방법 논문

액적 전달 방법을 사용하여 거대한 단층 소포를 안정적으로 준비

DOI:

10.3791/68340

⸱

2025년 9월 19일

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 초보자 가이드는 액적 전달 방법을 통해 GIV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시하고, 중요한 단계를 논의하고, 합성 생물학 및 마이크로로보틱스를 포함한 다양한 응용 분야에 필요한 가능한 조정에 도움이 되는 통찰력을 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 20년 동안 역 에멀젼, 이중 에멀젼, 상 전달 또는 에멀젼 전달이라고도 알려진 액적 전달 방법은 GUV(Giant Unilamellar Vesicles)의 제조, 특히 다양한 화물을 적재하는 데 유리한 것으로 입증되어 합성 생물학에서 중요한 역할을 합니다. 캡슐화의 효율성과 실행의 단순성으로 인해 인공 세포 개발에 널리 사용되었습니다. 문헌에서 여러 매개변수의 큰 변동성이 관찰되어 매우 다양한 결과를 초래합니다. 이는 부분적으로 이 다재다능한 방법의 다양한 요구 사항과 적용에 필요한 조정 때문이지만, 이 기술에 처음 접근하는 연구자에게는 방향 감각을 잃을 수 있습니다.

초보자에게 방법과 중요한 매개변수의 역할에 대한 기본적인 이해를 제공하기 위해 액적 전달을 통한 GUV 형성의 기초가 되는 기본 물리화학적 원리에 대한 힌트와 함께 프로토콜이 제시됩니다. 따라서 GUV 준비를 위한 이 단계별 가이드에는 문헌과 직접적인 경험을 기반으로 한 고려 사항과 실용적인 제안이 포함되어 있습니다.

가변성의 가능한 원인을 고려할 때 몇 가지 측면이 중요한 것으로 식별됩니다: 빛, 산화 및 가수분해에 대한 인지질의 민감성; 인지질(지질 용액 또는 LS)을 용해시키기 위한 오일의 선택; 원심분리 후 GUV의 회수. 대기 중 산소와 습도의 간섭을 최소화하기 위한 비용 효율적인 조치가 제안됩니다. 오일과 인지질의 적절한 조합을 식별하는 데 도움이 되도록 일반 프로토콜은 LS의 관련 물리화학적 특성에 대한 논의로 보완됩니다. 마지막으로, 비실용적인 절차를 피하기 위해 유상을 한 번에 완전히 제거하고 깨끗한 GUV 분산액을 회수하는 간단하고 안전한 방법이 제안됩니다. 이러한 조치는 새로운 GUV 구성에 대한 조정 구현 속도를 높여 잠재적으로 합성 생물학 및 마이크로로봇을 포함한 인근 분야에서의 채택을 확대합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

리포좀1을 생산하기 위해 이전에 기술된 기술을 구현하면서, Pautot et al. 직경2에서 직경이 0.1 내지 1μm 범위인 지질 소포를 생산하기 위한 프로토콜을 확립했습니다. 액적 전달 방법은 더 큰 소포(직경 1μm를 초과)3 생산하는 데 효과적인 것으로 빠르게 입증되었으며, 실행의 단순성과 높은 캡슐화 효율성으로 인해 점점 인기를 얻고 있습니다. 실제로, 팽윤 방법(예: 겔 팽윤 또는 전기 주조)과 비교하여 이 프로토콜은 비슷한 수의 소포 및 관련 폐기물을 형성하는 데 필요한 화물 용액의 부피를 줄입니다4. GUV는 비슷한 캡슐화 효율을 가진 대체 방법을 통해 유체 인터페이스에서 조립할 수 있습니다. 그러나 미세유체 칩 5,6 또는 cDICE(Continuous Droplet Interface-Crossing Encapsulation)7를 기반으로 하는 것과 비교할 때 액적 이송은 기본 장비를 갖춘 모든 실험실에서 저렴한 가장 간단한 설정을 제공합니다. 또한 미세유체 방법은 멤브레인에 원치 않는 오일 내포물이 있는 GUV로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로 액적 이송은 인공 세포 3,8,9,10 및 최근에는 마이크로로보틱스 11,12 분야에서 귀중한 화물을 GUV에 적재하기 위해 선택되는 방법이었습니다.

이 방법은 인지질에 의해 매개되는 물/기름 계면의 안정화를 통한 막의 전단지 형성을 기반으로 합니다. 먼저 인지질을 오일(지질 용액, LS)에 용해시킨 후 유성 LS에 원하는 GUV 화물(내부 용액, IS)을 함유한 수용액으로 유중수 에멀젼을 제조합니다. 그런 다음 에멀젼을 다른 수용액(외부 용액, OS)이 이전에 LS와 평형을 이루어 물-기름 계면을 형성한 튜브로 옮겨집니다. GUV는 물방울이 원심분리에 의해 이 OS/LS 인터페이스를 통과하도록 강제될 때 형성됩니다: GUV의 내부 전단지는 IS 물방울 표면에 형성되고 외부 전단지는 OS와 LS 사이에 형성됩니다(그림 1).

많은 프로토콜 변형이 우발적인 실험 요구에 따라 조정된 매개변수로 설명되었습니다. 프로세스를 최적화하기 위한 첫 번째 광범위한 시도는 Moga et al.13에 의해 설명되었으며, Zhang et al. 최근 검토에서 대부분의 관련 사례를 수집했습니다14. 프로토콜에 영향을 미치는 많은 설명된 매개변수에도 불구하고 새로운 GUV 제형에 대한 최적화 프로세스를 수행할 수 있는 방법이나 생산 후 GUV 회수 및 조작에 대한 모범 사례에 대한 표시는 없습니다. 이용 가능한 과학 문헌과 직접적인 경험을 바탕으로 기본 원칙을 논의하면서 GUV를 생산하기 위한 일반적인 프로토콜을 제공합니다. 이를 통해 새로운 GUV 제형의 최적화에 유용한 적응증과 프로토콜에 항상 적용할 수 있는 두 가지 예방 조치, 즉 통제된 환경에서 LS를 준비하는 방법과 깨끗한 GUV 샘플의 회수를 위해 상부 오일상을 쉽게 제거하는 방법을 제공합니다. 우리는 두 가지 예를 선택했습니다: 하나는 IS로 240mM 자당, LS로 시리코 오일 AR20에 0.2mM DOPC를 사용하고(조건 E[비어 있음], 표 1 참조), 다른 하나는 IS로 240mM 자당에 0.2% 1.1μm 폴리스티렌 미립자, LS로 광유에 3.18mM DOPC로 구성됩니다(조건 P [입자 포함], 표 1 참조). 두 샘플 모두 240mM 포도당을 OS로 사용하여 생산되었습니다. 우리는 생리학적 조건에서 이완된 지질막(낮은 막 장력)을 갖는 GUV를 얻기 위해 이 삼투압을 선택했습니다.

