방법 논문

미생물의 비율계량 형광 이미징을 위한 형광단 기반 유전자 인코딩 바이오센서

DOI:

10.3791/68339

⸱

2025년 8월 1일

 ,  , 
1Department of Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 3Institute of Cell and Interaction Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 4Université de Lyon, INSA Lyon, CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 통제된 조건에서 정량적 비율 계열 형광 이미징을 위해 미생물에 형광단 기반 유전적으로 암호화된 바이오센서의 적용을 설명합니다. 이러한 바이오센싱 전략을 고급 이미징 기술과 통합함으로써 이 방법은 단일 세포 수준에서 고해상도 실시간 분석을 가능하게 하여 소분자 역학에 대한 더 깊은 통찰력을 제공합니다.

초록

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미생물 내의 소분자 역학을 조사하는 것은 미생물 기능에 대한 포괄적인 연구에 필수적입니다. 유기체 내 및 유기체 간 소분자 역학은 모두 미생물 생리학, 공생 및 질병에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 이러한 역학을 모니터링하는 것은 대부분의 기존 기술을 사용하여 여전히 매우 어렵습니다. 형광단 기반 유전자 인코딩 바이오센서는 생체 내 소분자 역학을 추적하기 위한 강력한 도구이며 새로운 발견을 주도할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 바이오센서는 형광 이미징에 가장 일반적으로 사용되며, 종종 환경 조건을 정밀하게 제어할 수 있는 관류 장치와 함께 사용됩니다. 고급 이미징 기술과 통합되면 이 접근 방식은 고해상도, 공간적, 시간적으로 분해된 데이터를 제공하여 단일 세포 미생물 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 약속에도 불구하고 이러한 바이오센서를 구현하는 것은 기술적으로 여전히 어려운 일입니다. 주요 단계를 이해하는 것은 더 광범위한 채택을 위해 매우 중요합니다. 여기에서는 통제된 조건에서 정량적 비율 계량 형광 이미징을 위해 새로 설계된 바이오센서를 미생물에 효과적으로 배치할 수 있도록 설계된 프로토콜을 제시합니다.

서론

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단일 형광단 강도 기반 및 이중 형광단 바이오센서는 연구자들이 다양한 응용 분야에 널리 사용합니다1. 일부 연구에서는 다중 바이오센서 분석을 사용하여 동일한 세포 내에서 여러 신호를 동시에 추적했습니다2. 이러한 바이오센서 중 다수는 결합 이벤트가 형광 특성을 변경하는 형태 변화를 유도하는 리간드 결합 도메인에 의존합니다 3,4. 유전적으로 인코딩된 바이오센서는다양한 시스템에서 생체 내 이미징을 위한 필수 도구가 되었으며5, 공간과 시간에서 이온 및 대사산물 수준의 고해상도 모니터링을 가능하게 합니다1. 그러나 초기 바이오센서는 동적 범위와 신호 대 잡음비(SNR)6에서 제한적이었습니다. 구조적으로 민감한 형광 단백질(csFP)을 기반으로 하는 단일 형광단 강도 측정 바이오센서의 최근 발전으로 성능이 크게 향상되었습니다. 그럼에도 불구하고, 단백질 발현 수준의 변화는 살아있는 세포에서 신호 분자 및 대사 산물을 시각화하는 데 일반적으로 사용되는 유전적으로 암호화된 형광단 기반 바이오센서6를 사용하여 생체 내 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 7,8. 단일 형광단 강도 측정 바이오센서는 생체 내에서 변동할 수 있는 바이오센서 발현 수준에 대한 정규화를 허용하지 않습니다. 그러나 참조 형광 단백질을 통합하면 단일 형광단 바이오센서를 이중 형광단 비율계 버전으로 변환하여 보다 신뢰할 수 있는 정량화가 가능해질 수 있습니다9. 비방사 과정으로 인한 에너지 손실로 인해 형광 방출 스펙트럼은 흡수 스펙트럼에 비해 이동하며, 이는 스토크스 시프트10으로 알려진 현상입니다. LSSFP(Large Stokes Shift Fluorescent Protein)는 이중 형광단 비율계 바이오센서 9,11에서 최적의 참조 형광단으로 사용되었습니다. 최근의 발전은 LSSmApple12라고 하는 빨간색 LSSFP를 통합하는 GA-MatryoshCaMP6s로 알려진 단색 흥분성 Green-Apple(GA) Matryoshka 바이오센서의 개발입니다. 미세유체 시스템과 같은 마이크로 장치와 결합하면 형광단 기반 유전자 인코딩 바이오센서는 공초점 현미경과 같은 기술을 사용하여 정량적 비율 이미징을 위한 최소 침습적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 통합을 통해 환경 스트레스 하에서 단일 세포의 소분자 역학을 고속 이미징하고 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어, cAMP 및 포도당 바이오센서는 효모에 성공적으로 적용되었습니다. 돌연변이 균주와 함께 사용될 때 이러한 바이오센서는 당 흡수를 제어하는 주요 규제 네트워크를 밝히는 데 도움이 되었습니다13,14. 상당한 진전에도 불구하고 이러한 기술은 아직 생체 내 소분자 역학과 관련된 중요한 생물학적 질문을 조사하는 데 있어 잠재력을 최대한 발휘하지 못했습니다 15. 결과적으로 실험실 전반에 걸쳐 널리 채택되는 것은 여전히 제한적이며, 광범위한 구현을 위한 표준화된 방법론은 여전히 부족합니다.

