방법 논문

종양 면역학 및 치료 연구를 위해 아톡시메탄과 덱스트란 황산나트륨을 사용하여 대장염 관련 결장암을 유도하기 위해 최적화된 마우스 모델

DOI:

10.3791/68351

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2025년 7월 25일

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아톡시메탄(AOM)/덱스트란 황산나트륨(DSS) 유발 대장염 관련 결장암은 마우스에서 대장의 토생 종양을 모델링하기 위한 확립되고 비용 효율적인 접근 방식입니다. 우리는 업데이트된 프로토콜을 제시하고 성별별 DSS 용량 최적화에 대한 중요한 고려 사항과 엄격함, 견고성 및 재현성에 대한 마이크로바이옴의 기여에 대해 논의합니다.

초록

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아톡시메탄(AOM, DNA 손상제)과 덱스트란 황산나트륨(DSS, 대장염 촉진제)은 높은 침투도로 마우스의 대장에 종양을 유도할 수 있습니다. AOM/DSS에 의해 유도된 쥐 대장염 관련 결장암(CAC) 모델은 인간 CAC 임상 특성을 요약하는 정확성을 고려할 때 염증 관련 결장암을 조사하는 데 있어 황금 표준으로 자리매김하고 있습니다. 이 모델의 장점에는 내인성 조직으로부터의 기원 및 발달, 종양-면역 상호 작용의 전체 레퍼토리를 보존하는 면역 능력, 수많은 마우스 균주에 대한 적응성, 3개월 잠복기의 편의성 및 상대적으로 저렴한 비용이 포함됩니다. 이러한 장점에도 불구하고 몇 가지 과제로 인해 프로토콜의 효율성이 제한됩니다. 연구 전반에 걸쳐 DSS 용량과 종양 침투율의 가변성은 일관되지 않은 관찰로 이어집니다. 또한 장내 미생물군의 변화는 실험 변동성 증가에 기여하여 통계적 검정력에 부정적인 영향을 미칩니다. AOM/DSS에 대한 반응의 성별 차이는 결과 해석을 더욱 복잡하게 만듭니다. 또한 DSS 로트 간 변동성은 결과의 재현성을 방해합니다. 이러한 문제를 해결하는 것은 전임상 연구에서 이 모델의 신뢰성과 적용 가능성을 향상시키는 데 중요합니다. 이를 해결하기 위해 C57BL/6J 마우스를 모델로 사용하여 연구 간의 재현성과 조화를 향상시키기 위한 효과적인 최적화 전략으로 확립된 프로토콜을 개선했습니다. 여기에는 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 DSS 용량 적정에 대한 권장 사항, 케이지 간 장내 세균총의 이질성을 완화하기 위해 각 DSS 주기 전에 미생물군 균질화 구현이 포함됩니다. 이러한 단계는 변동성을 크게 줄이고 재현성을 향상시켜 CAC의 강력한 유도를 가져왔습니다. CAC 발달에서 염증 및 세포 면역 메커니즘의 중추적인 역할을 인식하는 이 프로토콜은 또한 RNA 또는 단백질의 분리와 결장 종양 및 주변 결장 조직에서 염증성 사이토카인을 프로파일링하는 데 적합한 조직 처리 절차를 설명합니다. 궁극적으로 이 방법을 사용하면 보다 엄격하고 견고하며 재현 가능한 CAC 생산이 보장됩니다.

서론

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대장암(CRC)은 전 세계적으로 세 번째로 흔한 암이며 암 관련 사망의 주요 원인입니다1,2. 산발성 CRC에 비해 대장염 관련 대장암(CAC)은 염증성 장 질환(IBD) 환자에서 장기간의 반복적인 장 손상의 결과로 발생하며3,4, 악성 등급이 더 높고 더 어린 나이에 다발성 발현 경향이 특징입니다. 이러한 요인으로 인해 CAC는 일반적으로 덜 유리한 임상 결과와 함께 보다 공격적인 치료가 필요합니다5. CAC는 적어도 부분적으로 돌연변이 획득의 독특한 시기와 염증성 면역 메커니즘 및 마이크로바이옴의 엄청난 역할로 인해 별개의 개체로 간주되지만 CAC와 산발성 CRC는 전반적인 게놈 환경 및 병인학적 특징과 관련하여 많은 유사점을 공유합니다. 일반적으로 CRC, 특히 CAC에 대한 이해를 높이고 치료 전략을 개선하려면 강력한 전임상 모델이 필수적입니다.