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그림 1: 액적 전달 방법의 개략도. (A) 지질 용액을 형성하기 위한 오일(황색상)의 인지질, 내부 용액으로 자당 함유 용액(청록색), 외부 용액으로 등삼투압 포도당 용액(백색)의 세 가지 용액을 별도의 바이알에 준비합니다. (B) 그런 다음 LS를 IS와 혼합하여 안정적인 에멀젼을 형성한 다음 (C) (D) 에멀젼을 그 위에 붓기 전에 OS와 LS 사이의 인터페이스가 평형을 이룰 수 있습니다. (E) 물방울은 원심력에 의해 LS/OS 계면을 가로질러 강제로 (F) GUV의 형성을 허용합니다. 이 그림은 축척이 아니며 방법의 개략도만 제공하기 위한 것입니다. 약어: LS = 지질 용액; IS = 내부 솔루션; OS = 외부 솔루션; GUV = 거대한 단층 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

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알림: 달리 명시되지 않는 한 공정은 실온에서 수행됩니다.

1. 용액 준비

  1. 수용액(IS 및 OS)의 준비
    1. 두 개의 서로 다른 계량 보트에서 포도당 2.16g과 표 1에 지정된 자당의 양을 측정합니다. 분말을 150mL 비커 2개에 넣고 초순수 40mL를 넣고 저어주면서 혼합합니다.
    2. 용액을 2개의 50mL 실린더에 옮기고 최대 50mL의 초순수를 첨가하여 표 1에 표시된 농도의 240mM 포도당 용액 및 자당 용액을 얻습니다. 실린더를 파라필름 조각으로 덮고 실린더를 몇 번 뒤집어 용액을 혼합합니다.
    3. 미생물에 의한 오염을 방지하기 위해 50mL 주사기와 0.22μm 필터로 용액을 여과합니다.
    4. 조건 P의 경우, 다음 혼합물을 준비합니다: 100 mg/mL 1.1 μm 폴리스티렌 입자 분산액 2 μL, 1.1.1단계에서 제조된 자당 용액 24 μL, 최대 100 μL의 초순수(최종 현탁액: 240 mM 자당 용액에 0.2% 미립자). 용액을 +4°C에서 최대 1주일 동안 보관하거나 1.5mL 튜브에 1mL 분취량을 준비하고 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관합니다.
  2. 통제된 환경에서 LS를 준비하기 위한 장갑 챔버 설정
    1. 내경 7mm, 외경 13mm, 표 2 에 표시된 길이의 실리콘 파이프 5개(파이프 1-5)를 절단합니다.
    2. 내경 3mm, 외경 7mm, 표 2 에 표시된 길이의 실리콘 파이프 4개(파이프 6-9)를 절단합니다.
    3. 파이프 1의 한쪽 끝을 양방향 밸브에 연결하고 다른 쪽 끝을 3방향 접합부에 연결합니다(그림 2A).
    4. 파이프 2를 양방향 밸브의 다른 말단에 연결한 다음 파이프 3과 파이프 4를 3방향 접합부에 연결하고 파이프 3을 파이프 1의 반대쪽 끝에 연결합니다(그림 2A).
    5. 파이프 4의 자유단을 장갑 챔버의 입구(입구 파이프, 그림 2B)에 연결합니다.
    6. 글러브 챔버와 함께 제공되는 3방향 밸브를 출구에 연결한 다음 밸브를 파이프 5(출구 파이프, 그림 2C)에 연결합니다.
    7. 파이프 6의 한쪽 끝을 18G 바늘에 연결하고 다른 쪽 끝을 양방향 접합부에 연결합니다. 파이프 7과 21G 바늘로 이 작업을 반복합니다(그림 2D).
    8. 격막이 있는 바이알 캡에 두 개의 바늘을 삽입합니다: 이 바늘 베어링 캡은 질소의 유입과 질소 및 클로로포름의 유출을 제어합니다. 바늘과의 접촉을 피하기 위해 캡이 없는 빈 50mL 튜브에 캡을 보관하십시오(그림 2D).
    9. 파이프 8과 9를 각각 장갑 챔버 내부의 입구 및 출구 구멍에 짜서 삽입합니다(그림 2E).
  3. LS의 준비
    1. 장갑실을 화학 후드 내부 또는 옆으로 이동합니다. 장갑 챔버를 열고 챔버 바닥에 실리카 입자로 채워진 결정화기를 삽입합니다(그림 2F). 결정화기를 흰색 지지 표면으로 덮고 종이 타월로 덮습니다.
    2. 장갑 챔버에 필요한 모든 재료를 삽입합니다(그림 2G): 습도계, 클로로포름 용액의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 오일(표 1), 깨끗한 20mL 어두운 유리 바이알(개봉 및 각 캡 포함), 해밀턴 주사기(표 1), P10000 마이크로피펫 및 팁. 클로로포름 용액이 들어 있는 유리 바이알을 코르크 링 홀더, 150mL 비커 또는 기타 적절한 홀더에 작업자 쪽에 최대한 가깝게 놓습니다.
      알림: 이 예방 조치는 진공 및 질소 흐름 주기에 걸쳐 장갑의 팽창 및 수축으로 인해 병이 기울어지는 것을 방지합니다.
    3. 장갑실을 닫고 두 반쪽이 미끄러지지 않도록 하고 장갑실과 함께 제공된 플라스틱 나사로 밀봉합니다.
    4. 출구 밸브를 닫고 파이프 5를 물을 반쯤 채운 500mL 비커에 담그십시오(그림 2H).
    5. 흡입 파이프(파이프 2)의 밸브 조절 끝을 진공 라인에 연결하고 다른 쪽 끝을 질소(파이프 3, 그림 2A)에 연결합니다. 이제 그림 2J와 같이 장갑실이 완전히 설정되었습니다.
    6. 감압으로 인해 장갑이 너무 단단해져서 구부릴 수 없을 정도로 팽창할 때까지 밸브와 진공 라인을 엽니다. 진공 라인과 밸브를 닫습니다.
    7. 압력으로 인해 장갑이 장갑실에서 나올 정도로 수축될 때까지 질소를 엽니다. 질소 라인을 닫습니다.
    8. 1.3.6-1.3.7단계를 10회 이상 반복하여 내부 습도가 40% 미만으로 떨어지도록 합니다.
    9. 작업자가 장갑을 쉽게 착용할 수 있도록 진공과 질소로 내부 압력을 제어합니다.
    10. Hamilton 주사기를 사용하여 표 1 에 표시된 클로로포름 용액의 DOPC 부피를 어두운 유리 바이알로 옮깁니다. 1.2.9단계에서 준비한 바늘 베어링 캡으로 바이알을 닫습니다.
    11. 양방향 접합을 통해 파이프 6을 파이프 8에 연결하고 파이프 7을 파이프 9에 연결합니다(그림 2I).
    12. 장갑을 벗고 출구 밸브를 엽니다.
      참고: 두 번째 운영자는 1.3.13단계부터 1.3.15단계까지 프로세스 속도를 높이는 데 도움을 줄 수 있습니다.
    13. 질소 흐름을 매우 천천히 열고 파이프 5가 이전에 배치된 비커의 기포를 관찰하여 가스 흐름을 확인합니다(단계 1.3.4). 개별 기포가 관찰 가능한 상대적으로 높은 속도에 도달 할 때까지 질소 흐름을 점진적으로 조정하십시오. 질소가 3분 동안 흐르도록 한 다음 질소 라인을 닫습니다.
      참고: 과도한 질소 압력은 클로로포름의 DOPC 용액이 바이알 전체에 분산되어 후속 지질 용액(LS)에 사용할 수 있는 인지질의 양을 감소시킬 수 있습니다. 또한 압력이 높으면 바늘이 바이알에서 배출될 위험이 높아집니다. 따라서 질소 흐름을 통제할 수 없는 튀김 없이 클로로포름을 부드럽게 저어주는 최적의 수준으로 주의 깊게 조정하는 것이 중요합니다.
    14. 그 동안 결정화기에 수조를 준비하고 핫플레이트에서 80°C로 가열합니다.
    15. 비커에서 마지막 기포가 나올 때까지 기다린 다음 출구 밸브를 닫습니다. 장갑을 다시 착용하고 양방향 접합부에서 파이프 8과 9를 분리합니다.
    16. 어두운 바이알에서 모든 클로로포름이 증발했는지 확인한 다음 바이알을 열고 캡을 다시 50mL 튜브로 옮깁니다. 오일병을 열고 필요한 양의 오일(표 1)을 어두운 바이알에 옮긴 다음 캡으로 닫습니다. 장갑을 벗고 장갑실을 엽니다.
    17. LS를 파라필름으로 밀봉합니다. 최소 30초 동안 바이알을 격렬하게 소용돌이치게 합니다. 단계 1.3.14에서 준비된 수조에서 80°C에서 30분 동안 배양합니다. 최소 30초 동안 바이알을 격렬하게 소용돌이치게 합니다. 실온에서 밤새 배양합니다.
    18. GUV 준비를 진행하거나 +4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
      참고: 비대칭 GUV 제제에서, 두 개의 상이한 멤브레인 전단지를 얻기 위해 인터페이스와 에멀젼에 두 개의 상이한 LS를 사용할 수 있다15.