비비율계 단일 형광단 바이오센서 또는 벌크 수준 측정에 의존하는 기존 방법론과 비교할 때 GA Matryoshka 바이오센서를 기반으로 하는 당사의 프로토콜은 정량적 비율계량 분석을 통해 고해상도 단일 세포 이미징을 가능하게 합니다. 대형 Stokes 이동 형광단을 내부 참조로 통합함으로써 이 방법은 이전 설계의 주요 한계인 바이오센서 발현의 변동성을 보상합니다. 또한, 미세유체 장치와의 조합은 환경 조건을 정밀하게 제어할 수 있게 하여 기존의 관류 챔버 또는 정적 배양 시스템(12)에 비해 개선됩니다. 이 접근 방식은 또한 식물-병원체 상호 작용 및 균근과 같은 공생 연관성과 같은 미생물과 숙주 간의 동적 상호 작용을 연구하는 데 뚜렷한 이점을 제공하며, 여기서 세포 수준의 공간적, 시간적 해상도는 의사소통 및 영양 교환의 분자 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다.

이러한 맥락에서 우리는 미생물의 비율 측정 바이오센서 이미징을 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 효모에서의 구현에 특별히 최적화되었지만 이 프로토콜은 박테리아를 포함한 다른 미생물에 사용하도록 조정될 수 있으며 식물 관련 미생물과 같은 비모델 유기체로 확장될 수 있습니다. 예를 들어, 바이오센서는 효모에서 칼슘 신호 전달의 정량적 형광 이미징을 위해 미세유체 시스템과 함께 사용될 수 있으며, 환경 스트레스 하에서 칼슘 반응을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다14.

이 프로토콜은 연구자들이 새로 설계된 바이오센서를 효과적으로 배포하도록 안내하여 미생물 시스템에서 바이오센서 기반 형광 이미징을 통해 생물학적 과정의 탐색을 발전시키기 위한 것입니다. 여기에는 효모 배양 조건, 최적의 흥분/방출 설정, 일반적으로 사용되는 효모 균주(예: K601 및 W303-1A MAT-a)와의 호환성에 대한 실용적인 권장 사항이 포함되어 있습니다. 주목할만한 한계에는 장시간 이미징 세션 중 광표백과 생물학적 샘플의 바이오센서 발현과 관련된 문제가 포함됩니다. 수많은 요인이 생체 내 바이오센서 이미징 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이 단계별 프로토콜은 연구자가 잠재적인 문제를 예측하고 극복하여 재현 가능한 구현을 촉진하도록 돕는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

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1. 비율계량 바이오센서의 합리적인 설계(그림 1)

참고: 관심 있는 결합 단백질은 (i) 특이성, (ii) 친화도, (iii) 구조 정보 및 (iv) 리간드 결합 시 형태 재배열을 포함하는 관련 기준에 기초하여 감각 도메인으로 선택됩니다. 특이성은 바이오센서가 교차 반응성 없이 표적 분자에 선택적으로 반응하도록 보장합니다. 친화도는 생물학적 맥락에서 표적 분자의 예상 농도 범위와 일치하는 것으로 간주됩니다. AlphaFold에서 생성된 것과 같은 실험 데이터 또는 계산 모델에서 파생된 구조 정보는 감각 영역의 3차원 조직과 리간드로 인한 형태 변화에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 통찰력은 형광단에 적합한 삽입 지점을 식별하는 데 사용됩니다. 그런 다음 의도된 응용 분야에 따라 바이오센서의 반응성과 동적 범위를 평가하기 위한 검증 전략이 개발됩니다.

