방법 논문

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

DOI:

10.3791/68347

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2025년 9월 26일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

초록

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복잡한 세포 상호 작용은 재관류 급성 심근 경색(repAMI) 동안 기능적 및 구조적 조직 리모델링을 결정합니다. 이러한 과정은 손상된 심장 근육이 서로 다른 영역(손상 영역, 위험 영역(AAR) 및 원격 영역)으로 분할됨에 따라 뚜렷한 공간 분포를 보여줍니다. 이러한 영역의 3차원(3D) 시각화는 상주 심장 세포와 침윤 면역 세포 간의 다양한 상호 작용을 분석하는 데 필수적이며, 이를 통해 가능한 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 여기에서는 repAMI 후 심장 손상 영역, AAR 및 침윤 면역 세포(예: 호중구)의 동시 및 자동화 가능한 3D 시각화 및 정량화를 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 여기에는 역행 항체 관류에 의한 AAR의 생체 외 시각화 후 심장 손상 영역(CD31음성) 및 호중구 침윤(Ly6G+)의 생체 내 항체 매개 염색과 라이트 시트 형광 현미경(LSFM) 이미징을 위한 추가 무독성 조직 제거가 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 표적 세포의 공간 분석(예: 침윤 면역 세포 및 repAMI 후 온전한 마우스 심장의 손상된 영역)이 가능합니다. 전통적인 조직학 및 면역조직화학은 컴퓨터 지원 후처리를 통해 무독성 조직 제거 및 이미지 획득 후에 수행할 수 있습니다. 이를 통해 동일한 마우스 심장 내에서 정보를 다중화하여 데이터 견고성을 강화하고 repAMI와 같은 매우 복잡한 손상에서 특히 중요합니다.

서론

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재관류 급성 심근경색증(repAMI)의 조직 손상은 심장 리모델링 및 심부전 발병의 주요 추진 요인입니다1. 여러 국소 매개체와 상주 심장 세포뿐만 아니라 침윤하는 면역 세포도 복잡한 상호 작용 2,3에서 확장에 영향을 미칩니다. 이러한 과정의 공간적 구성을 이해하는 것은 repAMI 후 조직 손상을 제한하고 심장 기능을 개선하기 위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위한 심오한 지식을 얻는 데 필수적입니다.

심장 근육 자체는 서로 다른 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에 모든 세포 유형이 허혈 및 재관류 손상 동안 고유한 특정 저항 능력을 나타내기 때문에 심장 손상에 대한 자세한 분석이 어렵습니다 4,5. repAMI의 맥락에서 한 가지 중요한 특징은 내피 세포 기능의 악화를 동반한 맥관 구조의 주요 손실입니다6. 마우스와 인간의 혈관 구조 묘사 및 내피 기능 장애 분석에 사용되는 가장 확립된 마커는 내피세포 표면에서 발현되는 접착 분자인 CD31(PECAM-1이라고도 함)입니다7. 다른 허혈/재관류 모델에서 CD31의 손실은 내피 조직 손상의 구별을 위한 좋은 대리 마커인 것으로 나타났습니다 8,9,10. 또한, repAMI 동안 심장 전체에 걸쳐 세 가지 주요 손상 구획이 구별됩니다. 허혈/재관류(I/R) 손상의 영향을 받지 않는 심장 조직은 원격 영역을 나타냅니다. 혈관 폐색의 심근 하류는 위험 영역(AAR)11,12로 정의됩니다. 재관류 개시 후, 이전 허혈(손상 영역)에 의해 손상된 AAR 내부에서 심장 조직의 별개의 영역을 구별할 수 있습니다13. 마우스의 심장 I/R 손상에 대한 기존 평가는 손상된 심장 세포의 감소된 대사 활동을 나타내는 일련의 두꺼운 절편에서 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)를 사용합니다13,14. 동시에, AAR15의 측정을 위해 생체 외 Evan의 청색 염색을 추가할 수 있습니다. 그러나 이러한 확립된 방법은 면역 세포 침윤의 공동 평가 가능성 감소, 세포 유형 특이적 손상의 구별, 정확한 3D 조직 재구성 등 몇 가지 한계를 가지고 있습니다.