CRC를 연구하는 데 사용되는 다양한 모델 중에서 AOM/DSS 유도 CAC 모델이 가장 널리 채택되었으며 현재 표준으로 간주됩니다 6,7. AOM에 의해 전달되는 강력한 돌연변이 유발 손상으로 시작된 이 모델은 CAC8에 대해 잘 확립된 위험 요소인 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 인간 IBD를 밀접하게 모방하는 반복적인 DSS 유발 대장염 발작에 의존합니다. AOM/DSS 모델은 다른 생체 내 접근 방식에 비해 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 측면 또는 동소 종양을 확립하기 위해 외인성 암 개시 물질의 주입에 의존하는 방법과 달리 AOM/DSS 유도 CAC는 토착적이므로 종양 개시가 내인성으로 발생하고 암 진행이 자연 조직 미세 환경에서 전개되어 생물학 및 자연사를 보다 밀접하게 반영합니다. 인간 세포주 또는 면역 저하 마우스에서만 성장할 수 있는 환자 유래 물질의 이종 이식편과 달리 면역 능력이 있어 암-면역 상호작용을 연구할 수 있습니다. 특정 유전적 동인을 가진 종양을 생성하는 유전자 조작 모델과 달리 사전 정의된 돌연변이에 구애받지 않으므로 암 신호 전달 경로 및 면역 교육 메커니즘의 광범위한 모델링이 가능합니다. 마지막으로, AOM/DSS 모델은 다양한 쥐 계통에 쉽게 적용할 수 있으므로 긴 번식 계획이 필요하지 않아 시간과 비용 효율성이 모두 높습니다. 그러나 동물의 성별, DSS 용량, 장내 미생물군의 차이와 같은 요인으로 인해 가변성이 발생하여 재현성에 영향을 미치고 중개 연구에서의 적용이 복잡해질 수 있습니다.

우리는 결장 염증 및 CAC 종양 형성 정도의 불일치를 뒷받침하는 이러한 요인의 영향을 완화하기 위해 이 프로토콜을 개선하는 것을 목표로 했습니다. 급성 염증, 대장염 또는 만성 염증을 유발하는 데 사용되는 DSS의 농도와 CAC 9,10에는 상당한 변동성이 있습니다. DSS는 폴리머이며 평균 분자량은 로트와 제조업체에 따라 다를 수 있어 실험 결과의 가변성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 연구 전반에 걸쳐 일관성을 보장하기 위해 DSS의 각 배치를 테스트하는 것이 필수적입니다. 또한, DSS 유발 염증의 정도는 장내 미생물군집의 영향을 크게 받으며, 이는 전 세계 마우스 시설 간, 심지어 동일한 기관 내의 서로 다른 보유 위치 및 콜로니 간에서도 크게 다를 수 있습니다11,12. 미생물 구성의 이러한 가변성은 모델의 결과에 영향을 미치고 일관되지 않은 결과에 기여할 수 있습니다13. 가능할 때마다 서로 다른 실험 그룹의 동물을 공동 수용하는 것은 변동성을 줄이는 데 중요하지만 미생물 군집이 시간이 지남에 따라 확률론적 드리프트를 겪고 만성 염증 모델에서 케이지 효과를 유발하기 때문에 이러한 교란 요인을 해결하기에는 충분하지 않을 수 있습니다14. AOM/DSS 프로토콜에는 만성 염증을 유지하기 위한 장기 치료가 포함되기 때문에 AOM/DSS 처리 동물을 수용하는 모든 케이지의 침구를 주기적으로 혼합하여 미생물군 균질화를 구현했습니다. 이 관행은 미생물군 환경을 균질화하여 실험적 변동성을 줄이는 데 도움이 됩니다. 게다가, 관찰에 따르면 DSS의 효과는 동물의 성별에 따라 달라질 수 있으며15,16 잠재적으로 염증 및 암 발병에 차등 반응을 일으킬 수 있습니다. 우리는 암컷 및 수컷 마우스에서 DSS를 별도로 적정하여 남녀 모두에게 적절한 DSS 용량을 선택하여 보다 균일한 결과를 보장하고 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 최적의 샘플 크기를 결정하기 위한 통계적 검정력 계산에 중요한 입력을 제공함으로써 기존 프로토콜을 개선했습니다.

