의 안구 부작용에 대한 중개 연구에 이상적인 모델이 됩니다 2,3,4,5,6. 망막 질환에 대한 전임상 연구는 동물이 볼 수 있는지 여부를 평가하는 능력에 의존합니다. 광운동 반사(OMR)는 마취 없이 동물의 시각 기능을 평가하기 위한 임상적으로 관련된 방법을 제공하여 시력을 정확하게 측정할 수 있습니다 7,8. 이 테스트에서 동물은 시선으로 회전하는 줄무늬 패턴을 따릅니다. 회전하는 줄무늬는 환경에서 전반적인 움직임에 대한 인식을 유도하여 비자발적 머리 움직임인 OMR을 유발합니다. 이 반사는 환경을 시각적으로 안정화하는 역할을 하며 자극의 공간적 주파수나 대비를 점진적으로 조정하여 동물이 얼마나 잘 볼 수 있는지 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 자극을 인식하기가 더 어려워질수록 결국 OMR이 트리거되지 않아 시력 또는 대비 역치를 결정할 수 있습니다. OMR의 장점은 반사적이라는 것입니다. 따라서 훈련이 필요하지 않으며 머리 고정이나 수술이 필요하지 않습니다. 이 반사는 아주 어린 동물(눈을 뜰 때)9,10에도 존재하므로 조기 발병 질병을 연구할 수 있습니다. 또한 비침습적이기 때문에 종단 측정이 가능하여 질병 진행을 추적할 수 있습니다.
대부분의 OMR 테스트는 회전하는 흑백 줄무늬 패턴을 표시하는 4개의 화면으로 둘러싸인 동물이 배치된 높은 플랫폼으로 구성된 맞춤형 또는 상용 시스템을 사용하여 수행됩니다. 줄무늬는 한 방향(시계 방향 또는 시계 반대 방향)으로 움직여 동물로부터 시각적 추적 반응을 유도하는 운동 자극을 생성합니다 10,11,12,13,14,15,16. 회전 자극에 대한 반응으로 동물의 시각적으로 유발되는 머리 움직임을 캡처하기 위해 테스트 경기장 위에 카메라가 장착됩니다. 이러한 머리 움직임을 추적하고 분석하여 동물의 움직임을 인식하고 반응하는 능력을 결정하여 시력을 평가합니다.
OMR은 생쥐와 쥐에서 일상적으로 사용되지만 13개 줄의 땅다람쥐의 광운동 반응 측정은 과잉 행동과 사전 컨디셔닝에도 불구하고 높은 플랫폼에 머물 수 없기 때문에 어려웠습니다. 이를 우회하기 위해 우리는 반봉쇄를 제공하여 동물을 경기장으로 쉽게 이동할 수 있는 플랫폼을 개발했습니다. 이 방법의 목표는 동물이 실험 환경에 적응하는 시간을 줄여 비협조적인 행동을 보이거나 플랫폼에 머무르는 데 어려움을 겪는 동물을 기록하고 연구에 동물을 포함시키는 것을 개선하는 것입니다. 또한 실험적으로 정의된 대비 설정을 사용하여 다람쥐의 시력을 측정하는 프로토콜을 정의하고 향상된 이미징 결과를 위해 카메라 설정을 조정하여 자동화된 분석 및 추적을 가능하게 했습니다.
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프로토콜
동물과 관련된 절차는 미국 법률과 농무부의 규정에 따라 수행되었습니다. 동물을 대상으로 한 모든 실험은 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립안과연구소(National Eye Institute)의 동물 및 관리 및 사용 위원회(Animal and Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 수컷 및 암컷 13줄 땅다람쥐(생후 6-8개월)는 위스콘신 대학교 오쉬코시 다람쥐 식민지에서 구입했습니다. 본 연구에 사용된 마우스(rd10: 1개월, CX3CR1GFP/+: 6.5개월)는 우리 동물 시설에서 사육되었습니다. 동물과 새장을 무작위로 선택하여 실험군에 배정했습니다.
1. 프로토타입 플랫폼 준비 및 수정된 핸들링 터널
참고: 원형 평면 플랫폼은 광운동 반응을 측정하도록 설계된 시스템에 일반적으로 사용됩니다13. 그러나 다람쥐와 같은 과잉 행동 설치류 모델은 이러한 플랫폼에서 안정성을 유지하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 이 디자인은 반밀폐된 공간을 제공하여 동물이 빠르게 습관화되고 불안과 같은 행동을 줄이는 데 도움이 됩니다. 이러한 개선은 동물의 집중 능력을 향상시키고 녹음 중 불균형이나 넘어짐을 최소화합니다.