라이트 시트 형광 현미경(LSFM)을 사용하면 세포 수준까지 형광 신호 분해능으로 온전하고 제거된 전체 마우스 장기를 시각화할 수 있습니다. 최근에는 온전한 마우스 심장의 3D 시각화를 위해 에틸 신나메이트(ECi)를 사용하여 개선된 무독성 조직 제거 방법이 도입되었습니다8. TTC/Evan의 청색 염색의 한계를 해결하기 위해 생체 내 항체 기반 CD31 형광 염색을 사용하여 repAMI8 동안 CD31 염색이 없는 영역(CD31음성)으로 심장 내피 손상을 나타냈습니다. 생체 내 염색과 관련하여 또 다른 형광 스펙트럼을 갖는 형광단 접합 항-CD31 항체를 사용한 생체 외 역행 대동맥 주사의 추가 투여는 AAR의 동시 3D 묘사를 설명합니다. 또한, 이 방법은 호중구 염색을 추가하여 확장할 수 있으며, 원격 영역, AAR 및 심장 내피 손상 부피로 분리된 세포 분포 분석을 통해 repAMI 동안 호중구 기능에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 실험 동물 절차는 담당 지방 정부 기관(AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV))의 승인을 받았으며 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 실험은 수컷 C57BL/6J 마우스(9-30주령)를 대상으로 수행되었습니다. 동물들은 지역 동물 사육장에서 특정 병원균이 없는(SPF) 조건에서 12시간/12시간 낮과 밤 주기로 사육 및 사용되었습니다.

참고: 모든 외과적 개입은 이소플루란(1.5Vol%)을 사용하여 유지하면서 케타민(100mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)을 사용하여 복강내 마취 유도하에 수행되었습니다. 동물의 고통을 줄이기 위해 모든 동물은 밤새 부프레노르핀이 함유된 식수와 함께 낮 동안 마취 전후에 0.1mg/kg 부프레노르핀을 피하 주사했습니다. repAMI를 유도하기 위한 수술 프로토콜은 이전에 다른 곳에서 설명되었습니다16,17. 생체 내 항체 주입을 시작하기 전에 아래에 설명된 이후 단계에서 생체 외 역행 항체 주입에 사용되는 두 개의 6cm 페트리 접시를 준비합니다. 심장에서 과도한 주변 조직을 조잡하게 제거하려면 얼음 위에 PBS가 있는 얕은 페트리 접시 하나가 필요합니다(나중에 취급 과정을 용이하게 하기 위해 접시 내부에 크기에 맞게 자른 거즈 조각을 사용하는 것이 좋습니다). 캐뉼라 노치 위에 5-0 봉합사의 느슨한 매듭이 있는 얼음 위의 PBS에 담근 20G 무딘 강철 캐뉼라 바늘을 사용하여 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 또 다른 접시가 필요합니다. 캐뉼라 내부의 기포는 관상 혈관을 막고 전체 관류를 방해할 수 있으므로 피하거나 제거하십시오.

1. 생체 항체 주입

  1. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 사용하여 마우스를 마취합니다.
  2. 직접 표지된 마우스 항-CD31(클론: MEC13.3; 형광단: AlexaFluor 790) 및 마우스 항-Ly6G(클론: 1A8; 형광단: AlexaFluor 647) 항체를 PBS에 각각 10μg씩 정맥 꼬리 정맥 주사를 통해 체중 g당 총 부피 5μL(20g 마우스의 경우 100μL)로 주입합니다.
    참고: 이 항체 주사는 심장 내부의 모든 내피를 표시하며 repAMI 손상 크기를 정량화하기 위한 것입니다.
  3. 절차를 계속하기 전에 주입된 항체를 10분 동안 순환시키십시오.

2. 심장 수확

알림: 섹션 2와 3은 시간이 중요하며 6분 이내에 완료해야 합니다.