전반적으로 AOM/DSS 모델의 재현성을 향상시키기 위해 이러한 교란 요인을 설명하고 완화하는 표준화된 프로토콜 지침 세트를 간략하게 설명합니다. 우리는 마이크로바이옴 균질화 기술을 사용할 뿐만 아니라 보다 일관되고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 정확한 DSS 용량 조정을 설명함으로써 AOM/DSS 모델의 유용성과 다양한 연구 간의 조화를 향상시킵니다. 우리의 프로토콜은 미생물군 균질화된 케이지의 변동성 감소를 입증하는 것으로 눈에 띄며 이러한 재현성 관행을 구현하기 위한 명확한 단계별 지침을 제공합니다. 결과적으로, 이러한 프로토콜 개선에 의해 영향을 받는 그룹 내 변동성이 낮아지면 실험 그룹 간의 차이를 감지하는 데 원하는 통계적 검정력을 달성하는 데 필요한 표본 크기가 감소합니다. 이 최적화된 프로토콜은 종양 형성 메커니즘, 치료 표적을 연구하거나 면역 세포 역학을 탐색하기 위해 균주나 성별 배경에 관계없이 AOM/DSS 모델을 자신의 마우스 모델 및 실험 설계에 적용하려는 연구자를 위해 맞춤화되었습니다.

프로토콜

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모든 동물 절차는 인도적인 취급과 윤리적 기준 준수를 보장하기 위해 기관에서 승인된 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다. 여기에 설명된 연구는 플로리다 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. DSS 투여 최적화

  1. 주요 실험에 사용할 연령, 계통 및 출처의 마우스를 수컷과 암컷이 균등하게 분포되어 얻습니다. 개별 추적을 위해 귀 펀치, 꼬리 표시 또는 기타 승인된 방법으로 각 마우스에 레이블을 지정합니다. 각 동물의 초기 체중을 측정하고 기록합니다.
    참고: 수컷 마우스는 젖을 떼기 전에 공동 수용해야 하며 싸움을 최소화하기 위해 케이지 사이에 재분배되어서는 안 됩니다.
  2. 자동 급수를 사용하는 경우 실험을 시작하기 1주일 전에 동물을 물병으로 전환하고 동시에 멸균 플러그로 케이지 노즐(케이지의 금속 시퍼 튜브)을 차단합니다.
    알림: 자동 식수 노즐 차단과 같은 물 공급에 대한 모든 변경 사항이 IACUC 또는 동물의 인도적 사용을 감독하는 적절한 규제 기관의 승인을 받았는지 확인하십시오. 동물 우리에서는 식수에 대한 중단 없는 접근을 보장하기 위해 매일 점검이 필요할 수 있습니다.
  3. 자기 교반 바와 교반 플레이트를 사용하여 1.5%에서 5%(w/v)의 다양한 농도로 고압멸균된 멸균 식수에 DSS를 용해시켜 DSS 용액을 준비합니다. DSS 분말이 물에 완전히 녹을 때까지 실온에서 30분 동안 기다립니다. 매주 DSS 물을 신선하게 준비하고 최대 1주일 동안 4°C에서 보관합니다.
  4. 50mL 원뿔형 튜브 2개에 각 농도의 DSS 물(남성용 1개, 여성용 1개)을 채우고 누출을 방지하기 위해 고압멸균된 멸균 음주 노즐을 단단히 부착합니다.
  5. 암컷 및 수컷 마우스에게 각 농도의 DSS 물을 투여하고, 각 케이지에 있는 3마리의 마우스가 동일한 농도를 받습니다. DSS가 없는 멸균 식수를 음성 대조군으로 사용하십시오. 격일로 DSS 물을 교체하십시오.
  6. 7일 동안 DSS 물을 투여합니다. 매일 각 마우스의 체중을 기록합니다.
  7. 8일째에 모든 동물을 일반 식수로 다시 전환하십시오.
  8. 8일째에 설명된 대로 표준화된 채점 시스템을 활용하여 대변 일관성을 기반으로 설사의 중증도를 평가하고17 및 기록 점수를 기록합니다. 부드럽지만 여전히 형성된 대변 알갱이로 "1", 매우 부드러운 대변 알갱이로 "2", 설사로 "3"점을 매깁니다.
  9. 8일째에 2-3개의 신선한 대변 알갱이를 수집하고 잠혈의 존재를 평가합니다( 재료 표 참조). 샘플에 혈액의 유무를 기록합니다.
  10. 대변 일관성(0-3)과 대변 내 혈액 유무(0-3)의 두 가지 점수 기준의 조합을 기반으로 장 출혈을 평가하여 총점 범위는 0에서 6입니다.
  11. 9일차부터 12일차까지 매일 각 마우스의 체중을 기록하고 DSS 처리된 동물의 상당한 체중 감소 및 심한 설사를 면밀히 모니터링합니다. 승인된 동물 사용 프로토콜 및 확립된 윤리 지침에 따라 이산화탄소(CO2) 질식 또는 기타 적절한 방법으로 인도적 종점에 도달하거나 초과하는 동물을 즉시 안락사시킵니다.
  12. 13일차부터 18일차까지 동물을 계속 모니터링하고 실험 전 수준으로 완전히 회복될 때까지 매일 각 마우스의 체중을 기록합니다.
  13. 부드럽지만 여전히 형성된 대변과 함께 약 20%의 체중 감소를 초래하는 최적의 DSS 농도를 결정합니다. 최적의 DSS 용량은 수컷과 암컷, 마우스 계통, 연령, DSS 로트 및 동물 시설에 따라 다를 수 있습니다.