  1. 구조 변화에 민감한 원형 순열 녹색 형광 단백질(cpGFP)이 감각 도메인의 리간드 결합 유도 재배열에 반응하는 방식으로 Green-Apple Matryoshka12 카세트를 감각 도메인에 삽입하여 마트료시카 디자인을 실리코로 구성합니다.
    1. Chimera와 같은 분자 시각화 소프트웨어를 사용하여 결합 도메인의 구조를 분석합니다. 3차원 구조를 사용할 수 없는 경우 AlphaFold를 사용하여 신뢰할 수 있는 모델을 생성합니다.
    2. 단백질 구조 내의 유연한 루프를 단백질의 전반적인 기능이나 안정성을 방해하지 않도록 선택된 이중 형광단 카세트의 약점 및 잠재적 삽입 부위로 식별합니다.
    3. AlphaFold를 다시 사용하여 삽입된 이중 FP 카세트를 포함하는 키메라 단백질의 구조를 예측하여 삽입이 불리한 구조 변화를 일으키지 않는지 확인합니다.
    4. 바이오센서 구조물을 효모 세포에서 발현을 가능하게 하는 플라스미드 DNA로 복제합니다. 구체적으로, 새로운 설계된 바이오센서를 암호화하는 유전자를 효모 발현을 위한 적절한 요소를 포함하는 효모 셔틀 벡터 pAG416에 적절한 클로닝 기법(12,13,14)을 사용하여 삽입한다.
    5. 클로닝 후, 플라스미드 DNA의 증폭을 위해 재조합 플라스미드를 박테리아 세포로 형질전환합니다. 효모 형질전환을 위해 정제된 플라스미드 DNA를 사용합니다.
    6. 발표된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 형질전환을 통해 정제된 플라스미드를 효모 세포에 도입합니다16. URA3 선택 마커를 운반하는 플라스미드를 포함하는 양성 클론을 선택하는 우라실 결핍 배지에서 형질전환된 효모 세포를 플레이트합니다.

2. 샘플 준비

  1. GA-Matryoshka 바이오센서를 선택적 배지 플레이트(즉, SC-Ura)에 발현하는 줄무늬 효모 형질전환체를 선택하고 콜로니 성장을 허용하기 위해 30°C에서 2-3일 동안 배양합니다.
    참고: 효모 균주는 플라스미드의 URA3 유전자에 의해 보완되는 ura3동물영양을 가지고 있어 우라실 결핍 배지에서 선택할 수 있습니다. 바이오센서를 암호화하는 플라스미드는 영양소를 보완하는 카세트(예: pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s)를 포함한다.
  2. 균주 K601/W303-1A MAT-a(유전자형: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100)에서 효모 형질전환체를 생성합니다. pAG41612와 같이 Saccharomyces cerevisiae에 일반적으로 사용되는 발현 벡터로 형질전환을 수행합니다.
  3. 형질전환 후, 독립적으로 형질전환된 콜로니가 나타날 때까지 다음과 같이 리터당 준비된 SC-Ura 배지에서 효모 세포를 30°C에서 배양합니다: 0.77g CSM-Ura, 황산암모늄, 포도당 20g, 한천 20g, 최종 농도 150μM에 첨가된 아데닌 6.7g.
  4. 유능한 효모 세포를 준비하고 확립된 프로토콜에 따라 PEG 3350 매개 형질전환을 수행합니다16.
  5. 미세유체 세포 트래핑 실험의 경우, 25% 글리세롤 스톡을 SC-Ura 플레이트에 줄무늬로 만들고 30°C에서 2일 동안 배양하여 독립적인 단일 콜로니의 성장을 허용합니다. 개별 콜로니를 액체 SC-Ura 배지 5mL에 재현탁하고 OD600이 0.5-1.0에 도달할 때까지 흔들면서 30°C에서 배양하여 관류 시스템에 로딩하기에 적합하게 만듭니다.

