재사용 간 영상 도구: 간내 현미경을 위한 재사용 가능한 3D 프린팅 도구

요약

이 프로토콜은 생체 마우스의 인체 현미경(IVM)을 위한 최첨단 재사용 간 영상 도구(RHIT)를 도입하여 신속하고 급성 실험을 위한 조직 안정성을 향상시킵니다. RHIT의 3D 프린팅 설계는 비용 효율적인 생산, 확장성, 다재다능함을 제공하여 다양한 크기의 쥐에서 대사 과정을 장기간 관찰할 수 있게 합니다.

초록

간 기능과 기능 장애는 공초점 기반 생체 현미경(IVM)을 이용해 간의 동적 과정을 직접 시각화함으로써 평가할 수 있습니다. 특히, 정성적·정량적 정보 추출에서 뛰어난 공간적·시간적 정밀도를 달성할 수 있습니다. 현미경 단계에서는 안정성과 반복성을 달성하면서 생리적 조직 상태를 유지하는 것이 여전히 도전적입니다. 체중과 간 지질 함량 증가는 제2형 당뇨병(T2D)과 비알코올성 지방간 질환(MAFLD) 동물 모델에서 이 과정에 부정적인 영향을 미칩니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 우리는 조직 접근성과 안정성을 향상시키는 혁신적인 영상 기기 설계인 RHIT를 개발했습니다. RHIT는 3D 프린팅을 사용하여 효율적인 원스텝 방식으로 제조된 재사용 가능하고 확장 가능한 간 영상 장치입니다. 크기는 크기가 다른 쥐에 맞게 조절될 수 있습니다. 간단히 말해, RHIT는 간내 현미경 검사 중 실험실 동물을 위치 지정하고 안정화하기 위한 3D 프린팅 장치로, 간단한 수술 준비 후 사용되어 취급, 스트레스, 변동성을 최소화합니다. 재사용 가능하고 표준화된 설계는 쉽게 제작 및 맞춤화할 수 있어 다양한 크기와 잠재적 실험 설계를 지원합니다. 초기 결과는 간내 생명체 영상의 안정성과 신뢰성이 눈에 띄게 향상되어 지질 방울과 같은 세포 내 구조의 상세한 시각화가 가능함을 보여줍니다. 이러한 정밀도 향상은 대사 및 생리학적 연구를 명확성, 재현성, 그리고 종단적 설계 가능성을 높이는 데 기여합니다. 이 프로토콜은 간융 IVM의 오랜 기술적 문제를 해결하는 표준화되고 접근 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

생체 내 현미경은 고정 조직 또는 생세포 영상과 분리 세포의 유세포 분석을 이용한 전통적인 면역형광 조직학과 달리 생체 내 생물학적 과정을 동적으로 시각화하는 강력한 도구입니다. 간 검사를 위해 IVM은 담즙 분비 및 유량 ^4,5, 포도당 동원 ^6,7, 비실질 세포 ^8,9,10, 간 질환^11,12를 검사하는 데 사용되었습니다. 더욱이, 지질 축적 연구와 관련해서는, IVM은 살아있는 조직에서 지질 방울의 형성, 성장, 분해의 역학을 실시간으로 제공할 수 있게 해줍니다. 예를 들어, 고해상도로 지질 방울을 시각화하고 정량화하는 것, 그리고 지질 방울 축적과 다른 세포 및 생리학적 과정과의 직접적인 상관관계도 포함됩니다¹³. 이러한 장점에도 불구하고, IVM은 여전히 기술적으로 도전적입니다. 전문 장비와^{전문성이 필요}하며, 조직 손상을 일으키고 세포 행동을 변화시킬 수 있으며, 침습적인 시술이 필요합니다. 행동 관찰, 생리학적 모니터링, 유전 분석에 의존하는 전통적인 생체연구는 귀중한 정보를 제공하지만, 생체 내 현미경이 제공하는 공간적·시간적 해상도는 부족합니다.

IVM의 첫 번째 주요 과제는 검사 대상 동물의 심장 박동과 호흡으로 인한 인공물의 불안정성을 제어하는 것으로, 이는 이미지 품질을 저하시켜 관찰되는 생물학적 과정의 이미지가 흐려지거나 왜곡될 수 있습니다¹⁵. 이를 이미지 처리로 보정하려는 시도는 중요한 공간적·시간적 정보를 잃거나 고급 수술 장비와 유지보수를 요구하는 결과를 낳는 경우가 많습니다^16,17. 둘째, MAFLD와 T2D와 같은 간 질환 연구용 마우스 모델은 종종 비만이며, 크기와 조직 지질 함량이 증가하여 안정화가 더 어렵습니다^16,18. 비만 NAFLD 및 제2형 당뇨병 마우스 모델에서 체중 증가는 표준 현미경 스테이지의 부하 용량을 초과하여 인비탈 영상에 기계적 도전을 일으키고 동물 안정화를 복잡하게 만듭니다¹⁹. 이 추가 무게는 움직임 아티팩트와 조직 압박 위험을 높이며, 이로 인해^{영상 정밀도가} 저하됩니다.