2. GUV 생산

  1. 오일을 쉽게 제거할 수 있는 용기 설정
    1. 가위로 5mL 튜브의 캡을 잘라냅니다. 캡 중앙에 ~8mm 구멍을 뚫고 구멍이 P1000 팁이 맞고 잠길 수 있을 만큼 충분히 넓은지 확인합니다(그림 3A). 구멍이 너무 좁으면 이전 두 단계를 반복합니다. 너무 넓으면 캡을 버리고 2.1.1단계의 새 캡으로 다시 시작합니다.
    2. 2 x 5cm 사포를 자르고 구멍을 사포질합니다. 구멍이 뚫린 캡을 5mL 튜브 위에 다시 놓고 3,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 구멍에서 남아 있는 모든 플라스틱 파편을 제거합니다. 캡을 제거하고 튜브를 버립니다.
    3. 새 5mL 튜브에서 캡을 자르고 구멍이 뚫린 캡으로 교체합니다. 캡 위에 O-링을 놓고 구멍을 통해 P1000 팁을 삽입합니다. 팁과 캡 사이에 O-링을 잠그고 팁이 튜브 아래로 더 밀어 넣을 수 없는지 확인합니다(그림 3B). 팁을 통해 5mL 튜브에 5.5mL의 OS를 채웁니다.
  2. OS/LS 인터페이스 형성
    1. 결정화기에 수조를 준비하고 핫플레이트에서 50°C로 가열합니다.
    2. 섹션 1.3에서 준비한 LS 바이알을 최소 30초 동안 격렬하게 소용돌이치게 합니다. LS를 수조에서 50°C에서 30분 동안 가열합니다.
    3. 섹션 1.1에서 준비된 수용액을 실온에서 최소 10분 동안 평형화합니다.
    4. 2.1단계에 따라 수정된 1.5mL 튜브 또는 5mL 튜브에 300μL의 OS를 피펫팅합니다. OS 위에 100μL의 LS를 천천히 피펫팅하여 튜브에 두 개의 뚜렷하고 연속적인 상이 형성되도록 합니다. 인터페이스를 10분 동안 평형을 유지합니다.
      참고: 인지질의 균질한 단일층을 형성할 수 있도록 LS는 OS 위에 균질하게 분포되어야 합니다(그림 4A). LS 층이 연속적이지 않은 경우 마이크로피펫으로 LS의 부피를 재분배하거나 LS의 부피를 늘립니다(이는 파라핀과 같은 점성이 높은 오일에 매우 유용할 수 있음).
  3. 유중수 에멀젼 형성
    1. 2mL 튜브에 2.5% 유중수 에멀젼에 대해 250μL의 LS와 6.25μL의 IS를 순서대로 피펫팅합니다.
      참고: 우리의 경험에 따르면 이 유중수 비율은 안정적인 에멀젼을 제공하여 프로토콜 성공률을 높일 가능성이 높습니다(그림 5). GUV 수율을 높이려면 IS/LS 비율보다는 에멀젼 부피를 늘리는 것이 좋습니다.
    2. 혼합물이 균질하고 안정적으로 나타날 때까지 다음 방법 중 하나 이상을 사용하여 두 상을 혼합합니다: 와류, 표준 마이크로튜브 랙 위의 기계적 교반 또는 손가락으로 튜브를 두드리기(균질 에멀젼의 예는 그림 5 참조).
    3. 섹션 2.2에서 준비한 OS/LS 인터페이스 위에 200μL의 에멀젼을 옮깁니다.
    4. 1.5mL 튜브를 사용하는 경우 튜브를 닫기만 하면 됩니다. 섹션 2.1의 수정된 5mL 튜브를 사용하는 경우 팁 위에 고무 캡을 놓고 튜브를 50mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
  4. 원심분리를 통한 액적 이송
    1. 표 1의 표시에 따라 실온에서 튜브를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브 바닥에 불투명한 펠릿이 있고 상부에 투명한 유상이 있는지 확인합니다.