  1. 항체 주사 후 10분 후에 자궁경부 탈구로 동물을 희생합니다. 반사 신경을 평가하여 사망을 확인하십시오.
    알림: 혈액 샘플이 필요한 경우 다음 단계로 진행하기 전에 채취하십시오.
  2. 마우스를 실체 현미경 아래에 놓습니다.
  3. 흉강을 열고 흉곽에서 목까지 혈관 출구 가까이에서 노출된 상대정맥을 절개합니다.
    참고: 생체 외 역행 항체 주사에 필요하므로 대동맥을 그대로 유지하십시오.
  4. 총 3분 동안 롤러 펌프(70μL/s)가 있는 27G 바늘을 사용하여 헤파린(20IE/mL)을 함유한 PBS로 오른쪽 및 왼쪽 심방 이행을 통해 심장을 제자리에서 관류합니다. 심장의 표재성 혈관 흡입이 퇴색되고 폐와 간이 미백됨에 따라 충분한 심장 혈액 제거가 눈에 띄게 됩니다.
    참고: 우심실 또는 좌심실을 통한 심장 관류는 라이트 시트 형광 현미경 검사 중에 이미징 아티팩트를 유발할 수 있으므로 피하십시오.
  5. 심장과 나머지 대동맥의 최소 5mm를 주변 폐 조직과 함께 절제합니다.
    참고: 라이트 시트 형광 현미경 검사 중 조직 손상 및 이미징 아티팩트를 방지하기 위해 절제 중에 심장 근육을 직접 잡지 마십시오.

3. 생체 외 역행 항체 주사

  1. 심장을 얼음처럼 차가운 PBS와 미리 준비한 거즈가 있는 6cm 페트리 접시에 옮깁니다.
  2. 약 5mm 대동맥이 있는 심장만 남을 때까지 나머지 주변 폐, 지방 및 혈관 조직을 잘라냅니다.
  3. 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 준비된 접시에 심장을 옮깁니다.
  4. 나머지 대동맥을 20G 무딘 강철 캐뉼라 위로 당기고 pre-knote 50 봉합사로 캐뉼라 노치에 결찰합니다.
    알림: 관류액이 누출되지 않도록 캐뉼라 팁을 대동맥 판막 가까이 밀어야 합니다.
  5. 이전에 repAMI 유도에 사용된 정확한 위치에서 6-0 봉합사로 좌전하행동맥(LAD)을 영구적으로 재결찰합니다.
  6. 삽입된 캐뉼라를 통해 AlexaFluor 546으로 표지된 20μg 마우스 항-CD31(클론: MEC13.3) 항체를 함유한 PBS 400μL를 주입합니다.
    참고: 관상 동맥을 통한 완전한 항체 관류를 보장하기 위해 주사 주사기와 삽입된 캐뉼라 사이의 접합부를 밀봉 필름으로 닫습니다. 이 항체 주사는 AAR 외부의 내피만 염색하므로 AAR 정량화에 사용할 수 있습니다.
  7. 대동맥에서 삽입된 캐뉼라를 빼냅니다.
  8. 심장을 10mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어 있는 15mL 폴리프로필렌 반응 튜브로 옮기고 어두운 곳에서 4°C에서 밤새 교반하지 않고 배양합니다.

4. 샘플 처리 및 클리어

  1. 5mL 폴리프로필렌 반응 튜브에서 항상 머리 위 회전으로 교반하면서 어둠 속에서 실온(RT)에서 각각 10분 동안 5mL PBS를 세 번 교체하여 고정된 심장을 세척합니다.
  2. 탈이온수에서 50%, 70% 및 100%로 5mL 상승 에탄올 계열에 고정된 심장을 탈수하고, 각각 어둠 속에서 RT에서 최소 2시간 동안 5mL 폴리프로필렌 반응 튜브에서 거의 머리 위 회전으로 교반합니다.
    참고: 50% 및 70% 에탄올에서의 배양은 다음날까지 연장될 수 있는 반면, 100% 에탄올에서의 배양은 최대 3일까지 연장될 수 있습니다.
  3. 100% 에탄올 10mL와 5% DMSO 및 5% H2O2 를 포함하는 15mL 폴리프로필렌 반응 튜브에 표백하여 어두운 곳에서 4°C에서 4시간 동안 교반하지 않습니다.
    알림: 표백 과정에서 튜브 내부에 압력이 가해질 수 있습니다. 나중에 튜브를 열 때 주의하십시오.
  4. 표백된 심장을 100% 에탄올 5mL로 세척하고, 어둠 속에서 RT에서 각각 12시간 동안 3회 세척하고, 항상 5mL 폴리프로필렌 반응 튜브에서 거의 머리 위 회전으로 교반합니다.
    참고: 각 배양 단계는 최대 3일 동안 연장될 수 있습니다.
  5. 조직 제거를 위해 심장을 4mL의 에틸 신네메이트(ECi)가 들어 있는 5mL 폴리프로필렌 반응 튜브로 옮기고 어두운 RT에서 3일 동안 교반하지 않고 배양합니다.
    참고: 깨끗해진 심장은 RT에서 어둠 속에서 올바르게 보관하면 형광 강도가 감소하지 않고 최소 3개월 동안 ECi에 남아 있을 수 있습니다. ECi는 이 온도에서 동결하여 공정에서 샘플에 손상을 줄 수 있으므로 ECi 또는 ECi에 보관된 샘플을 6°C 이하로 보관하지 마십시오.