동시에 간 지질 함량이 높아지면 조직의 불투명도와 빛 산란이 증가하여 이미지 해상도와 대비가 저하됩니다. 이러한 효과는 관류 변화와 염증 같은 대사 동반 질환으로 인해 종종 복합화되어 염료 분포와 신호 명료성이 더욱 감소합니다²¹. 마지막으로, 조직 생리와 생물학적 활동을 유지하기 위해 영상 촬영 내내 체온을 일정하게 유지하는 것은 어렵고 반복성을 저해할 수 있습니다. 또한, IVM 중 간을 현미경 단계에서 안정적으로 위치시키는 것은 기계적 스트레스나^{조직 손상을} 방지하기 위해 매우 중요합니다. 간 조직 노출은 심한 출혈과 간 실질^{체 손상을} 막기 위해 기술적 정밀함이 필요한 섬세한 절차입니다. 움직임 인위팩트를 줄이기 위해, 쥐의 갈비뼈는 이전에 판지로 현미경 스테이지에서 들어 올려져 중력에 의해 간을 몸의 나머지 부분에서 끌어당겼다²². 이 방법은 정량화된 데이터를 생산하는 데 성공적임이 입증되었지만, 종이 소재는 형태가 흐트러지고 청소가 어려워 지속 가능하지 않습니다. 또한, 비만인 마우스 모델을 수용하기 위해 판지 인서트의 크기를 바꾸는 것도 어렵습니다.

최근 몇 년간 주사 광장 현미경과 계산 강화 광학 시스템 등 여러 첨단 간 내 생명체 현미경 기법이 등장했으며, 이들은 시공간 해상도²³, 광독성 감소²⁴, 영상 깊이^25,26 증가, 운동 인공물 억제²⁷ 등의 향상을 보여주었습니다. 최근 연구^{28, 29, 30}에서 입증된 이러한 발전은 이 분야에서 중요한 기술 진보를 나타냅니다. 이 논문은 쥐 간 IVM을 위한 혁신적인 도구인 재사용 간 영상 도구(RHIT)를 소개합니다. RHIT는 대사 질환을 포함한 다양한 동물 모델에서 기계적 안정성과 조직 접근성을 향상시키는 확장 가능하고 재사용 가능한 도구를 제공함으로써 이러한 변화하는 환경에 기여합니다. 이 설계는 해부학적 적합성, 스테이징 재현성, 사용 편의성을 통합하여 움직임, 변동성, 설치 복잡성 등 지속적인 문제를 해결합니다. RHIT가 기존 및 첨단 영상 기법과 호환되어 이 신기술들의 유용성을 확장하여 신뢰할 수 있고 생리학적으로 안정적인 생체 내 간 영상을 촉진합니다.

IVM 중 조직을 안정화하기 위한 다양한 접근법이 제안되었는데, 예를 들어 수술용 창 9,31,32,33,33,34,35,36 과 맞춤형 조립 아크릴 단계 ^6,37 등이 있지만, 이러한 방법들은 확장성, 재현성, 외과적 기술에 있어 많은 한계와 복잡성을 초래합니다. 비교하자면, RHIT는 목적과 설계에서 기능적으로 구별됩니다. 직접 압축이나 젤 기반 임^베딩에 의존하지 않습니다. 대신 RHIT는 중력적 위치를 이용해 간 분리를 지원하고, 조직을 제한하거나 변형하지 않으면서 생리적 방향을 유지할 수 있는 확장 가능하고 재사용 가능한 해부학적 구조 도구로 기능합니다. 무엇보다도, RHIT는 다양한 마우스 크기에서 데이터 재현성, 영상 정확도, 절차적 일관성을 향상시킵니다. 젤, 접착제, 복잡한 수술용 인터페이스가 필요 없고, 조직 정렬과 온도 조절을 단순화합니다. 더불어, RHIT은 동물과 현미경 사이의 인터페이스를 연결하는 특수 도구로, 생리학적 지원과 영상 정밀도를 모두 지원하도록 설계되었습니다.

RHIT는 대사 손상된 모델의 기계적 및 광학적 문제를 직접 해결하며, 더 큰 동물 크기를 수용하면서 무게를 고르게 분산시켜 플랫폼 불안정성을 최소화합니다. 후퇴된 간 개구부는 압축력 없이 중력을 이용해 조직을 안정화하여 일관된 접근을 가능하게 하고 영상 촬영 중 움직임을 줄입니다. 재사용 가능하고 화학적으로 불활성인 설계는 생체 조직과의 호환성을 보장하면서 위생적인 재사용을 지원합니다. 일관된 위치 지정, 운동 인위물 최소화, 조직 무결성 유지를 통해 RHIT는 인내 생체 현미경 워크플로우의 근본적인 발전을 제공합니다. 적응성과 오픈 소스 접근성은 실험실과 동물 모델 전반에 걸쳐 광범위한 활용성을 촉진하며, 표본과 영상 시스템 모두를 지원하는 영상 도구의 새로운 기준을 세웁니다.