3. GUV 회수

  1. 오일 제거
    참고: 실험적 필요에 따라 오일은 세 가지 대체 단계로 제거할 수 있습니다.
    1. GUV가 표준 1.5mL 튜브에 준비된 경우 P1000 피펫과 마지막 방울에 대한 P200을 사용하여 오일을 천천히 제거하고 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.
      참고: 더 좁은 팁은 오일 제거에 도움이 되므로 더 작은 부피(10-200μL)용 팁을 P1000 팁에 삽입하면 이 단계의 정확도가 향상됩니다.
    2. 서로 다른 1.5mL 튜브에 여러 GUV 제제를 취급하는 경우 Büchner 플라스크를 사용하여 오일을 제거합니다. 두꺼운 실리콘 파이프(내경 7mm, 외부 13mm)의 한 조각을 진공 라인에 연결하고 플라스크 구멍에 다른 파이프를 삽입하여 고무 개스킷으로 밀봉합니다. 이 파이프의 다른 쪽 끝에 P1000 팁을 삽입하고 파라필름으로 감싼 다음 팁의 약 3mm를 절단한 다음 P200 팁에 삽입합니다. 진공을 열고 P200 팁으로 오일을 흡인한 다음 진공을 닫고 P200 피펫을 통해 마지막 방울을 제거합니다.
    3. 2.1단계에서 설명한 용기에 GUV가 준비된 경우 튜브에서 팁을 제거하고 고무 캡이 벗겨지지 않도록 합니다(그림 3D). 그런 다음 팁을 버리고 고무 캡, O-링 및 구멍이 뚫린 캡은 재사용을 위해 보관하십시오.
    4. P1000 마이크로피펫을 사용하여 튜브에서 OS를 제거하고(그림 3E) 약 50μL의 부피를 남겨두고 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.
    5. 팁을 교체하고 남은 부피에 펠릿을 재현탁한 다음 깨끗한 2mL 튜브에 옮깁니다.
  2. GUV 세척
    알림: 이 단계의 목적은 3.1단계에서 제거되지 않은 오일 상의 흔적을 제거하는 것입니다. 필요한 경우 튜브에 오일 방울이 관찰되지 않을 때까지 3.2.1 및 3.2.2단계를 반복해야 합니다.
    1. 튜브에 2mL의 OS를 채우고 실온에서 5분 동안 1,500×g에서 원심분리합니다.
    2. OS를 제거하고 약 50μL의 부피를 남겨두고 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.
    3. 마지막 두 단계를 반복합니다.
  3. 체적 평형
    참고: 다양한 GUV 제제 간의 수율을 비교할 수 있도록 이 섹션을 포함합니다.
    1. P200 마이크로피펫을 사용하여 3.2.2단계의 마지막 반복에서 남은 부피의 50μL에 펠릿을 재현탁합니다.
    2. 피펫을 20으로 설정하고 튜브 벽에 닿지 않고 팁을 GUV 분산액에 담근 상태에서 부피를 늘려 액체가 팁 내부로 흐르도록 하여 이 부피를 측정합니다.
    3. OS를 추가하여 최종 부피 100μL에 도달합니다.

4. 관찰 및 치수 분석

  1. 현미경 이미지 획득
    1. 손가락으로 튜브를 두드려 GUV 분산액을 부드럽게 혼합합니다.
    2. 버커 챔버에 10μL의 GUV 샘플을 로드하고 GUV가 챔버 바닥에 침전될 때까지 최소 5분 동안 기다립니다.
    3. 위상차 현미경으로 샘플을 관찰합니다. 버커 라인을 참조로 사용하여 샘플을 가로질러 이동하고 최소 20개의 이미지를 획득하여 관측 영역이 겹치지 않는지 확인합니다.
  2. 치수 분석
    1. ImageJ에 이미지를 로드합니다.
    2. 픽셀/μm 변환 계수를 계산하려면 버커 챔버의 50 x 50 μm 정사각형을 보여주는 이미지 하나를 선택한 다음(올바른 식별은 제조업체의 데이터시트 참조) 직선 선택 도구를 선택하고 정사각형의 두 연속된 모서리 사이에 선을 그리고 분석 | 측정. 3회 반복하고 평균값을 계산합니다.
    3. 분석 | 스케일을 설정합니다. 4.2.2단계의 값을 픽셀 단위의 거리 상자에 삽입한 다음 알려진 거리에 값 50을 삽입하고 길이 단위에 μm를 삽입합니다.
    4. 분석 | 측정값을 설정하고 면적 상자를 선택합니다. 타원형 선택 도구를 선택한 다음 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 Shift 키를 누른 상태에서 결과 원을 GUV 주위에 겹칩니다. 분석 | 측정. 모든 이미지의 각 GUV에 대해 이 작업을 반복합니다.
    5. 결과 창에서 파일 | 다른 이름으로 저장... 을 사용하여 GUV 영역의 csv 파일을 내보낸 다음 GitHub16에서 사용할 수 있는 스크립트를 사용하여 크기 분포를 분석합니다.
      참고: 4.2.3단계를 건너뛰고 픽셀/μm 변환 계수를 지정하는 스크립트를 실행할 수 있습니다. 이 값을 계산하려면 4.2.2단계에서 얻은 값을 50으로 나눕니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최적의 GUV 준비는 투명한 유상과 뚜렷한 펠릿의 형성을 특징으로 합니다(그림 4A). 물방울이 GUV로 변환되지 않는 경우 일반적으로 붕괴되어 OS/LS 인터페이스에 인지질 파편이 남습니다(그림 4C). 이 효과는 물/기름 계면에서 인지질의 불충분한 평형으로 인해 유상에서 인지질 및 기타 분자의 응집으로 인해 발생할 가능성이 큽니다. 그럼에도 불구하고 눈에 보이는 펠릿이 없거나 인터페이스에 파편이 있음에도 불구하고 GUV는 여전히 형성되어 프로세스를 계속할 수 있습니다. 세척 단계가 모든 인지질 잔해물을 제거하는 데 완전히 효과적인 것은 아니지만 오일 방울을 제거하는 데 크게 도움이 되어 전체 샘플 품질을 향상시킵니다( 그림 6A 및 그림 6B 비교).

고습도 조건에서 준비된 오래된 LS 또는 LS를 사용하면 GUV 분산액이 감소하고 수율이 낮아지고 유상의 인지질 및 기타 분자에 의해 형성될 가능성이 가장 높은 무질서한 응집체의 함량이 높아집니다(그림 6C). 고습도 조건에서 준비된 LS의 경우 GUV 생산(GUV 포함 샘플이 거의 없는 샘플)에서 0.8 이상의 변동 계수를 관찰한 반면, 수정된 장갑 챔버에서 준비된 LS의 경우 변동 계수는 0.5 미만이었습니다.

다양한 원심분리 조건은 GUV 수율과 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 정성 분석에서 3,300 × g에서 20분이 자당 로딩 GUV(샘플 E)에 대한 양호한 조건으로 확인되었습니다. 속도를 낮추면(500×g에서 45분) 수율이 감소한 반면, 증가(16,600×g에서 5분)하면 무질서한 인지질 응집체가 더 많이 형성되었습니다. 약한 원심력은 많은 물방울이 OS/LS 계면을 통과하는 것을 방지하여 수율을 감소시킬 수 있는 반면, 강한 힘은 계면 교차 중에 외부 전단지의 인지질 조직화에 충분한 시간을 제공하지 못할 수 있습니다(그림 7). 미세 입자의 캡슐화는 미세 입자의 질량 밀도가 IS의 질량 밀도와 대략 일치하는 경우 원심 분리 매개변수를 조정하여 최적화할 수도 있습니다. 이를 위해 원심분리 가속도를 낮추고(차례로 원심분리 시간을 늘리면) 고체 입자에 의해 가해지는 힘으로 인한 인지질 막의 파손을 방지함으로써 입자의 보다 균일한 캡슐화가 가능합니다(최적의 원심분리 매개변수에 대한 조사가 아직 진행 중인 동안 우수한 캡슐화의 예는 그림 6D에 나와 있습니다17).