3. 관류 시스템의 준비(그림 2)

  1. GA-Matryoshka 바이오센서를 발현하는 효모 세포 50μL와 성장용 최종 SC-Ura 배지 및 처리용 완충 용액(예: NaCl 또는 소르비톨)을 로딩하여 반수체 효모 세포용 미세유체 플레이트를 준비합니다.
    1. 웰 1-8에서 저장 용액을 제거합니다. 웰에서 인산염 완충 식염수(PBS) 용액을 흡인하고 멸균수 400μL를 추가합니다.
    2. 우물 1-6과 8을 씻습니다. 세척 1: 웰 1-8에서 멸균수 용액을 흡인하고 멸균수 400μL를 추가합니다. 세척 2: 흡인하고 400μL의 멸균수를 추가하여 세척을 반복합니다. 세척 3: 멸균수 400μL로 한 번 더 반복합니다.
    3. 웰 1-6의 최종 채우기: 수용액을 흡인하고 효모 성장을 위한 SC-Ura와 같은 최종 관류/성장 용액 또는 처리를 위해 관심 분석물을 포함하는 완충 용액 300μL를 추가합니다.
    4. 웰 8의 세포 로딩: 효모 세포 현탁액 50μL(OD600=0.5-1.0)를 첨가합니다.
  2. 미세유체 플랫폼의 온도 제어 매니폴드로 플레이트를 밀봉하고 라이브 셀 이미징 시스템에 연결합니다. 매니 폴드는 28 ° C의 온도에서 안정적인 열 환경을 유지하는 반면, 튜브와 펌프는 적절한 밀봉과 지속적인 관류를 보장합니다.
    1. 플레이트를 매니폴드에 맞춥니다. 진공청소기를 켭니다. 미세유체 플랫폼을 켭니다.
    2. 봉인을 누르고 녹색 표시등이 켜질 때까지 기다리십시오. 미세유체 플랫폼 소프트웨어를 열고 새 실험을 생성한 다음 드롭다운 목록에서 적절한 효모 플레이트를 선택합니다.
    3. Run Liquid Priming Sequence 버튼을 클릭합니다. Run Cell Loading Sequence를 클릭하여 웰 8에서 배양 챔버로 효모 세포를 로드하고, 그곳에서 28°C에서 10kPa에서 밤새 선택적 배지 SC-Ura의 연속 관류 하에 포획 및 성장합니다.
    4. 수동 모드 탭에서 사용자 정의 시퀀스 실행 을 클릭하거나 프로토콜 편집기를 사용하여 30°C의 온도, 10kPa의 유속, 스텝 지속 시간(예: 10분) 및 관류를 위해 열 채널과 같은 실험 매개변수를 설정합니다.
  3. 28°C 및 10-17kPa의 압력에서 선택적 배지 SC-Ura를 사용하여 연속 관류 하에 배양 챔버에서 밤새 세포를 성장시킵니다.

4. 비율계량 형광 이미징(그림 3, 그림 4 및 비디오 1)

  1. 신속한 현미경 시각화를 통해 세포 성장과 형광을 평가합니다.
    1. 미세유체 플레이트를 도립 현미경의 스테이지에 놓습니다. 보기 영역의 중앙에 초점을 맞춰 셀을 찾습니다.
    2. 명시야 및/또는 형광 현미경을 사용하여 세포 형태, 생존력 및 바이오센서 발현을 평가합니다.
  2. 미세유체 시스템 및 호환 가능한 미세유체 플레이트 4,12,13,14를 사용하여 정밀하게 제어된 조건에서 칼슘 정상 상태 역학을 조사합니다.
  3. 100배 배율 및 1.40의 개구수(NA)를 가진 도립 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포 이미징을 수행합니다. 아르곤 레이저를 사용하여 488nm에서 GFP 및 LSSmApple을 여기시켜 이중 형광단 바이오센서를 모니터링합니다. GFP의 경우 520nm, LSSmApple의 경우 610nm에서 방출 신호를 수집하고(그림 5) 비율계량 형광 이미징 실험을 수행하여 바이오센서의 동적 반응을 정량화합니다. 시간 경과에 따른 방출 강도 비율(GFP/LSSmApple)을 측정하여 분석물로 인한 변화를 모니터링합니다.

5. 오픈 소스 소프트웨어를 사용한 이미지 분석(그림 6)