또한, 상업적으로 구할 수 있는 가열 현미경 스테이지는 고급 현미경 장비^{와 취급이} 필요할 수 있습니다. 표본에 맞게 확장성이 없고 일반적으로 더 비싸서 많은 연구자들이 접근하기 어렵습니다. 따라서 재사용 가능한 확장 가능한 삽입물이 다양한 동물 모델에 맞는 IVM을 표준화하는 데 중요합니다. 3D 프린팅 기술, 즉 적층 제조는 과학 실험실⁴⁰에서 점점 인기를 얻으며 생화학, 물리학, 생물학 실험실 프로토콜을 혁신하고 있습니다. IVM에서는 3D 기술이 사용되어 경량 영상 광학 창^41,42 제조, 조직 접근성 개선⁴³, 조직 수리 및 재건 용이성⁴⁴. 따라서 우리가 아는 한 아직 기술되지 않은 조직 안정화를 위한 맞춤형 도구가 간성 IVM의 일부 도전을 극복하기 위해 3D 프린팅을 활용할 수 있는 훌륭한 기회를 제공합니다.

RHIT는 원스텝 3D 프린팅 방식을 사용하여 장기간 조직 안정화를 크게 향상시킵니다. RHIT는 접근성이 높으며 최소한의 외과적 전문성으로 필요한 급성 IVM 실험에 적합합니다. 또한 RHIT는 동물 크기에 쉽게 확장할 수 있고 생산 비용도 낮습니다. 마지막으로, RHIT가 안정적인 타임랩스 형광 영상을 가능하게 하고 이전에 사용된 판지 인서트에 비해 조직 안정성을 개선함을 입증합니다. RHIT는 간지질상성의 IVM을 단순하게 진행하며, 생리학적 상태에 직접 접촉하거나 측정 가능한 영향을 주지 않습니다. 따라서 RHIT는 IVM^{34, 36, 45}에 가속화되고 재사용 가능하며 적응 가능한 기여로서 경쟁 우위를 제공합니다.

그림 1: RHIT 설계. (A) 비만 마우스를 위한 3.0mm RHIT 축척 설계 및 치수. 안면 뷰(왼쪽)는 조직 조리개의 크기, 위치, 크기와 영상 촬영 중 마우스의 방향을 보여줍니다. 측면 사진(오른쪽)에는 치수가 표시되어 있고, 히트 패드와 온도 프로브 인서트의 위치를 나타냅니다. 마우스 크기에 따른 스케일링 매개변수는 표 1에 제공되어 있습니다. (B) 오픈 소스 STL 파일에서 생성된 RHIT의 3D 정면 뷰로, 직장 탐침 와이어가 맞춤 포트를 통해 삽입되는 위치를 보여줍니다(직장 탐침 삽입물 치수는 오른쪽 상단에 표시됨). (C) RHIT의 기술 조립: 가열 장치와 다양한 RHIT 크기에 맞는 맞춤형 구조 삽입물의 통합을 보여주며, 와이어는 온도 탐침 접근을 위해 직장 탐침 삽입물에 삽입됩니다. 약어: RHIT = 재사용 가능한 간영상 도구. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

RHIT는 원래 ABS(아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌)를 사용한 단일 부품 조립체로 설계되었으며, ABS는 3D 프린팅⁴⁵ 용융 증착 모델링에 널리 사용되는 열가소성 폴리머입니다. ABS는 이 용도에 여러 가지 장점을 제공합니다: 가볍고, 내열성(녹는점 ~200 °C), 우수한 충격 저항성을 가지며(^{46, 47, 48}). RHIT의 설계는 ABS의 조절 가능한 밀도를 활용하여 심장 박동과 호흡과 같은 생리적 움직임을 흡수할 수 있게 합니다. 충전재 밀도 증가는 움직임 감쇠를 강화하여 영상 안정성과 이미지 품질 향상을 이룹니다.

RHIT는 ABS와 같은 화학적으로 불활성 물질의 밀도를 조절하여 움직임을 흡수하도록 설계되었습니다. 여기서 밀도는 3D 프린팅 중 사용되는 내부 충전량 비율을 의미하며, 이는 플랫폼의 강성과 진동 감쇠 능력에 영향을 미칩니다^{49, 50, 51}. ABS의 밀도를 높이면 심장 박동과 호흡에 의한 움직임 전달을 줄여 안정적인 영상 플랫폼과 이미지 품질 향상이 관찰되었습니다. 내부 충전 밀도가 20-100%에 달하는 RHIT 구조물을 테스트하여, 고밀도 구성이 쥐의 간 내 생체 영상 시 움직임 인위가 눈에 눈에 감소하는 것을 질적으로 관찰했습니다. 고밀도 구성이 모든 RHIT 크기에서 충분히 견고하고 효과적이었으며, 일상적인 영상 조건에서 일관되게 신뢰성 있는 성능을 제공했기 때문에 공식적인 정량화는 수행되지 않았습니다. 대부분의 사용자에게 이 기본 밀도는 추가 조정 없이도 적합합니다. 하지만 특정 기계적 특성이 필요한 실험의 경우, 인필 밀도와 설계 매개변수를 수정할 수 있으며, 이러한 맞춤화를 지원하기 위한 완전한 3D 프린팅 지침도 제공되었습니다.

