방법 논문

미생물의 비율계량 형광 이미징을 위한 형광단 기반 유전자 인코딩 바이오센서

DOI:

10.3791/68339

⸱

2025년 8월 1일

 ,  , 
1Department of Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 3Institute of Cell and Interaction Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 4Université de Lyon, INSA Lyon, CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 통제된 조건에서 정량적 비율 계열 형광 이미징을 위해 미생물에 형광단 기반 유전적으로 암호화된 바이오센서의 적용을 설명합니다. 이러한 바이오센싱 전략을 고급 이미징 기술과 통합함으로써 이 방법은 단일 세포 수준에서 고해상도 실시간 분석을 가능하게 하여 소분자 역학에 대한 더 깊은 통찰력을 제공합니다.

초록

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미생물 내의 소분자 역학을 조사하는 것은 미생물 기능에 대한 포괄적인 연구에 필수적입니다. 유기체 내 및 유기체 간 소분자 역학은 모두 미생물 생리학, 공생 및 질병에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 이러한 역학을 모니터링하는 것은 대부분의 기존 기술을 사용하여 여전히 매우 어렵습니다. 형광단 기반 유전자 인코딩 바이오센서는 생체 내 소분자 역학을 추적하기 위한 강력한 도구이며 새로운 발견을 주도할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 바이오센서는 형광 이미징에 가장 일반적으로 사용되며, 종종 환경 조건을 정밀하게 제어할 수 있는 관류 장치와 함께 사용됩니다. 고급 이미징 기술과 통합되면 이 접근 방식은 고해상도, 공간적, 시간적으로 분해된 데이터를 제공하여 단일 세포 미생물 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 약속에도 불구하고 이러한 바이오센서를 구현하는 것은 기술적으로 여전히 어려운 일입니다. 주요 단계를 이해하는 것은 더 광범위한 채택을 위해 매우 중요합니다. 여기에서는 통제된 조건에서 정량적 비율 계량 형광 이미징을 위해 새로 설계된 바이오센서를 미생물에 효과적으로 배치할 수 있도록 설계된 프로토콜을 제시합니다.

서론

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단일 형광단 강도 기반 및 이중 형광단 바이오센서는 연구자들이 다양한 응용 분야에 널리 사용합니다1. 일부 연구에서는 다중 바이오센서 분석을 사용하여 동일한 세포 내에서 여러 신호를 동시에 추적했습니다2. 이러한 바이오센서 중 다수는 결합 이벤트가 형광 특성을 변경하는 형태 변화를 유도하는 리간드 결합 도메인에 의존합니다 3,4. 유전적으로 인코딩된 바이오센서는다양한 시스템에서 생체 내 이미징을 위한 필수 도구가 되었으며5, 공간과 시간에서 이온 및 대사산물 수준의 고해상도 모니터링을 가능하게 합니다1. 그러나 초기 바이오센서는 동적 범위와 신호 대 잡음비(SNR)6에서 제한적이었습니다. 구조적으로 민감한 형광 단백질(csFP)을 기반으로 하는 단일 형광단 강도 측정 바이오센서의 최근 발전으로 성능이 크게 향상되었습니다. 그럼에도 불구하고, 단백질 발현 수준의 변화는 살아있는 세포에서 신호 분자 및 대....

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프로토콜

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1. 비율계량 바이오센서의 합리적인 설계(그림 1)

참고: 관심 있는 결합 단백질은 (i) 특이성, (ii) 친화도, (iii) 구조 정보 및 (iv) 리간드 결합 시 형태 재배열을 포함하는 관련 기준에 기초하여 감각 도메인으로 선택됩니다. 특이성은 바이오센서가 교차 반응성 없이 표적 분자에 선택적으로 반응하도록 보장합니다. 친화도는 생물학적 맥락에서 표적 분자의 예상 농도 범위와 일치하는 것으로 간주됩니다. AlphaFold에서 생성된 것과 같은 실험 데이터 또는 계산 모델에서 파생된 구조 정보는 감각 영역의 3차원 조직과 리간드로 인한 형태 변화에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 통찰력은 형광단에 적합한 삽입 지점을 식별하는 데 사용됩니다. 그런 다음 의도된 응용 분야에 따라 바이오센서의 반응성과 동적 범위를 평가하기 위한 검증 전략이 개발됩니다.