5. 젤란 껌 블록의 준비

  1. 가열된 수돗물(50-60°C) 100mL에 젤란검 분말 1g을 섞습니다.
  2. 마그네틱 교반기를 사용하여 완전히 해결될 때까지 혼합합니다.
    알림: 분말이 제대로 분해되지 않으면 전자레인지에서 끓을 때까지 용액을 가열하십시오.
  3. 100μm 세포 여과기를 통해 젤란 검 용액을 여과합니다.
  4. 여과된 용액을 얕은 10cm 페트리 접시에 접시합니다.
  5. 젤이 굳을 때까지 식히십시오.
  6. 젤을 15mm, 15mm, 5mm의 블록으로 자릅니다.
  7. 탈이온수에서 50% 및 70%의 상승 에탄올 계열 50mL를 탈수하고, 각각 RT에서 최소 2시간 동안 하나의 50mL 폴리프로필렌 반응 튜브에서 거의 머리 위 회전으로 교반합니다.
    알림: 젤 블록을 추가한 후 반응 튜브에 에탄올을 채웁니다. 반응 튜브를 젤 블록으로 최대 절반까지만 채우십시오.
  8. 탈수 블록을 50mL의 100% 에탄올에 넣고 RT에서 각각 12시간 동안 3회 배양하고, 항상 하나의 50mL 폴리프로필렌 반응 튜브에서 거의 머리 위 회전으로 교반합니다.
    알림: 젤 블록을 추가한 후 반응 튜브에 에탄올을 채웁니다. 반응 튜브를 젤 블록으로 최대 절반까지만 채우십시오. 겔 블록은 ECi에서 제거될 때까지 장기간 100% 에탄올이 포함된 마지막 반응 튜브에 남아 있을 수 있습니다.
  9. 블록을 25mL의 ECi가 들어 있는 50mL 폴리프로필렌 반응 튜브로 옮기고 RT에서 3일 동안 교반하지 않고 배양합니다.
    참고: 아티팩트 제거를 방지하기 위해 ECi가 있는 하나의 반응 튜브에 몇 개의 블록만 넣으십시오. 제거된 블록은 최소 6개월 동안 ECi에 남아 RT에 보관할 수 있습니다.

6. 이미징

  1. 투명한 젤란 검 블록을 현미경 샘플 홀더에서 투명한 심장을 안정화하는 데 필요한 크기로 자릅니다.
    참고: 젤란 껌 블록은 여러 번 재사용할 수 있습니다.
  2. 적절한 여기 및 방출 필터 설정을 사용하여 관심 있는 형광 신호(자가형광, AAR 염색[AlexaFluor 546으로 표지된 항-CD31 항체], AlexaFluor647 결합 항-Ly6G 항체 및 CD31음성 염색[AlexaFluor 790으로 표지된 항-CD31 항체])를 검출합니다. 획득을 위해 작동 거리가 17.6mm인 0.1NA 대물 렌즈를 사용합니다.
    참고: 백색광 레이저(200mW, 480-2400nm)로 신호를 감지합니다. 결합 조직 유래 자가형광을 검출하려면 470/30nm 대역 통과 여기 필터와 525/50 nm 대역 통과 방출 필터를 사용하십시오. AlexaFluor 546 결합 항체를 사용한 CD31 염색은 520/40 nm 대역 통과 여기 필터 및 585/40 nm 대역 통과 방출 필터로 검출됩니다. AlexaFluor 647 결합 항체를 사용한 Ly6G 염색은 630/30 nm 대역 통과 여기 필터 및 680/30 nm 대역 통과 방출 필터로 검출됩니다. AlexaFluor 790 결합 항체를 사용한 CD31 염색은 740/40 nm 대역 통과 여기 필터 및 824/55 nm 대역 통과 방출 필터로 검출됩니다. 조명 시간과 레이저 감쇠 비율은 신호 품질에 따라 조정되어야 합니다.
  3. 라이트 시트 현미경 이미징에 대해 다음 설정을 선택하십시오.
    1. 0.079의 시트 NA를 선택하면 5μm의 가벼운 시트 두께가 됩니다.
    2. 두 개의 개별 z-평면 사이의 거리로 10μm를 선택합니다.
      참고: 이로 인해 언더샘플링이 발생하고 추적 및 부피 측정에 대한 정밀도가 손실됩니다. 이를 방지하려면 두 개의 개별 z-평면 사이의 거리가 라이트 시트 두께의 절반과 같아야 하므로 이 경우 2.5μm입니다. 이 연구는 이미징 시간과 데이터 스택 크기 감소로 얻은 이점이 분석 정밀도의 최소 손실보다 크기 때문에 데이터를 언더샘플링하기로 결정했습니다.
    3. 100%의 시트 너비를 사용하여 샘플의 균일한 조명을 얻으십시오.