대체 재료는 인쇄에 사용할 수 있으며; 하지만 ABS는 여러 가지 주요 장점을 제공하기 때문에 RHIT 제작에 선호되는 재료입니다. 화학적으로 불활성하여 조직이나 체액과의 상호작용 위험을 최소화하고, 물에 녹지 않아 효율적인 세척, 저장, 재사용이 가능합니다. 이러한 특성들은 ABS를 실험적 사용에 있어 신뢰할 수 있고 내구성 있는 선택지로 만듭니다. 융합 증착 모델링 프린터 접근이 제한될 경우, 다른 3D 프린팅 기법과 재료를 사용할 수 있습니다. 입체석조피, 선택적 레이저 소결, 다중 제트 융합은 나일론, 광분자 수지, 복합 분말과 같은 재료와 함께 적합한 선택입니다. 나일론은 내구성과 유연성을 제공하는 반면, 스테레오리소그래피 수지는 세밀한 구조적 디테일이 필요한 응용 분야에 높은 해상도를 제공합니다. RHIT 설계는 다양한 재료의 공차와 제약에 쉽게 적응할 수 있어 다양한 인쇄 플랫폼과 호환됩니다. 사용자는 기계적 안정성, 생체 적합성, 영상 작업 흐름과의 호환성, 사용 가능한 인쇄 자원을 기준으로 재료를 선택해야 합니다.

프로토콜

모든 동물 연구는 동물 실험 윤리 위원회(프로토콜 번호)가 승인한 지침과 프로토콜에 따라 국립보건원(NIH) 동물 시설에서 수행되었습니다. LCMB-037). 모든 인원은 다음 절차를 진행하기 전에 적절한 교육을 받아야 합니다. 동물 취급은 기관 지침을 준수하여 수행되었습니다.

RHIT 프로토콜은 인체 생체 현미경(IVM) 실험에 사용하기 위한 재사용 간 영상 도구(RHITs) 준비 과정을 설명합니다. 실험 절차는 멸균된 현미경실(후드)에서 진행되며, 먼저 RHIT 인쇄, 마취, 형광 표지, 현미경 설치, 수술 절차, 마지막으로 RHIT 보조 IVM 적용 단계로 이루어집니다. 그림 1과 그림 2는 공초점 현미경을 이용한 생체 표본을 촬영하는 데 필요한 구성 요소를 보여주며, 여기에는 RHIT 삽입을 위한 금속 인서트^{5, 6, 7}(생체 표본 영상용 현미경 어댑터)과 고급 또는 통제된 구형 질환에 사용되는 RHIT가 포함됩니다. 시스템 시험을 위해 6-10주 된 수컷 C57BL/6J Mus musculus를 얻어 실험 8-10주 전부터 표준 또는 서양식 식단을 먹였다.