  1. 공식 저장소에서 CellProfiler 또는 기타 유사한 소프트웨어를 가져와 로컬 워크스테이션에 설치합니다.
  2. 타임랩스 형광 현미경 이미지를 순차적인 순서(예: img_001.tif, img_002.tif 등)로 구성하여 자동화된 배치 처리와의 호환성을 보장합니다.
  3. 소프트웨어를 실행하고 새 프로젝트를 선택하여 새 해석 파이프라인을 초기화합니다. 타임랩스 이미지 시퀀스를 파이프라인 작업 영역으로 가져옵니다.
  4. IdentifyPrimaryObjects 모듈을 통합하여 형광 신호 또는 형태학적 기준에 따라 각 프레임 내의 개별 세포를 검출합니다.
  5. TrackObjects 모듈을 추가하여 프레임 간 셀 간의 시간적 대응을 설정하여 시간 경과에 따른 단일 셀 추적을 가능하게 합니다.
  6. 추적된 각 세포에 대한 형광 강도 매개변수(예: 평균, 중앙값 및 통합 강도)를 정량화하는 MeasureObjectIntensity 모듈을 포함합니다.
  7. ExportToSpreadsheet 모듈을 사용하여 다운스트림 분석을 위해 정량적 데이터를 컴파일하고 표 형식(예: CSV)으로 내보낼 수 있습니다.
  8. 스프레드시트 소프트웨어와 같은 통계 또는 데이터 시각화 도구를 사용하여 내보낸 데이터를 분석합니다.

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결과

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미생물 시스템에서 바이오센서의 성공적인 비율 이미징을 달성하려면 몇 가지 기술적 과제를 해결해야 합니다.

표현 시스템: 첫 번째 과제는 표현 시스템의 선택에 있습니다. 플라스미드 기반, 염색체 통합, 구성 또는 유도 프로모터에 의해 구동되는지, 세포 내 표적 태그가 있거나 없는지. 이러한 요인은 바이오센서의 안정성, 독성 및 세포 내 국소화에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다(그림 1). 과발현 또는 반대로 신호 부족으로 인한 아티팩트를 피하기 위해 최적의 발현 수준을 보장하는 것이 중요합니다. 또한 바이오센서는 숙주 세포의 생리적 기능을 보존하는 방식으로 발현되어야 합니다.

배양 밀도: 두 번째 병목 현상은 배양 밀도입니다. 미생물 성장 단계와 세포 농도는 이미징 품질에 직접적인 영향을 미칩니다. 챔버가 과밀하면 셀이 겹치고 신호 간섭이 발생하여 ...

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토론

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유전적으로 암호화된 형광단 기반 바이오센서를 사용하면 살아있는 세포의 세포내 분석물 농도를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다1. 이러한 바이오센서는 일반적으로 형태 변화를 비례 측정 또는 강도 측정으로 감지할 수 있는 광학 신호로 변환하여 작동합니다. 강도 측정 바이오센서는 단일 FP의 형광 강도 변화에 의존하므로 바이오센서 풍부도의 변화에 민감하여 잠재적인 측정 편향을 초래합니다. 이 문제는 스펙트럼적으로 서로 다른 두 FP의 형광을 동시에 측정하는 비율계량 바이오센서를 사용하여 완화할 수 있습니다. 이러한 방출의 비율은 바이오센서 풍부도와 무관하게 보다 신뢰할 수 있는 판독값을 제공합니다 9,12. 그러나 비율계량 접근법은 제한된 스펙트럼 공간으로 인해 제한되어 여러 바이오센서 또는 추가 형광 마커의 공동 발현을 제한합...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 프랑스 "Agence National de la Recherche(ANR)- PROJET N° ANR-24-CPJ1-0014-01to MS의 주니어 교수직 의장의 자금 지원을 받았으며 스페인 "Agencia Estatal de Investigación(AEI), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades"(TED2021-129691B-I00)와 V.C.R.에 수여된 말라가 대학교 펠로우십(B1-2022_03)의 지원으로 지원되었습니다. 바이오센서 이미징 및/또는 현미경 시스템에 대한 접근에 대해 유익한 논의를 해준 하인리히 하이네 대학교의 고급 이미징 센터(CAi)와 리옹 대학교의 리옹 멀티스케일 이미징 센터(LyMIC)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천시그마-알드리치 주식회사A5306-250G
반수체 효모 세포용 CellASIC ONIX 플레이트 머크 KGaAY04C-02-5PK
CellASIC ONIX2머크 KGaACAX2-S0000
CSM-우라써모 피셔 사이언티픽11387899
D-포도당시그마-알드리치 주식회사G8270-100G
D-소르비톨시그마-알드리치(주)S1876-10MG
NaCl시그마-알드리치(주)S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6sNA7효모에서 GA-MatryoshCaMP6s 발현 TCS
SP8 STEDLeicaNA
효모 균주 K601/W303-1A MAT-aNA8ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNBBocaScientificGCM16.0500
α-짝짓기 인자 아세테이트 염그마-알드리치 주식회사T6901-.5MG
시

참고문헌

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  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, 676-682 (2012).
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