7. 이미지 후처리

참고: 획득한 디지털 이미지 데이터는 재료표에 나열된 과학적인 3D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어를 사용하여 추가 처리되었습니다.

  1. Imaris 파일 변환기 10.1 소프트웨어를 시작하고 이미지 파일이 있는 폴더를 Imaris 파일 변환기 창으로 끌어다 놓 거나 찾아보기 를 클릭하고 이미지 파일이 있는 폴더로 이동하여 원시 데이터 세트를 소프트웨어에 로드합니다.
  2. 폴더 선택을 통해 출력 폴더를 선택합니다.
  3. 모두 시작을 클릭하고 파일이 .ims Imaris 파일로 변환될 때까지 기다립니다.
  4. 소프트웨어를 시작하고 왼쪽 상단 모서리에 있는 능가를 선택합니다.
  5. 열기를 선택하여 이미지 스택을 열고 해당 .ims 데이터 파일을 선택합니다.
  6. 전체 심장의 자동으로 생성된 표면을 생성하려면 3D 뷰 및 표면을 선택합니다.
  7. Segment only a Region of interest, Process entire Image finally, Object-Object Statistics를 선택하고 알고리즘 설정 섹션에서 표면 분류를 비활성화합니다.
    참고: 객체-객체 통계를 활성화하면 다양한 표면 및 스폿 함수의 오버레이 계산이 가능합니다.
  8. 시트 만들기의 오른쪽 하단 모서리에 있는 파란색 화살표 버튼을 클릭하여 다음 단계를 계속합니다.
  9. 이미지 뷰 내부에 나타나는 조작기를 사용하여 3차원 관심 영역을 결정합니다.
  10. 소스 채널(자가형광 채널)을 선택하여 다음 단계를 진행합니다.
  11. Smooth를 활성화하고 기본 설정인 11.8μm를 선택합니다.
  12. 다음 단계를 계속 진행하여 이미지 뷰 내부에 나타나는 광학적으로 만족스러운 3차원 표면을 만드는 데 필요한 임계값을 결정합니다.
  13. 마지막 단계에서 표면 필터를 조정하고 필터 유형으로 복 셀 수를 선택하고 임계값으로 10을 결정합니다.
  14. 만들기 섹션의 오른쪽 하단 모서리에 있는 녹색 화살표 버튼을 클릭하여 표면을 만듭니다. 색상 시트를 사용하여 필요에 따라 생성된 표면의 재질과 색상을 변경합니다.
  15. 3D View and Surfaces를 한 번 더 선택하여 AAR(AlexaFluor 546 채널의 CD31음성 부피) 및 심장 내피 손상 부피(AlexaFluor 790 채널의 CD31음성 부피)에 대해 수동으로 생성된 두 개의 추가 표면을 생성합니다.
  16. 알고리즘 설정(Algorithm Settings) 섹션에서 표면 분류(Classify Surfaces) 를 비활성화하면서 관심 영역만 분할(Segment only a Region of interest), 전체 이미지 최종 처리(Process entire Image) 및 객체-객체 통계(Object-Object Statistics)를 선택하고 자동 생성 건너뛰기, 수동으로 편집(Edit manual manually)을 클릭합니다.
  17. 보드 시트 내에서 방향으로 XY, 가시성으로 없음을 선택하고 해상도 컨트롤러를 수동으로 최대로 조정합니다.
  18. 모형 시트로 이동하여 거리 아이콘을 클릭하고 정점 간격을 100μm로 설정합니다.
  19. 이미지 슬라이스 10개마다 AlexaFluor 546 채널 또는 AlexaFluor 790 채널의 CD31네거티브 영역 그리기 및 둘러싸기를 활성화합니다.
  20. 모든 해당 영역을 둘러싸고 난 후 자동 맞춤을 선택하고 자동 맞춤 수행을 선택합니다.
  21. 서피스 작성을 클릭하고 색상 시트에서 생성된 서피스의 재질과 색상을 조정합니다.
  22. 호중구를 Ly6G+ 스팟으로 표시하려면 3D 뷰 및 스팟을 선택하여 스팟 함수를 생성합니다.
  23. 알고리즘 설정 섹션에서 스팟 분류를 비활성화하면서 관심 영역만 분할, 마지막으로 전체 이미지 처리, 객체-객체 통계를 선택합니다.
  24. 시트 만들기 의 오른쪽 하단 모서리에 있는 파란색 화살표 버튼을 사용하여 다음 단계로 진행합니다.
  25. 위에서 언급한 대로 이미지 뷰 내부에 나타나는 조작기를 사용하여 3차원 관심 영역을 결정합니다.
  26. 소스 채널(AlexaFluor 647 채널)을 사용하여 다음 단계를 계속합니다.
  27. 추정 XY 직경을 10 μm로 설정하고, Z축을 따라 모델 PSF 연신율을 활성화하고, 추정 Z 직경을 20 μm로 설정합니다.
  28. 배경 빼기를 비활성화합니다.
  29. 다음 단계를 진행하고 필터로 최소 강도 를 선택하고 적절한 임계값을 설정합니다.
    알림: 임계값 수준을 추정하려면 프로그램 창의 상단 영역에서 슬라이스 를 클릭하고 AlexaFluor 647 채널을 선택합니다. 양성 Ly6G 염색을 나타내는 원시 이미지 슬라이스의 다른 지점 위로 커서를 이동하고 프로그램 창의 왼쪽 하단 모서리에 있는 강도 값을 읽습니다.
  30. 시트 만들기 의 오른쪽 하단 모서리에 있는 녹색 화살표 버튼을 클릭하여 스팟을 생성합니다.
  31. 만들기 시트의 점 스타일/품질 섹션에서 반지름 배율을 3.0으로 설정합니다.
  32. 원하는 대로 별색을 조정하기 위해 색상 시트로 이동했습니다.