1. 수정된 RHIT 설계

1. RHIT를 재현하려면 3D 제품 설계 소프트웨어(재료표 참조)를 사용하세요. 설계 소프트웨어를 열고 새로운 표준 부품을 만드세요. 적절한 설명과 함께 파일을 저장하세요.
2. 2D 스케치 생성 기능을 사용해 앞면 평면에서 RHIT 스케치를 만듭니다.
   1. 직사각형 아이콘을 클릭해 왼쪽 아래 모서리를 스케치 평면의 원점에 놓으세요.
   2. 첫 번째 사각형 안에 RHIT의 영상 창을 나타내는 두 번째 직사각형을 그리세요.
   3. Dimension 기능을 사용해 두 직사각형 모두에 치수를 추가하여 모든 길이와 너비가 원점과 서로 상대적으로 참조되도록 하세요.
   4. 마우스 크기에 맞춰 RHIT 크기를 조정하세요.
   5. RHIT에 두께를 더하려면 바깥쪽 직사각형만 선택하고 '익스트루드'를 클릭하세요. 팝업이 뜨면 Extrude 도구로 스케치를 선택해 중앙에 빈 공간을 남기세요.
   6. 압출된 RHIT의 하단 면을 선택하고 Start 2D 스케치 기능을 사용해 새 2D 스케치를 시작하세요.
3. 히트 패드 포켓을 정의하는 직사각형을 그려보세요. 획득한 치수를 Dimension 기능을 사용해 적용하세요.
   1. 2D 스케치를 종료하고 Cut Extrude 도구를 사용해 히트 패드를 위한 깊은 공동을 만듭니다.
4. 공동과 같은 면에 온도 프로브의 새 스케치를 시작하세요. 2D 스케치 시작 을 클릭하고 원 아이콘을 선택하세요. 원을 평면 위에 놓고 그에 맞게 치수를 맞춥니다. 스케치 모드에서 나가세요.
   1. 'extrude'를 클릭하고 원의 스케치를 선택하세요. EXtrusion 모드에서 컷 익스트루드를 클릭하고, 재료를 제거하는 '전체 통과' 옵션이 있는 팝업이 뜰 때까지 기다리세요. 확인 버튼을 누르세요. 압출 모드 종료.
   2. 창 가장자리에 필렛을 추가하려면 필렛 아이콘을 클릭하고 8개의 날카로운 모서리를 모두 선택하세요. 필렛 크기를 추가하고 필렛 모드를 종료하세요.
      참고: 추가적인 움직임 흡수가 필요하다면, 3D 프린팅 준비 중 내부 충전재 밀도를 높일 수 있습니다.
5. 3D 프린팅 준비하려면 환경 탭으로 이동한 후 3D 프린트 탭을 선택하세요.
   1. Set Orientation 기능을 사용해 모델이 프린트 베드 위에 평평하게 누워 있고 수직으로 정렬되어 있지 않은지 확인하세요.
   2. Print Options를 클릭하여 단위 설정을 설정하고 필요하면 축척을 조정할 수 있습니다.
   3. 최종 모델을 저장하세요. STL 내보내기 기능을 사용하여 STL 형식을 사용할 수 있습니다.
   4. 환경 탭을 종료하고 저장을 눌러 RHIT을 단단한 부품으로 저장하세요.
6. 디자인 프로그램을 종료하세요.
   참고: 프린터가 .와 호환되는지 확인하세요. STL 파일 형식 또는 3D 프린터 소프트웨어가 요구하는 적절한 형식으로 변환할 수 있습니다.

2. STL 파일에서 RHIT 업로드 및 인쇄

1. 그림 1A 또는 보조 파일 1에서 .stl 파일을 3D 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어로 가져오려면 Import를 클릭한 후 .stl 파일을 선택하세요. 준비 버튼을 클릭하여 모델을 얇은 층으로 나누어 3D 프린팅을 할 수 있습니다.
2. 적절한 3D 상업용 프린터를 선택하고 인쇄를 클릭하세요. 그 후 출력 진행 상황을 모니터링하고, 출력이 완료되면 필요에 따라 3D 프린팅 물체를 제거하고 청소합니다.

마우스 크기	마우스 몸무게 (g)	RHIT 두께 (mm)	이미징 윈도우 크기 L X W (MM)
스몰 (S)	17-20	1.5	17 x 17
미디엄 (남성)	22-25	2.5	21 x 21
라지 (L)	35-40	3	26 x 26

표 1: RHIT에 맞춘 마우스 크기 조정. 쥐 무게는 RHIT 두께에 맞게 척도되며, 30g(화살촉) 이상의 무게가 가장 큰 RHIT(3.0mm)에 해당합니다. 가장 가벼운 쥐는 가장 얇은 RHIT에 해당하며, 비만 쥐는 가장 두꺼운 RHIT로 대표됩니다. 이 치수들은 CAD 소프트웨어로 조정할 수 있습니다. RHIT 길이와 영상 개구부는 사용되는 시료의 장기 위치에 따라 달라질 수 있습니다; 세 개의 RHITS 모두 일정한 길이와 영상 개구가 이 연구에 적합했습니다. 약어: RHIT = 재사용 가능한 간영상 도구; CAD = 컴퓨터 지원 설계.