- CAD 도면 소프트웨어(예: OpenSCAD 또는 FreeCAD)에서 그림 1과 같이 플랫폼(회색)과 인클로저(빨간색)를 설계합니다.
- 다람쥐 플랫폼의 주요 치수가 길이와 너비(L x W): 129mm x 81mm, 두께: 7mm, 둘레를 따라 확장되는 벽의 높이: 8mm로 유지되는지 확인합니다. 이 개념 증명 연구에 사용된 프로토타입 플랫폼(다람쥐)에 대해 제공된 무료 CAD 표준 문서 파일(보충 코딩 파일 1)을 사용하십시오.
- 탈착식 상단 격납장치(위에서 아래로 향하여)의 주요 치수가 길이(119.5cm) 및 너비(76.2cm), 측면 높이(50.8mm) 및 부품 두께(3mm)로 유지되는지 확인하십시오. 제공된 무료 CAD 표준 문서 파일을 사용하여 이 개념 증명 연구(보충 코딩 파일 2)에 사용된 탈착식 상단 인클로저(다람쥐)를 복제합니다.
- 플랫폼을 들어 올리는 데 사용되는 받침대에 맞게 필요에 따라 플랫폼 바닥의 관통 구멍 직경을 조정합니다. 사진의 직경은 40mm입니다.
- 흰색 불투명 필라멘트를 사용하여 플랫폼을 인쇄합니다. 이는 카메라에 최대 대비를 제공하여 추적 소프트웨어가 플랫폼에서 동물의 윤곽을 올바르게 감지할 수 있도록 합니다.
- 불투명한 어두운 필라멘트(예: 빨간색)로 탈착식 상단 인클로저를 인쇄합니다. 이는 설치류에게 피난처를 제공하여 설치류를 들어 올려 경기장으로 옮기기 전에 터널 안으로 쉽게 안내할 수 있습니다.
- 기계공에게 테이블 톱을 사용하여 아크릴 압출 투명 사각 튜브를 절단하여 긴 끝의 길이가 ~ 101.6mm가 되도록 합니다. 보호 안경과 푸시 스틱을 사용하여 칼날을 통해 아크릴을 안내하는 동시에 잠재적인 부상으로부터 손을 안전하게 보호하십시오.
- 테이블 톱 또는 연마 절단 휠이 장착된 휴대용 회전 도구를 사용하여 긴 직사각형 면 중 하나를 제거합니다. 이렇게 하면 위에 장착된 카메라가 동물의 위치와 머리 움직임을 방해받지 않고 볼 수 있는 열린 상단이 생성됩니다.
- 핸드 파일이나 사포로 모든 가장자리를 청소하십시오. 열린 면 위에 인클로저를 배치하여 3D 프린팅된 탈착식 상단 인클로저로 길이에 맞게 절단된 아크릴 압출 투명 사각 튜브를 사용하여 수정된 핸들링 터널을 조립합니다.
2. OMR 경기장 설정
- 원치 않는 후각 신호를 제거하기 위해 동물 전과 동물 사이에 클리너/소독제로 플랫폼과 사각 튜브 인클로저 어셈블리를 소독하십시오.
알림: 가죽 장갑은 동물을 다루고 직접 접촉하는 데 사용되지만 녹음 중에는 착용하지 않으며 지속적이거나 관찰 가능한 교란 효과를 일으키지 않습니다. - 약 50mm x 50mm 크기의 작은 종이 타월 조각을 찢고 접어 받침대의 윗면을 덮습니다. 종이 타월을 제자리에 놓고 3D 프린팅된 플랫폼을 받침대(높이 14인치)에 놓습니다.
알림: 용지는 플랫폼의 압입을 조정하고, 의도하지 않은 움직임을 방지하고, 이미징을 위한 균일한 흰색 배경을 제공하고(받침대 표면이 흰색이 아닌 경우) 기록 중에 동물이 소변을 볼 경우 흡수층 역할을 하여 플랫폼이 미끄러워지는 것을 방지합니다. - 가죽 작업용 장갑을 끼고 동물을 사각 튜브 인클로저 어셈블리로 부드럽게 안내합니다.