인지질의 확산은 유상의 영향을 받을 수 있기 때문에 간단한 정성 테스트를 실행하여 에멀젼의 안정성을 평가할 수 있습니다(그림 5). 시각화를 개선하기 위해 IS에 용해된 착색 염료(Brilliant Blue FCF)를 사용하여 물/기름 비율이 다른 에멀젼을 준비하고 시간이 지남에 따라 관찰할 수 있습니다. 안정성 손실은 물방울의 응집과 그에 따른 유상으로부터의 분리로 시각화할 수 있습니다. 큰 물방울(육안으로 볼 수 있음)은 GUV로 전환될 가능성이 적기 때문에 상 분리가 가장 적은 에멀젼 조건을 사용하는 것이 좋습니다.

프로토콜의 변화의 효과는 프로토콜 섹션 4에 설명된 대로 크기 분포 분석을 통해 검증할 수 있습니다: GUV의 직경은 위상차 현미경 이미지에서 ImageJ를 사용하여 측정할 수 있으며 크기 분포는 GitHub16에서 사용할 수 있는 스크립트로 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 이 프로토콜에 따라 실리콘 오일 AR20보다 미네랄 오일을 선택할 때 더 큰 직경의 GUV가 증가하는 것을 관찰할 수 있었습니다(그림 8).

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그림 2: 글러브 챔버 설정. 이 그림은 지질 용액 준비를 위한 장갑 챔버의 주요 수정 사항을 보여줍니다. (A) 질소 및 진공과의 입구 연결; (B) 장갑실과의 입구 연결; (C) 출구 밸브; (D) 용매 증발을 위한 바늘 베어링 캡; (E) 용매 증발용 얇은 파이프; (F) 습기를 흡수하는 실리카 입자; (G) 장갑 챔버에 넣을 품목: 디지털 온습도계(1), 유기 용매의 지질 용액(2), 코르크 링 홀더(3), 유리 주사기(4), 중격 및 바늘이 있는 개방형 캡(5), 오일 용액(6), 캡이 있는 개방형 어두운 바이알(7), 10mL 팁(8), P10000 피펫(9); (H) 물에 담근 출구 파이프 말단; (I) 입구와 출구에 연결된 바늘 베어링 캡으로 닫힌 바이알; (J) 수정된 장갑실의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 3: 오일을 쉽게 제거할 수 있는 용기. 프로토콜 섹션 2.1에 따라 오일을 쉽게 제거할 수 있도록 용기에 GUV를 준비하는 주요 단계. (A) P1000 팁이 맞도록 5mL 튜브 캡에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 (B) 캡을 빈 5mL 튜브에 놓고 팁이 O-링을 통해 구멍에 삽입됩니다. (C) 용액을 프로토콜 섹션 2.2 및 2.3에 따라 튜브에 넣고 팁을 캡핑하고 튜브를 50mL 튜브 내부에 넣습니다. 실리콘 오일에서 0.2mM DOPC로 제조된 GUV에는 시각화를 향상시키기 위해 230.7mM 자당과 3.1mM 브릴리언트 블루 FCF가 로드되었습니다. (D) 원심분리 후, 상부 유상은 GUV 완충액의 일부와 함께 팁 내부에 갇힙니다(액적의 일부가 GUV로 전환되지 않고 OS에서 염료를 방출하기 때문에 청록색으로 나타납니다). 고무 캡 덕분에 팁을 액체 내용물과 함께 5mL 튜브에서 쉽게 제거할 수 있으므로 전체 오일상을 빠르고 쉽게 제거할 수 있습니다. (E) GUV 펠릿은 위상차 현미경으로 확인된 바와 같이 명백한 오일 오염 없이 투명한 분산액으로 튜브 바닥에서 쉽게 수집할 수 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: LS = 지질 용액; IS = 내부 솔루션; OS = 외부 솔루션; GUV = 거대한 단층 소포; DOPC = 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 4: GUV 형성. (A) OS/LS 인터페이스, (B) 투명한 유상을 가진 깨끗한 GUV 펠릿 및 (C) OS/LS 인터페이스에 파편이 있는 GUV 펠릿의 예(이 GUV 집단의 IS가 시각화를 향상시키기 위해 1.65mM New Coccine 염료로 보충되었기 때문에 파편과 펠릿이 붉은색을 띠게 나타납니다). 약어: LS = 지질 용액; IS = 내부 솔루션; OS = 외부 솔루션; GUV = 거대한 단층 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 다양한 오일 및 유중수 비율의 에멀젼 안정성. 이 그림은 오일의 종류와 사용된 물/오일(w/o) 비율에 따라 시간 경과에 따른 에멀젼의 안정성을 보여줍니다. IS는 에멀젼의 시각화를 향상시키기 위해 230.7mM 자당과 3.1mM Brilliant Blue FCF로 구성되었습니다. 미네랄 오일로 제조된 에멀젼은 실리콘 오일 AR20으로 만든 에멀젼보다 안정성이 떨어집니다. 이 효과는 w/o 비율이 증가함에 따라 더욱 증폭됩니다. 실리콘 오일 AR20의 에멀젼은 훨씬 더 안정적이지만 w/o 비율이 증가함에 따라 안정성도 감소하며 유화 직후 상 분리가 보입니다(실리콘 오일 AR20은 10%). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 위상차 현미경을 사용한 GUV 관찰. 광유에서 3.18mM DOPC로 구성된 LS에서 제조된 자당 함유 GUV의 20배 배율. (A) 오일 제거 후 회수된 샘플; (B) 세척 단계 후 회수된 샘플; (C) 조절되지 않은 산소 및 습도가 있는 환경에서 준비된 LS에서 얻은 열악한 GUV 수율; (D) 미세입자 탑재 GUV. 스케일 바 = 10 μm; 오일 방울은 동그라미로 표시되어 있으며 인지질과 오일 분자의 무질서한 응집체의 예는 화살표로 표시됩니다. 약어: LS = 지질 용액; GUV = 거대한 단층 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 7: GUV 형성에 대한 다양한 원심분리 조건의 영향. 실리콘 오일 AR20에서 0.2mM DOPC로 구성된 LS로 준비된 자당 로딩 GUV의 위상차 이미지. 그림은 (A) 16,600 × g 동안 5분, (B) 3,300 × g 동안 20분, (C) 500 × g 동안 45분에서 GUV의 정성적 비교를 보여줍니다. 원심분리 속도가 높을수록 인지질 응집체의 존재가 높아지지만 원심분리 속도가 낮으면 수율이 감소합니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: LS = 지질 용액; GUV = 거대한 단층 소포; DOPC = 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: 크기 분포 분석. (A) 미네랄 오일의 0.2 mM DOPC 및 (B) 실리콘 오일 AR20의 0.2 mM DOPC에서 얻은 두 개의 자당 함유 GUV 샘플의 비교(*위상차 현미경에서 GUV를 명확하게 구별할 수 있도록 샘플을 10배 희석했습니다). 프로토콜 섹션 4에 따라 수행된 분석은 실리콘 오일 AR20 샘플과 관련하여 광유 샘플의 크기 분포가 더 높은 직경으로 이동했음을 보여줍니다. 그러나 실리콘 샘플의 수율은 거의 20배 더 높습니다. 약어: GUV = 거대한 단층 소포; DOPC = 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