3. 현미경 준비 및 RHIT 활용

그림 2: RHIT 기법을 이용한 간의 체외 체면. (A) 마취된 마우스를 사용한 역방향 공초점 현미경 설치 도식. (B) 금속 현미경 어댑터(삽입물)를 사용해 마우스를 현미경 스테이지에 위치시켜 실시간 영상을 촬영했습니다. (C) 3D 프린팅된 RHIT는 거즈 스트립과 함께 간 실질을 쉽게 조작하는 데 사용되었습니다. (D) RHIT 위치 이전의 사전 외부 간 이미지. 코 콘은 수술 전과 수술 중에 마취에 사용되었습니다. (E) 급성 수술 중 RHIT 위치 이전의 외부 간 이미지. 면도는 필요하지 않았습니다. (F) 영상 촬영을 위한 RHIT의 최종 뒷면이 아래로 향한 뒤집힌 마우스 이미지 (G) RHIT가 현미경 스테이지에 단단히 부착됨. (H) RHIT와 금속 어댑터에 위치한 쥐. (I) J-L에서 각각 비늘 RHIT 삽입물이 부착된 마른(파란 화살표) 및 비만(초록 화살표) 쥐는 각각 비만과 마른 간의 대략적인 해부학적 이미지를 보여줍니다. 고해상도 IVM 이미지는 비만 및 마른 쥐의 간 M,N을 BODIPY(녹색, 분홍색 화살표로 표시)로 표기하여 지질 방울을, Hoechst 33342(흰색, 청록색 화살표로 표시)로 각각 핵을 표지합니다. 약어: RHIT = 재사용 가능한 간영상 도구; IVM = 생명체 내 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 그림 2에 나타난 대로 간 IVM을 위한 기존의 역방향 공초점 현미경을 준비합니다.
   1. 샘플을 수용할 수 있도록 스테이지 어댑터를 삽입하세요. 이 프로토콜을 따르기 위해 35mm 원형 개구부와 40mm 커버 유리를 가진 맞춤형 금속 인서트를 사용하세요.
   2. 각 영상 촬영 전후에 70% 에탄올로 커버 유리 양면을 철저히 세척하세요.
2. 마우스 크기(표 1)에 따라 RHIT 조리개를 대물렌즈와 정렬하고, 금속 인서트의 영상 커버슬립(그림 2G) 위에 평행하게 고정하여 커버 유리 위에 테이프를 붙여 적절한 RHIT를 고정하세요(선택 사항).
3. 25x/0.95 수중 대물렌즈와 같은 면적 크기, 공간 해상도, 촬영 시간을 기준으로 촬영용 대물렌즈를 선택하세요.
   참고: 배율이 높아질수록 해상도가 향상되지만, 동시에 움직임 아티팩트가 발생할 가능성도 증가합니다.
   1. 대물렌즈를 커버 유리 가까이에 맞추세요.
4. RHIT 창문을 가로질러 약 1 x 8 cm 크기의 거즈 스트립을 테이프로 고정하여 조직을 위치시키고 다른 복부 장기와 분리하는 데 도움을 줍니다(그림 2C).
5. RHIT는 슬롯에 삽입한 히트 패드를 사용해 예열하고, RHIT 옆에 있는 열 프로브를 고정하여 영상 촬영 중 마우스의 체온을 유지합니다(그림 2G,H).

4. 형광 표지 및 마우스 마취

1. 마취 유도실을 소독하여 동물 악취의 마지막 흔적을 제거해 쥐의 스트레스를 줄이세요.
2. 산소 응축기, 환경 보호 시스템(EPS), 그리고 이소플루란 증기 장치를 켜세요.
3. 마우스를 유도 챔버에 넣고 2-3% 이소플루란을 사용해 약 3-5분 동안 마취시키고, 동물이 안정된 호흡과 올바른 자세 및 발 반사 상실을 보일 때까지 마취합니다.
   1. 마취 후에는 쥐를 온열 패드로 옮기고, 코 원추세포를 통해 1-2% 이소플루란을 투여하여 마취를 유지하며(그림 2D), 필요에 따라 마취의 안정된 마취면을 유지합니다.
   2. 발가락 꼬집기 검사를 통해 마취의 깊이를 평가하여 자발적인 움직임을 관찰하세요.
4. 지질 풍부 구조를 표지하기 위해, 31G 인슐린 주사기를 사용해 꼬리 정맥을 통해 PBS에 희석된 BODIPY 665/676 200 nmol(총 부피 200 μL)을 주입합니다.
   1. 최적의 신호를 위해 영상 촬영 전 하루 2일 연속으로 BODIPY를 투여하세요. 두 번째 주사 후 최소 3-4시간 정도 기다려 배경 전신 제거와 조직 신호 안정화를 보장하세요.
5. 핵조영제를 위해 Hoechst 33342(2 μg/g 체중)를 1x 헤파린 용액에 희석한 상태(120 μL 헤파린과 180 μL 식염수를 혼합해 400 U/mL 생성)를 31G 인슐린 주사기를 후안와 동에 주입합니다.
   참고: Hoechst는 다른 염료와 혼합 시 침전을 방지하기 위해 별도로 투여됩니다.
6. 혈관을 시각화하기 위해, 4.5단계에서 설명한 동일한 1x 헤파린 용액에 희석된 형광 덱스트란(70 kDa) 18 μg/g 체중을 31G 인슐린 주사기를 반대쪽 후안와 동을 통해 주입합니다(표 2).
   참고: 헤파린은 혈전 형성을 줄이고 영상 검사 중 혈류를 일정하게 유도하기 위해 포함됩니다.
7. 호에스트와 덱스트란 주사 후 10-15분 후에 수술과 영상 촬영을 시작하세요.

형광 기자	목적	무게당 용량(또는 농도)
호에슈트 33342	염색 핵	2 μg/g: 주입제 부피를 50 μl까지 헤파린 용액으로 보완
보디비 665/676	착색 지질 방울	0.8 μg/g: 보조제 주입액을 식염수 용액에 200 μl까지 투여합니다
2M 테트라메틸 로다민-덱스트란 (덱스트란)	염색 혈관	18 μg/g: 주입제 부피를 50 μl로 보충하여 헤파린 용액을 투여합니다

표 2: 형광 리포터 옵션. 이 표는 생 체조직 표지에 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 헤파린 용액을 먼저 준비한 후 DAPI-헤파린 및 덱스트란-헤파린 용액을 만드는 데 사용된다⁷. Hoechst 33342는 한쪽 눈에 후안과 주입되며, BODIPY는 2-3일 전에 꼬리정맥에 직접 주입되며, 비만 마우스의 경우 농도가 더 높습니다. 덱트론은 다른 눈에도 후안과 주사를 투여합니다. 각 눈마다 개별적으로 후안과 주사를 시행하는 것이 중요합니다. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌.