- 인클로저 어셈블리를 플랫폼에 놓아 동물을 경기장으로 옮깁니다(그림 1J).
- 탈착식 상단 인클로저를 조심스럽게 분리하여 플랫폼의 아크릴 압출 투명 사각형 튜브에 동물을 남겨둡니다. OMR 시스템의 문을 닫습니다.
3. OMR 소프트웨어 매개변수 설정
참고: 사진의 OMR 시스템은 초당 1프레임(fps)의 글로벌 셔터가 있는 IR 감지 3/25" CMOS 센서를 갖춘 소형 산업용 카메라를 사용합니다. 카메라에는 F1.6 광각 렌즈가 장착되어 있어 경기장을 하향식으로 완벽하게 볼 수 있습니다. 표준 100% 대비 설정을 사용하여 다람쥐를 대상으로 실시한 예비 시력 테스트에서 다람쥐의 시력이 하드웨어의 해상도 한계를 초과하는 것으로 나타났습니다. 설정에 사용된 23.8인치 풀 HD 평면 내 스위칭 화면의 해상도는 너비가 1920픽셀에 불과하므로 소프트웨어는 최대 공간 주파수 2 cyc/°로 하드 코딩됩니다. 비교를 위해 C57Bl/6 마우스의 시력은 약 0.3-0.5 cyc/°입니다. 2 cyc/°에서 각 스트라이프의 너비는 평균 5.3픽셀입니다. 회전 속도가 12°/s이고 프레임 속도가 초당 60프레임인 경우 패턴은 프레임당 0.2°씩 이동하며, 이는 균일한 픽셀 속도를 가정할 때 프레임당 4.2픽셀에 해당합니다. 2 cyc/°에 가까운 공간 주파수에서 스트라이프 패턴은 앨리어싱이 발생할 수 있는 해상도 한계에 접근하여 패턴이 뒤로 이동하는 것처럼 보입니다. 이 아티팩트를 방지하기 위해 소프트웨어는 공간 주파수를 2 cyc/°로 제한하도록 하드 코딩되어 있습니다.
따라서 다람쥐의 경우 시력 테스트를 수행하지만 훨씬 낮은 대비로 수행하는 프로토콜을 고안했습니다. 다람쥐가 2주기/°에서 줄무늬 패턴을 볼 수 없는 대비 설정(12.78%)을 선택했습니다.
- 라이브 비디오 패널에서 동물이 새로운 환경에 잘 적응하고 움직이지 않고 진정되기 시작했는지 확인하십시오.
- 2 cyc/°에서 각 스트라이프의 너비는 평균 5.3픽셀입니다. 회전 속도를 12°/s로 설정하고 프레임 속도를 초당 60프레임으로 설정합니다. 패턴은 균일한 픽셀 속도를 가정할 때 프레임당 4.2픽셀에 해당하는 프레임당 0.2°씩 이동합니다. 스트라이프 패턴이 앨리어싱이 발생할 수 있는 해상도 한계에 접근하여 패턴이 뒤로 이동하는 것처럼 보이도록 공간 주파수를 2 cyc/° 근처로 설정합니다. 이 아티팩트를 방지하려면 공간 주파수를 2 cyc/°로 제한하도록 소프트웨어를 하드 코딩합니다.
참고: 다람쥐의 경우 시력 테스트를 수행하지만 훨씬 낮은 대비로 수행하는 프로토콜을 고안했습니다. 우리는 다람쥐가 2주기/°에서 줄무늬 패턴을 볼 수 없는 대비 설정(12.78%)을 선택했습니다.
- 2 cyc/°에서 각 스트라이프의 너비는 평균 5.3픽셀입니다. 회전 속도를 12°/s로 설정하고 프레임 속도를 초당 60프레임으로 설정합니다. 패턴은 균일한 픽셀 속도를 가정할 때 프레임당 4.2픽셀에 해당하는 프레임당 0.2°씩 이동합니다. 스트라이프 패턴이 앨리어싱이 발생할 수 있는 해상도 한계에 접근하여 패턴이 뒤로 이동하는 것처럼 보이도록 공간 주파수를 2 cyc/° 근처로 설정합니다. 이 아티팩트를 방지하려면 공간 주파수를 2 cyc/°로 제한하도록 소프트웨어를 하드 코딩합니다.
- 보충 코딩 파일 다운로드 3. OptoDrum 소프트웨어를 엽니다.