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결과

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라이트 시트 형광 현미경(LSFM)을 사용하여 제시된 접근법은 repAMI 후 AAR, 내피 손상 및 호중구 침윤을 동시에 분석할 수 있습니다. 도 1A 는 repAMI 유도 24시간 후 C57BL/6J 마우스의 생체 내 및 생체 외 항체 염색을 나타낸 것이다. 심장 내피 손상 염색에 대한 항체(AlexaFluor 790으로 표지된 항-CD31) 및 호중구 침윤(AlexaFluor 647로 표지된 항-Ly6G)을 희생 10분 전에 정맥 주사했습니다. 충분한 혈액 제거 후, AlexaFluor 546과 접합된 항-CD31 항체의 역행성 대동맥 관류를 통해 AAR을 염색하고, 하룻밤 동안 4°C에서 4% PFA로 심장을 고정하였다. 그림 1B 는 LSFM 이미징을 위한 추가 조직 처리를 설명합니다. 고정 후, 조직 자가형광을 감소시키기 위해 과산화수소와 디메틸설폭사이드로 표백한 후 상승하는 에탄올 열에 의해 심...

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토론

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마우스에서 repAMI 동안 심장 조직 손상을 감지하기 위한 몇 가지 이미징 개체가 있습니다. 이러한 기술은 다양한 장점을 제공하지만 한계도 있습니다. TTC를 사용하여 심장 세포의 감소된 대사 활동을 염색하는 것은 심장 I/R 손상의 정량화에 가장 일반적으로 사용되는 방법이며 AAR13,14,15의 구별을 위해 Evan의 청색 염색과 결합할 수 있습니다. 이는 빠르고 비용 효율적인 방법이지만 일련의 조직 절편을 생성해야 하기 때문에 정확한 3D 재구성에는 제한이 있습니다. 심장 조직 손상에 대한 기존의 조직학적 방법, 예를 들어 헤마톡실린/에오신 또는 고모리 삼색 염색에도 동일하게 적용되어 더 큰 공간 이미징 해상도로 분석할 수 있습니다18,19

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공개 사항

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Elias Haj-Yehia는 제출된 작업 외부에 있는 AstraZeneca의 개인 수수료 및 기타 비용을 보고합니다. Simon F. Merz와 Lea Bornemann은 현재 Miltenyi Biotec BV &; Co. KG에 근무하고 있습니다. Matthias Totzeck과 Tienush Rassaf는 제출된 저작물 외부에 있는 Edwards 및 Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo 및 Astra Zeneca의 개인 수수료와 기타 수수료를 보고합니다. Tienush Rassaf와 Ulrike B. Hendgen-Cotta는 심장 보호 펩타이드 개발에 주력하는 회사인 Bimyo를 공동 설립했습니다. Matthias Gunzer는 Miltenyi BioTec, BV &; Co. KG로부터 일반 연구 자금을 받았습니다. 