걸음조건 E조건 P묘사
1.1.14.11 그램17.11 그램자당 덩어리
1.1.12.16 그램2.16 그램포도당의 질량
1.1.2240 밀리미터1000 밀리미터자당의 농도
1.1.2240 밀리미터240 밀리미터포도당 농도
1.3.2실리콘 오일미네랄 오일LS용 유상
1.3.20.1mL 유리 주사기0.5mL 유리 주사기클로로포름 용액에서 DOPC를 이송하는 유리 주사기
1.3.1063 μL500 μL클로로포름 용액의 DOPC의 부피
1.3.1610 밀리리터5 밀리리터오일량
2.4.13300g 20 분500g 45분원심분리 조건

표 1: 프로토콜의 변형. 이 표는 두 가지 다른 GUV 집단, 즉 자당 로딩 GUV(조건 E) 및 미립자 로딩 GUV(조건 P)를 준비하기 위한 프로토콜의 다양한 단계(첫 번째 열에 표시됨)에 대한 변형을 보고합니다.

아이디관련 단계내경(mm)외경(mm)길이(mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

표 2: 장갑 챔버의 가스 및 진공 연결용 파이프. 표에는 장갑 챔버를 질소 및 진공 라인에 연결하는 데 사용되는 실리콘 파이프의 치수가 나열되어 있습니다. 조립 프로세스를 용이하게 하기 위해 참조 ID가 제공됩니다.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GUV 생산 방법은 수화를 통한 기판의 팽창을 기반으로 하는 방법과 유체 계면의 조립을 기반으로 하는 방법의 두 가지 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 그룹의 방법은 지질막 또는 막관통 단백질의 생물물리학적 특성화를 위해 대규모 GUV 집단을 제공하는 데 매우 효율적입니다. 대조적으로, 액적 이송과 같은 방법은 화물 소비가 감소하고 캡슐화 효율이 높기 때문에 화물 캡슐화에 주로 선택됩니다18.

이러한 이유로 수많은 다른 화물이 GUV에 캡슐화되어 액적 전달이 인공 세포 3,8,9,10에 대한 참조 프로세스 및 새로운 생 체모방 마이크로로봇11,12을 구축하기 위한 가능한 솔루션이 되었습니다. GUV 멤브레인의 물리화학적 특성을 조절하기 위해 이온성 인지질10, 지방산19, PEG20과 같은 폴리머 또는 콜레스테롤21과 같은 다양한 분자를 포함할 수 있습니다(콜레스테롤과 같은 소수성 분자는 오일에 대한 친화력이 높기 때문에 팽윤 방법과 관련하여 멤브레인 구성의 제어가 낮습니다22). 프로토콜은 이러한 수정을 허용할 만큼 다재다능하지만 일부 단계는 다른 단계보다 더 큰 영향을 미칩니다.

이 방법의 중요성을 논의하기 위해 우리는 여기에서 두 가지 다른 GUV 집단의 준비를 위한 프로토콜, 즉 자당 용액을 포함하는 GUV의 준비와 미립자를 캡슐화하는 GUV의 준비를 설명했습니다. 프로토콜의 차이점은 표 1에 조건 E(비어 있음) 및 조건 P(입자 포함)로 자세히 설명되어 있습니다. 이 방법은 인지질23 에 의해 구동되고 관련된 세 가지 상(IS, OS 및 LS) 모두의 물리화학적 특성에 의해 영향을 받는 쌍안정 공정에서 유상에서 수상으로 물방울을 전달함으로써 GUV를 형성할 수 있습니다.

세 가지 중 LS는 인지질이 빛, 산화 및 가수분해에 민감하기 때문에 가장 민감합니다 24,25,26. 이러한 이유로 -20°C에서 인지질(일반적으로 클로로포름 또는 메탄올)의 장기 보관에 사용되는 유기 용매를 증발시키는 초기 단계는 질소 또는 아르곤 흐름 하에서 호박색 바이알에서 수행되어야 합니다. 실험실 환경에서 낮은 습도 수준이 보장되지 않으면 인지질이 손상될 수 있습니다13, 14, 27. 따라서 LS는 글러브 박스 또는 이 프로토콜에 설명된 비용 효율적인 수정된 글러브 챔버와 같은 제한된 환경에서 준비되어야 합니다. 오일이 지질 필름에 첨가되면 LS를 장갑 챔버에서 제거할 수 있으며 용액을 소용돌이 및 가열하여 인지질의 완전한 용해를 수행합니다.

일부 프로토콜은 이 단계13에서 초음파 처리를 포함하지만, 국부적인 온도 상승은 일부 LS 제형에 대해 아직 설명되지 않은 손상을 초래할 수 있습니다. 이러한 이유로 수조에서 용액을 가열하면 더 잘 제어되고 균질한 공정을 제공할 수 있습니다. LS를 손상시킬 가능성을 더욱 줄이기 위해 이 프로토콜은 두 가지 다른 온도의 사용을 제안합니다: 새로 준비된 LS의 용해는 이전에 용해된 LS보다 더 높은 에너지를 필요로 하기 때문에(유리 바이알 표면에 퍼진 필름에 인지질 분자의 밀도가 더 조밀하기 때문에), 첫 번째 지질 필름 용해에는 80°C가 채택되고 사용 직전에 인지질을 단순히 재용해하기 위해 50°C가 채택됩니다. 일반적으로 광유에서 3.18mM DOPC에 대해 시간 경과에 따른 성능 변동성의 증가가 관찰되기 때문에(그림 4C), 일반적으로 일주일 이내에 LS를 사용하는 것이 권장됩니다. 그럼에도 불구하고 오일과 인지질의 일부 조합은 수명이 연장될 수 있으며 장갑 챔버를 사용하면 시간이 지남에 따라 LS의 안정성도 향상되는 것으로 보입니다.