- 설정 탭에서 설정 가져오기를 클릭합니다. 보충 코딩 파일 3을 로드합니다.
- 설정 탭에서 배경 임계값 오프셋을 17로, 최소 동물 크기[px]를 30으로, 최대 꼬리 너비[% of size]를 1로 설정합니다.
- 카메라 설정에서 비디오 반전 및 수동 카메라 제어를 선택하지 않고 IR 조명 꺼짐을 그대로 둡니다.
- 다람쥐가 튜브 입구 바깥쪽으로 기울어져 있는 경우 다람쥐를 수용할 수 있도록 추적할 관심 영역의 위치와 크기를 넓힙니다. 제안된 값은 위치: X: 359, Y: 237, 크기: X: 570, Y: 455입니다. 오탐으로 이어질 수 있으므로 ROI를 자극 화면 위로 확장하지 마십시오.
- 상단 패널에서 Session Configuration(세션 구성 )을 선택합니다(그림 2A).
- 계단의 경우 추정 공간 시력을 다음과 같이 설정합니다. 예상 시력을 1.800 cyc/°(648주기)로 설정합니다. 최적의 자극 해상도를 0.5 cyc/°(180주기)로 설정합니다. 측정 분해능을 0.100 cyc/°(36주기)로 설정합니다.
- 계단의 경우 다음과 같이 필요한 확인 횟수를 설정합니다. 실패한 시련을 3으로 설정합니다. 성공적인 시험을 2로 설정합니다.
참고: 위양성 확인의 발생을 더욱 줄이기 위해 성공적인 시도 횟수를 늘릴 수 있습니다. 그러나 이 플랫폼과 수정된 처리 터널을 사용하면 오류율이 허용 가능한 수준으로 낮게 유지됩니다. 이것은 주로 다람쥐의 상대적인 고요함과 시각적으로 유발된 자극에 의해 유도되는 것을 제외하고는 회전하는 머리 움직임의 빈도가 낮기 때문입니다.
- 계단 탭(그림 2B)에서 안티앨리어싱을 너비로 3px로 설정하고 정현파를 선택하지 않은 상태로 둡니다.
- 테스트 기준의 경우 대비를 12.78%로 고정하고 회전 속도를 12°/s로 고정합니다.
참고: 12.78% 대비 설정에서 다람쥐의 공간 시력은 약 1.5-1.8 cyc/°로 제한됩니다. 더 이상 최대 하드웨어 설정을 초과하지 않는 이 구성을 사용하면 질병이나 부상에 대한 반응으로 공간 시력을 평가할 수 있습니다. - 세 개의 매개변수 중 두 개가 잠기면 매개변수 자동 설정 옵션이 활성화됩니다(더 이상 회색으로 표시되지 않음). 매개변수 자동 설정 옆의 확인란을 선택합니다.
- 시각 장애가 한쪽 눈 또는 양쪽 눈에 있을 것으로 예상되는지에 따라 회전 방향을 설정합니다. 각 눈에 대해 측두에서 비강 방향으로의 움직임만 추적을 유도합니다. 결과적으로 시계 반대 방향(CCW) 자극이 정상적인 반응을 이끌어낼 것으로 예상되므로 시계 방향(CW) 자극을 사용하여 왼쪽 눈의 손상을 평가합니다. 양쪽 눈에 변성이나 부상이 예상되는 경우 양방향으로 자극을 회전시키는 것이 사용될 수 있습니다.
- 평가판 시작을 클릭하여 자극 프레젠테이션을 시작합니다. 위의 카메라는 동물의 머리 움직임을 기록하고 추적하기 시작합니다. 자극이 표시되는 동안 분석 탭을 클릭하면 각속도(머리 회전), 트랙 품질 및 점수 매개변수를 실시간으로 볼 수 있습니다. 각 자극 프레젠테이션이 끝나면 소프트웨어는 다음 Cyc/°로 진행할지(녹색 확인 표시로 표시), 시도를 반복할지 또는 Cyc/°를 줄일지(빨간색 X로 표시) 자동으로 결정합니다.
- 녹음 중에 추적 소프트웨어가 코(빨간색) 및 꼬리(녹색) 마커를 잘못 넘기면 키보드에서 Ctrl 키를 눌러 수동 재정의를 통해 머리-꼬리 방향을 수정할 수 있습니다.