다른 모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 다음 자금 출처를 인정합니다: 독일 연구 재단(UMEA 임상의 과학자, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) 및 독일 심장 학회(DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). 이 작업 중 일부는 독일 뒤스부르크-에센 대학교 의과대학의 서비스 핵심 시설인 IMCES(Imaging Center Essen)에서 수행되었습니다. 지속적인 기술 지원과 기기 사용에 대해 IMCES 직원에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
27G 바늘벡턴 디킨슨305889BD 이클립스
3D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어비트플레인버전 10.1.0이마리스
5-0 봉합사세라그-비스너IC108000비단
6-0 봉합사에티콘EH7814프롤렌
AlexaFluor 546 항체 라벨링 키트인비트로젠A20183
AlexaFluor 790 항체 라벨링 키트인비트로젠A20189
항마우스 Ly6G 항체 (AlexaFluor 647)바이오레전드127610복제: 1A8
셀 스트레이너(100 & micro; m)코 닝431752
디메틸 설폭사이드(DMSO)칼 로스7029.1
에탄올칼 로스0911.4
에틸 신네메이트(ECi)시그마-알드리치112372
파일 변환기 소프트웨어비트플레인버전 10.1.0이마리스
사푸르만10021
젤란 껌 분말시그마-알드리치피8169피타젤
헤파린(25.000 IE/5 mL)레오 파마15261203
과산화수소(H2O2, 30%)칼 로스8070.2
주사 주사기B 브라운9161502S옴니칸 F
케타민(100mg/mL)벨라파마402581.00.00
라이트 시트 현미경 시스템밀테니 바이오텍-UltraMicroscope 블레이즈
루어 잠금 주사기벡턴 디킨슨303172BD Plastipak
마그네틱 교반기VWR444-0572
Neo sCMOS 카메라(4.2MP)안도르 테크놀로지ZL41 셀 4.2
목표밀테니 바이오텍130-133-625MI 플랜 1.1x NA 0.1, WD 17.6mm
파라포름알데히드(PFA, 4%)시그마-알드리치1.0049610% 포르말린, 중성 완충
페트리 접시그라이너 바이오-원632181
인산염 완충 식염수(PBS)깁코14190-094MgCl2/CaCl2
폴리프로필렌 튜브(15mL)그라이너 바이오-원188261
폴리프로필렌 튜브(5mL)칼 로스에키9.1검정
폴리프로필렌 튜브(50mL)그라이너 바이오-원227261
마우스 심장 캐뉼라 삽입을 위한 준비 접시휴고 삭스 엘렉트로닉73-4327캐뉼라 포함
정제된 항마우스 CD31 항체벡턴 디킨슨53369복제: MEC13.3
롤러 펌프이스마텍ISM597-230
밀봉 필름베미스PM-996파라필름
실체 현미경라이카S6D
튜브 회전 장치하이돌프폴리맥스 1040
백색광 레이저NKT 포토닉스SuperK 익스트림200mW, 480– 2400 나노미터
WT 마우스 변형얀비에 연구소-C57BL/6JRj
자일라진 (2%)세바 티어게순하이트6324464.00.00

참고문헌

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