  1. 구조 변화에 민감한 원형 순열 녹색 형광 단백질(cpGFP)이 감각 도메인의 리간드 결합 유도 재배열에 반응하는 방식으로 Green-Apple Matryoshka12<....

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결과

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미생물 시스템에서 바이오센서의 성공적인 비율 이미징을 달성하려면 몇 가지 기술적 과제를 해결해야 합니다.

표현 시스템: 첫 번째 과제는 표현 시스템의 선택에 있습니다. 플라스미드 기반, 염색체 통합, 구성 또는 유도 프로모터에 의해 구동되는지, 세포 내 표적 태그가 있거나 없는지. 이러한 요인은 바이오센서의 안정성, 독성 및 세포 내 국소화에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다(그림 1). 과발현 또는 반대로 신호 부족으로 인한 아티팩트를 피하기 위해 최적의 발현 수준을 보장하는 것이 중요합니다. 또한 바이오센서는 숙주 세포의 생리적 기능을 보존하는 방식으로 발현되어야 합니다.

배양 밀도: 두 번째 병목 현상은 배양 밀도입니다. 미생물 성장 단계와 세포 농도는 이미징 품질에 직접적인 영향을 미칩니다. 챔버가 과밀하면 셀이 겹치고 신호 간섭이 발생하여 .......

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토론

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유전적으로 암호화된 형광단 기반 바이오센서를 사용하면 살아있는 세포의 세포내 분석물 농도를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다1. 이러한 바이오센서는 일반적으로 형태 변화를 비례 측정 또는 강도 측정으로 감지할 수 있는 광학 신호로 변환하여 작동합니다. 강도 측정 바이오센서는 단일 FP의 형광 강도 변화에 의존하므로 바이오센서 풍부도의 변화에 민감하여 잠재적인 측정 편향을 초래합니다. 이 문제는 스펙트럼적으로 서로 다른 두 FP의 형광을 동시에 측정하는 비율계량 바이오센서를 사용하여 완화할 수 있습니다. 이러한 방출의 비율은 바이오센서 풍부도와 무관하게 보다 신뢰할 수 있는 판독값을 제공합니다 9,12. 그러나 비율계량 접근법은 제한된 스펙트럼 공간으로 인해 제한되어 여러 바이오센서 또는 추가 형광 마커의 공동 발현을 제한합.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 프랑스 "Agence National de la Recherche(ANR)- PROJET N° ANR-24-CPJ1-0014-01to MS의 주니어 교수직 의장의 자금 지원을 받았으며 스페인 "Agencia Estatal de Investigación(AEI), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades"(TED2021-129691B-I00)와 V.C.R.에 수여된 말라가 대학교 펠로우십(B1-2022_03)의 지원으로 지원되었습니다. 바이오센서 이미징 및/또는 현미경 시스템에 대한 접근에 대해 유익한 논의를 해준 하인리히 하이네 대학교의 고급 이미징 센터(CAi)와 리옹 대학교의 리옹 멀티스케일 이미징 센터(LyMIC)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천시그마-알드리치 주식회사A5306-250G
반수체 효모 세포용 CellASIC ONIX 플레이트 머크 KGaAY04C-02-5PK
CellASIC ONIX2머크 KGaACAX2-S0000
CSM-우라써모 피셔 사이언티픽11387899
D-포도당시그마-알드리치 주식회사G8270-100G
D-소르비톨시그마-알드리치(주)S1876-10MG
NaCl시그마-알드리치(주)S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6sNA7효모에서 GA-MatryoshCaMP6s 발현 TCS
SP8 STEDLeicaNA
효모 균주 K601/W303-1A MAT-aNA8ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNBBocaScientificGCM16.0500
α-짝짓기 인자 아세테이트 염그마-알드리치 주식회사T6901-.5MG
시

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38, 2833-2841 (2009).
  2. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detect....

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