인지질의 특정 조합으로 GUV 멤브레인을 맞춤화하려면 프로토콜의 맞춤형 구현이 필요할 수 있습니다. 가능한 모든 변형 사이를 탐색하기 위해 LS의 물리화학적 특성에서 지침을 얻을 수 있습니다. LS에서 임계 미셀라 농도(CMC)와 인지질의 확산성은 용액28의 분자와의 화학적 상호 작용에 의해 영향을 받습니다. 따라서 IS/LS 에멀젼에서 물방울의 형성은 인지질이 유상에서 얼마나 빨리 확산되고 물/오일 계면에 도달하여 안정적인 단층(멤브레인의 내부 전단지)을 형성할 수 있는지에 따라 영향을 받습니다. 이 프로토콜에서 활용된 두 오일에 대해 확산성의 차이가 관찰되었으며, 실리콘 오일 AR20은 IS/LS 에멀젼의 더 높은 안정성을 제공했습니다(그림 6). 두 오일에 대해 가장 안정적인 에멀젼은 물이 2.5% 비율로 분산되었을 때 관찰되었기 때문에(광유13의 이전 관찰과 일관됨) 이를 일반적으로 유효한 비율로 고정했습니다.

그럼에도 불구하고 더 높은 비율은 유용한 기능을 제공할 수 있으므로(예: 광유의 POPC는 더 큰 GUV로의 전환을 나타냈습니다13), 그림 6에 보고된 것과 같은 예비 정성 테스트를 실행하여 에멀젼의 안정성과 그에 따른 캡슐화의 예상 효율성에 대한 통찰력을 얻는 것이 좋습니다. 여기에서는 효능이 작업자나 채택된 기기에 따라 엄격하게 달라지기 때문에 에멀젼 형성을 위한 절차의 정확한 시기나 반복에 의존하지 말 것을 독자들에게 조언합니다. 대신 작업자가 에멀젼의 품질이 적어도 이론적으로는 물방울을 GUV로 전환할 가능성을 최대화할 수 있을 만큼 충분히 좋은 시기를 이해하는 데 도움이 되는 체크포인트를 제공합니다. 오일에서 인지질의 확산성은 또한 액적 전달 중에 재배열되고 GUV 멤브레인 2,7,18,29의 외부 전단지를 형성하는 능력에 영향을 미칩니다. 이 단계는 LS/OS 인터페이스의 적절한 평형화에 의해 선호됩니다. 이 프로토콜에 의해 채택된 배양 시간은 일반 권장 사항18과 일치하지만, 이전 보고서7 및 예비 실험의 계면 장력 측정을 통해 다른 LS로 준비된 GUV는 더 긴 배양 시간의 이점을 누릴 수 있습니다.

외부 전단지의 형성은 또한 LS/OS 인터페이스를 가로지르는 물방울의 속도에 의해 영향을 받으며, 이는 3상(30)의 밀도 및 점도와 연결된 단계입니다. 밀도 차이는 항상 IS > OS > LS 순서를 따라야 합니다. 이는 먼저 LS/OS 인터페이스를 향한 IS 액적의 침전을 허용한 다음 GUV로 전환하기 위해 인터페이스를 교차하고 튜브 바닥을 향해 침전하는 데 필수적입니다. 탈이온수가 IS와OS23 모두로 사용되는 경우에도 이 과정이 자발적으로 발생할 수 있지만, IS와 OS 사이의 밀도 차이는 GUV 형성을 선호하기 위해 도입되었습니다(31). 이 목적을 위한 가장 일반적인 쌍은 IS의 자당과 OS의 포도당입니다: 삼투압 스트레스로 인해 형성되는 GUV의 손상을 방지하는 데 필요한 등삼투압 농도에서 자당은 포도당보다 밀도가 높은 용액을 제공합니다. 밀도의 차이는 이러한 용액의 삼투압에 따라 증가하기 때문에 GUV의 수율은 그에 따라 달라지며 600mOsm 이상에서는 더 이상 개선이 관찰되지 않습니다13.

최적의 원심분리 조건은 3상의 밀도와 점도 및 인지질의 확산도와 밀접하게 연관되어 있습니다. 세 단계의 완전한 특성화가 없는 경우 여러 조건을 선별해야 합니다. 정성적 테스트(그림 4E 및 그림 5) 및 예비 체계적 분석(17)을 통해 이 프로토콜에 설명된 두 샘플에 대해 양호한 원심분리 조건을 정의할 수 있었습니다. 그러나 더 많은 조건을 선별하면 샘플의 품질이 개선될 수 있습니다. LS의 인지질 확산률과 3상의 밀도 및 점도 사이의 균형이 적절하게 유지되지 않으면 인지질은 LS/OS 인터페이스에서 평형을 이루고 물방울이 OS를 향해 이동할 때 올바르게 재배열할 수 있는 충분한 시간이 부족합니다. 이것은 종종 원심분리 중에 GUV로 조립되지 않는 물방울에 의해 끌리는 인지질 및 기타 유상 분자로 구성될 수 있는 계면 또는 바로 아래에 희끄무레한 침전물이 형성됩니다.

균질한 용액의 캡슐화는 OS와의 삼투압 균형을 유지하면서 IS 밀도를 증가시켜 구동될 수 있지만(자당-포도당 쌍의 경우와 같이), 미립자 분산액의 캡슐화는 미립자의 밀도와 일치하도록 수성상의 밀도를 필요로 합니다32. 화물 캡슐화의 효율성은 화물 용액/분산액의 화학적 조성에 의해서도 영향을 받습니다. 이전 보고서에서는 많은 알칼리 금속 할로겐화물33 또는 pH 변화13에 의해 발생하는 GUV 수율에 부정적인 영향을 미쳤으며, 이는 인지질의 쌍성 이온성 친수성 헤드의 순 전하의 상호 작용 또는 이동 때문일 가능성이 큽니다. 따라서 생물학적 반응(예: 효소 또는 무세포 단백질 합성)을 캡슐화하려면 pH 및 염 농도(예: KCl 또는 NaCl)를 반응 자체에 최적이 아닌 수준으로 조정해야 하기 때문에 종종 절충안이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 무세포 단백질 합성과 같은 복잡한 반응 혼합물조차도 기능성 GUV 기반 인공 세포를 제공하기 위해 변형될 수 있다34.

실용적인 관점에서 볼 때 물방울 전송 방법은 매우 간단한 프로세스를 제공하지만 OS에서 GUV를 복구하는 데는 몇 가지 제한이 있을 수 있습니다. 원심분리 단계 후 상상에서 오일을 제거하는 데 도움이 되도록 여러 샘플이 준비될 때 더 미세한 제거를 위해 두 개의 피펫 팁(프로토콜 단계 3.1.1) 또는 더 빠른 제거를 위해 Buchner 플라스크를 활용할 수 있습니다(프로토콜 단계 3.1.2). 그럼에도 불구하고 오일이 완전히 제거되지 않았기 때문에 깨끗한 GUV 분산액을 얻기 위해 세척 단계를 수행해야 합니다(프로토콜 단계 3.2). 세척 단계를 통해 GUV의 눈에 띄는 손실 없이 잔류 오일 방울을 효과적으로 제거할 수 있었지만(그림 4A,B), 점성이 높은 오일의 경우 이 통로가 덜 간단할 수 있으며 여러 GUV 제형을 준비할 때 매우 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 오일 제거를 우회하고 바늘(35)의 도움으로 뚫린 구멍을 통해 튜브의 바닥으로부터 GUV를 회수하는 대체 방법이 설명되었다. 그러나 이 프로세스에서는 튜브가 적절한 위치에 뚫리지 않은 경우 GUV 펠릿을 완전히 회수하지 못할 수 있으며 또한 작업자에게 잠재적으로 해로울 수 있습니다.