5. 쥐 수술 절차

1. 복부 털은 제모 크림이나 제모 크림으로 면도하세요. 모발 잔여물을 제거하고 노출된 피부를 70% 에탄올로 깨끗이 청소하세요.
   참고: 기관별 IACUC 요구사항에 따라 적절한 수술 부위 준비를 위해 베타딘과 에탄올을 번갈아 세척하는 방법이 사용될 수 있습니다.
2. 수술 전에 마취 깊이를 재평가하세요.
3. 흉골에서 외과 가위로 갈비뼈 아래에 2-3cm 수평 초승달 모양의 절개를 하여 간을 노출시키고, 상복부 왼쪽 외측에서 끝납니다.
4. 초기 절개 후에는 근육층에 작은 2차 절개를 조심스럽게 하여 간 왼쪽 엽을 노출시키고, 출혈을 방지하기 위해 필요에 따라 소작(선택 사항)을 합니다(그림 2E).
   1. 소작기를 사용할 때 간에 열이 손상되는 것을 방지하려면 간과 근육층 사이에 식이염수가 적신 거즈를 놓아 근육층에서 나오는 열을 흡수합니다.
   2. 과도한 출혈, 수술 또는 기계적 외상, 외부 압박은 피하세요.
5. 간이 노출되면 마우스를 현미경 단계로 옮깁니다.

6. 현미경 스테이지에서의 마우스 배치

1. 마취된 쥐의 복부를 현미경의 RHIT 플랫폼 위에 향하게 배치합니다.
   1. 마우스가 마취 상태에 머무르도록 코 콘을 조정하세요.
   2. 식염수에 젖은 면촉 어플리케이터를 사용해 간 왼쪽 외측엽을 커버슬립에 조심스럽게 밀착시키면서 흉강에는 부드럽게 외부 압력을 가합니다.
      참고: 중력을 이용해 간을 조심스럽게 꺼내 덮개 유리 위로 옮기세요.
   3. 거즈 스트립을 사용해 간을 쥐 몸에서 부드럽게 분리하세요(그림 2E-H).
2. 영상 촬영 중 쥐가 마취 상태에 있는지 코 콘을 다시 확인하세요.
3. 노출된 충치 가장자리에 수성 젤을 바르고 온열 패드와의 직접적인 접촉을 피하여 조직 탈수를 예방하세요.
   참고: 온도 및 습도 유지는 밀폐된 습도^{챔버 5, 6, 7}을 가진 현미경으로도 도움을 받을 수 있습니다.
4. 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바르세요.
5. 타임랩스 IVM을 설정해서 ^7.52번 영상 촬영을 시작하세요.
   1. 레이저 셔터를 열고 형광 표지를 평가하며, 눈에 띄는 혈류가 있는 안정적인 관심 영역을 식별합니다. 이미지 포맷, 획득 속도, 영상 간격, 총 획득 시간, 라인/프레임 평균(512 × 512 픽셀; 영역당 1-5 프레임 s⁻¹; 영상 간격 5-30초; 총 획득 시간 5-20분; 라인/프레임 평균 2-8, 실험 요구사항에 따라 다름) 등 적절한 이미지 획득 매개변수를 선택하세요. 사용되는 형광체에 맞게 형광 플래시 노출을 최적화합니다.
   2. 획득 패널에서 Z-스택을 선택하고, Z-위치 컨트롤로 상단과 하단 초점면을 조정하며, Set First/Set Last로 범위를 확인하여 Z-스택의 상하 경계를 정의합니다; 그리고 실험 시작(또는 획득 시작)을 클릭하여 타임랩스 녹화를 시작하세요. 영상 촬영이 끝나면 기관 동물 관리 및 위원회 승인 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.