- 동물이 플랫폼에서 떨어지면 평가 일시 중지를 누르거나 스페이스 바를 클릭하여 시험을 일시 중지합니다. 플랫폼에서 핸들링 터널을 제거하고 동물을 안전하게 취급할 수 있도록 뚜껑과 함께 사용하여 플랫폼에 다시 놓습니다. 동물이 준비되면 평가 재개 를 클릭하여 시험을 계속합니다.
- 모든 시험이 완료되면 요약 탭 을 클릭하여 성공한 시험을 녹색으로 표시하고 실패한 시험을 빨간색으로 표시합니다. 녹색 동그라미로 표시된 시험은 12.78%의 대비를 사용하여 다람쥐의 시력 역치를 나타냅니다. 동물을 조심스럽게 집 케이지로 돌려보내십시오.
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결과
OMR은 소프트웨어가 공간 주파수 판별 시험에서 동물의 성능에 의해 결정된 시각적 임계값을 식별하면 성공한 것으로 간주됩니다. 구체적으로, 임계값은 다음과 같이 정의됩니다: 주어진 공간 주파수(cyc/°로 측정)에서 2번의 성공적인 시도, 그 다음으로 더 높은 공간 주파수에서 3번의 실패한 시도. OMR은 표준 원형 평면 플랫폼(그림 3A)을 사용하여 13개의 줄이 있는 땅다람쥐(생후 6-8개월)에 대해 수행하여 비혐오 플랫폼 및 핸들링 터널(그림 3B)과 비교했습니다. 동물을 표준 원형 평면 플랫폼에 올려놓았을 때 동물은 항상 떨어져 할당된 시간(10분) 내에 자동화된 시각적 역치 평가를 완료할 수 없었습니다. 한 번은 동물이 플랫폼에서 뛰어내려 위의 카메라를 움켜쥐었습니다. 이러한 조건에서 OMR을 측정하는 것은 기술적으로 가능하지만 동물당 수많은 시도와 몇 시간이 필요합니다. 대조적으로, 비혐오적 플랫폼과 핸들링 터널...
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토론
중요한 단계
터널 진입 촉진 - 고려해야 할 한 가지 중요한 점은 다람쥐가 아크릴 직사각형 터널의 임시 뚜껑 역할을 하기 위해 3D 프린팅된 인클로저 어셈블리가 필요하다는 것입니다. 그것 없이는 쉽게 들어갈 수 없습니다. 우리 시설에서는 13개의 땅다람쥐를 정기적으로 붉은 쥐 크기의 원통(길이: 15.24cm, 직경: 7.62cm)으로 수용합니다. 3D 프린팅 인클로저의 목적은 농축 터널에 대한 친숙함을 제공하여 취급을 더 쉽게 만드는 것입니다. 다람쥐를 다룰 때는 무해해 보이는 외모에도 불구하고 물거나 긁을 수 있고 다른 설치류처럼 예측할 수 없기 때문에 두꺼운 가죽 장갑을 착용하는 것이 중요합니다. 동물이 터널에 들어가도록 장려할 수 있으며 터널의 양쪽 끝에 손을 부드럽게 대고 양쪽 끝을 막아 옮길 수 있습니다. 이 방법은 스트레스를 최소화합니다.
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공개 사항
미야기시마 키요하루, 프란시스코 나달-니콜라스, 존 볼, 웨이 리는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없다고 선언합니다. Thomas Munch는 Striatech GmbH의 소유주이자 연구 개발 이사입니다. Boris Benkner는 Striatech GmbH의 창립자 겸 CEO입니다.
감사의 글
이 연구는 NIH, National Eye Institute의 교내 연구 프로그램의 [부분적으로] 지원되었습니다. 이 작업은 또한 수상 번호의 비전 연구 프로그램을 통해 보건 담당 국방부 차관보실과 국방 보건국 J9, 연구 개발국의 지원을 받았습니다. (CDMRPL-18-0-VR180205). 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 국방부에서 승인하는 것은 아닙니다. 저자는 rd10 및 CX3CR1GFP/+ 마우스를 제공한 Wenxin Ma 박사, OMR에 대한 통찰력 있는 토론 및 기술 지원을 해준 Haohua Qian 박사(Visual Function Core, NEI, NIH), 부품 제작에 도움을 준 NIMH/NINDS/NICHD 기계 공장, 3D 프린팅을 지원해 준 Charles King(NIH 도서관)에게 감사를 표합니다.
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재료
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참고문헌
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