GUV 회수를 돕기 위해 유상을 신속하게 제거하는 새롭고 간단한 접근 방식을 소개합니다. 이는 캡이 있는 피펫 팁에 밀도가 낮은 상부의 오일상을 가두어 원심분리 후 유체가 떨어지지 않는 방식으로 팁을 제거할 수 있도록 하는 것을 기반으로 합니다. 이 간단한 전략을 사용하면 전체 오일상을 한 번에 빠르고 쉽게 제거할 수 있어 시간이 많이 걸리는 이 단계를 지속적으로 단순화할 수 있습니다.

프로토콜의 효율성을 평가하기 위해 GUV의 자동 감지를 위한 몇 가지 방법이 구현되어 계수 및 크기 분포 분석 속도를 높였습니다. 형광 프로브로 GUV를 라벨링하면 유세포 분석법(36,37) 및 원형 검출 알고리즘(13,37,38,39)과 결합된 현미경 이미징 모두에 적용되는 간단하고 효과적인 전략을 제공한다. 보다 최근에는 이 프로세스를 개선하기 위해 객체 감지를 위한 AI 기반 도구가 연구되고 있습니다40,41. 그러나 형광 염료는 잠재적으로 GUV 특성에 영향을 미쳐 분석에 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 검출 가능한 형광 신호를 제외하는 경우, 현미경은 가장 신뢰할 수 있는 옵션으로 남아 있으며, 위상차 현미경은 최적의 시각화18 및 원 검출 알고리즘38의 적용을 위한 선호 방법입니다.

또는 고유한 검출 전략을 위해 특정 제형의 고유한 특성을 활용할 수 있습니다. 예를 들어, Hadorn et al.은 임피던스 기반 셀 카운터(33)를 사용하여 GUV를 검출하기 위해 IS에서 전해질의 존재를 활용했습니다. 이러한 자동화된 방법이나 제형별 방법 중 어느 것도 실현 가능하지 않은 경우 수동 원 주석은 보편적으로 적용 가능한 대체로 남아 있습니다. 이러한 경우 ImageJ는 프로세스 속도를 높이고 이 프로토콜에 설명된 대로 원시 직경 측정값을 쉽게 추출할 수 있는 실용적인 도구를 제공합니다.

액적 전달 방법의 광범위한 채택에도 불구하고 새로운 GUV 제형에 필요한 최적화 프로세스에는 거의 관심이 없습니다. 이 작업에서 우리는 이 최적화를 조정하고 단순화하기 위한 체계적인 프로토콜을 구현하기 위해 문헌에서 사용 가능한 정보를 수집했습니다. 이 실용 가이드는 프로토콜13,14에서 종종 간과되는 측면인 새로운 GUV 제형의 생산 및 최소한의 오일 오염 샘플의 회수와 관련된 기본 원칙을 고려합니다. GUV 제형에 필요한 최적화를 예측하는 것은 불가능하지만, 이 가이드는 새로운 GUV의 구현 속도를 높이는 데 유용한 팁과 통찰력을 제공하여 잠재적으로 인공 세포 및 마이크로로봇을 포함한 응용 분야로 이어질 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 경쟁 이해관계가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이러한 결과는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 계약 번호 948590)에 따라 유럽 연구 위원회(ERC)로부터 자금을 지원받은 CELLOIDS(세포에서 영감을 받은 입자 기반 지능형 마이크로로봇) 프로젝트의 일부입니다. 이 작업은 NextGenerationEU BRIEF 프로젝트를 통해 유럽연합 집행위원회의 부분적인 지원을 받았습니다. 장갑 챔버 설치에 대한 기술 지원과 오일을 쉽게 제거할 수 있는 용기 구현에 대한 유용한 논의에 대해 Michele Ibrahimi에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인  주사기 필터머 크SLGSVR255F
1.5mL 튜브바이오클래스06.0279.00
100 & 뮤; L 유리 주사기머 크20737
150mL 비커아반토르 213-1123최소 3
20 mL 어두운 유리 바이알 ND24아반토르 548-9001A
2mL 튜브바이오클래스07.3534.99
50mL 실린더아반토르 612-3843
500 & 무; L 유리 주사기해밀턴549-1166
50mL 팔콘 튜브머 크CLS352070
50mL 주사기 피셔 사이언티픽8SS50L1 시리즈
5mL 튜브Greiner 바이오 원622201
600mL 비커아반토르 213-1126
Bü Chner 플라스크머 크Z740682
둥근 바닥 플라스크용 코르크 링아반토르 217-1000
결정화 장치두처080474A
D-(+)-포도당시그마-알드리치G8270
D-(+)-자당시그마-알드리치S9378
디지털 온습도계볼렌더V1863-07
DOPC아반티 리서치850375C
훈련드레멜4000
에리오글라우신 이나트륨염(Brilliant Blue FCF)시그마-알드리치861146
G18 주사기 바늘테루모AN1838R1
G21 주사기 바늘테루모AN2138R1
글러브 챔버벨아트F50030-0000가능한 경우 글러브 박스를 사용할 수 있지만 습도가 낮은 실험실에서는 필요하지 않을 수 있습니다.
핫 플레이트 마그네틱 교반기LLG 실험기구6.263 448
경미네랄 오일시그마-알드리치330779
새로운 코치네시그마-알드리치199737
니트릴 고무 O-링 O-링, 8mm 보어, 12mm 외경RS196-4863
SEPTTUM ND24가 있는 개방형 스크류 캡아반토르 548-0031A
P1000 마이크로피펫피셔 사이언티픽12346132
P10000 마이크로피펫아반토르 89079-978
P200 마이크로피펫피셔 사이언티픽12326132
종이 타월아반토르 KIMB6657
파라필름아반토르 291-1214
피펫 팁 (1000)에펜도르프0030000919
피펫 팁 (10000)에펜도르프0030000765
피펫 팁 (200)에펜도르프0030000870
폴리스티렌 입자, 1.1 및 마이크로; m시그마-알드리치LB11-1ML
고무 캡바이오클래스 S.r.l.12.2300.05
고무 원추형 개스킷아반토르 217-0211
나사 캡  엔드24아반토르 548-0161A
실리콘 오일 AR20시그마-알드리치10836
실리콘 파이프 (내경 1.6 mm, 외경 3mm)RS667-8441
실리콘 파이프 (내경 6mm, 외경 12mm)RS273-2541최소 6m
3방향 접합RS795-405
양방향 접합RS419-7287
양방향 밸브클레이버91280
초순수써모 피셔 사이언티픽 22934사용 가능한 경우 이 제품은 Milli-Q 시스템을 통해 정제된 물로 대체할 수 있습니다
범용 가위보헴4154

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

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