그림 3: SSIM을 이용한 RHIT의 간 IVM 안정성 향상 측정. 세 가지 안정화 조건 하에 하부 왼쪽 간엽의 간담 IVM: (A) 삽입물 없음, (B) 판지 삽입물 없음, (C) RHIT. 조직은 BODIPY(마젠타, 지질), Hoechst 33342(녹색, 핵), 덱터른(청색, 혈관류)으로 표지되어 있습니다; 패널 A 와 B 는 가시적인 왜곡과 움직임 아티팩트를 보여주며, C 패널은 RHIT로 인해 더 높은 선명도를 보입니다. (D) 이미지 안정성을 정량화하기 위해 구조적 유사성 지수(SSIM)를 계산하였습니다. 막대는 평균 ± SEM을 나타내며, 각 색깔 점은 개별 생물학적 복제체를 나타냅니다: RHIT(n = 14), 판지(n = 10), 삽입물 없음(n = 8). 이 그룹들은 약 50-70마리의 전체 실험 코호트에서 추출된 하위 그룹입니다. 특정 영상 기준(예: 일관된 프레임 정렬 및 이미지 품질)을 충족하는 세션만이 SSIM으로 분석되었습니다. RHIT는 지속적으로 더 높은 SSIM 값(평균 0.511 ± SEM)을 생성하여 영상 조건 전반에 걸쳐 안정성과 해상도가 향상되었음을 나타냈습니다. 스케일 바 = 15 μm. 대표적인 이미지들이 보여지며; SSIM은 조직 손상이나 교란 없이 연속적인 IVM 세션을 반영합니다. 약어: RHIT = 재사용 가능한 간영상 도구; IVM = 생체 내 현미경; SSIM = 구조적 유사성 지수; CARD = 판지 삽입물. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

RHIT는 CAD 애플리케이션을 사용하여 설계되었습니다(그림 1). RHIT 크기는 소형, 중형, 무거운 마우스를 수용하도록 조정되어 있습니다(표 1). RHIT 설계는 간 영상 촬영을 수용할 수 있도록 조리개가 위치한 길이 107.50mm ABS 평면 재료로 구성됩니다. IVM은 최적(RHIT) 조건과 비최적(삽입물 또는 판지 없음) 조건에서 수행되었습니다(그림 3A-C 참조). 이는 RHIT 사용 시 가능한 결과의 범위와 안정성의 정도를 보여줍니다. RHIT는 약 50-70마리의 다양한 크기의 쥐를 대상으로 테스트되었으며, 이후 소형, 중형, 대형 생쥐를 수용하도록 크기가 조정되어 다양한 생리학적 조건을 포함했습니다. RHIT의 크기는 다양한 크기의 쥐를 수용하도록 조정되었습니다(표 1...

토론

간 내 활력 현미경 검사는 광범위하게 연구되어 왔으나, 이전 방법들은 안정화된 말단 영상 5,6,7,9,31,32를 위해 매우 침습적이고 표준화되지 않은 수술 절차를 요구하는 경우가 많습니다. 운동은 간 IVM에서 재현 가능한 영상 촬영을 방해하는 가장 어려운 장벽 중 하나로 평가받고 있습니다. 호흡기 인공물을 피하는 가장 효과적인 해결책은 삽관과 통제된 인공호흡이며, 명확히 호흡정지⁵⁷. 이전 연구들은 마우스 몸통과 현미경 스테이지 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
½인치 마스킹 테이프	3M 범용 마스킹 테이프:	B40069428
40mm 커버슬립	바이오옵테크	40-1313-03191
70% (v/v) 에탄올	써모피셔 사이언티브	BP2818-4	부피 기준 에탄올 70%, 물 30%
마취기: AMD-3 플러스	솜니	AMD-17106
Aquasonic 100 초음파 전송 젤	파커 연구소	그리고 nbsp; 01 08
보디피 665/67	서모피셔 사이언티브 (인비트로젠)	B3932	표 2 참조
CAD 소프트웨어(Autodesk Inventor 또는 동등한 제품)와 nbsp;	오토데스크 (대표적인 CAD 소프트웨어)	해당 없음	소프트웨어
소작 시스템	쌍둥이자리	GEM 5917
클리독스 소독제	파마칼 리서치 연구소 주식회사	VWR, MSPP-96118F
공초점 현미경 (라이카 SP8 또는 동등한 제품)	라이카	SP8
코튼팁 어플리케이터	퓨리탄 메디컬 프로덕츠	25-806 1WC
맞춤 제작 알루미늄 스테이지 인서트 (두께 3mm, 댐프 35mm)	해당 없음	해당 없음
포란(이소플루란, USP) 흡입용 액체, 250 mL	백스터	10019-360-60
머리깎이 (선택 사항)	오닉스 파인 인스트루먼츠	ASWRHC
직장 탐침이 포함된 온열 패드	ALA 과학 기기	히팅패드-1/2
헤파린 나트륨, 1000 USP U/mL	히크마	0641-0391-12
호에슈트 33342	서모피셔 사이언티브 (인비트로젠)	62249	표 2 참조
마우스 히트 패드	ALA 과학 기기	히팅패드-1/2
근육 근육	잭슨 연구소	C57BL/6	실험실 쥐
생리식염수 (염화나트륨 0.9%)	써모피셔 사이언티브	7210-16
RHIT(재사용 간 영상 도구) 적용 크기	제공됨	해당 없음	표 1 참조
수술용 겸자, 굽은 팁	파인 사이언스 툴즈	11251-23
수술용 거즈	맥케슨	6939
외과용 가위	파인 사이언스 툴즈	14001-14
테트라메틸로다민 덱트론	서모피셔 사이언티브 (인비트로젠)	D7139	표 2 참조
울트라 파인 U-100 인슐린 주사기, 31 G	베티 밀스	BD326730