2. CAC 유도

  1. 0-6일: AOM 치료 7-28일: DSS 치료의 1 번째 주기
    1. AOM 스톡 준비: AOM 분말을 멸균 식염수에 용해시켜 10mg/mL의 스톡 농도를 달성합니다. 0.45μm 필터를 통해 용액을 여과하고 1mL 분취량을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분배한 다음 -80°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
      알림: AOM은 휘발성 발암 물질이므로 제조업체의 안전 권장 사항에 따라 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 생물 안전 후드 아래에서 주의해서 취급해야 합니다. AOM 및 AOM으로 오염된 물질은 기관의 유해 화학 폐기물 처리 프로토콜에 따라 폐기해야 합니다. 필요한 환경 보건 및 안전 승인을 미리 확보하는 것은 조사자의 책임입니다.
    2. 자동 케이지 급수를 사용하는 경우 실험 시작 1주일 전에 자동 식수 노즐을 차단하고 1.2단계와 같이 적응을 위해 동물을 물병으로 전환합니다.
    3. 0일차에 각 마우스의 체중을 측정하고 기록하여 필요한 총 AOM량을 계산합니다. 그런 다음 각 동물의 체중을 기준으로 AOM(1mg/mL 최종 작동 농도)의 총 부피를 계산하여 10mg/kg의 용량(예: 20g 마우스의 경우 200μL)을 달성합니다.
    4. 매번 사용하기 전에 얼음 위에서 필요한 수의 10mg/mL AOM의 새로운 분취량을 해동합니다. AOM의 각 1mL 분취량을 멸균 식염수 9mL로 희석하여 1mg/mL의 작동 농도를 달성합니다.
    5. 복강내 주사를 통해 마우스에게 AOM을 투여합니다. 최적의 보호를 위해 이중 장갑 및 N95 마스크와 같은 적절한 PPE를 착용한 상태에서 생물 안전 캐비닛 내부에서 이 절차를 수행하십시오.
      주의 : 남은 AOM 용액은 유해 화학 폐기물 처리 요구 사항에 따라 폐기하십시오.
    6. 3일째에 AOM 처리된 동물을 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 보호를 위해 AOM으로 오염된 케이지 및 기타 재료를 다룰 때는 적절한 PPE를 착용하십시오.
      주의 : 더러워진 케이지 침구와 남은 음식은 기관에서 승인한 유해 화학 폐기물 처리 절차에 따라 폐기하십시오.
      참고: AOM과 그 대사산물은 투여 후 72시간까지 완전히 배설되며18, 이 시점에서 더러워진 케이지 침구를 폐기할 수 있습니다.
    7. 7일째에 장내 미생물군 균질화를 수행하여 케이지 간 변동성을 최소화합니다. 이를 위해 각 케이지에서 침구의 25%를 샘플링하고 완전히 혼합한 다음 각 케이지에 다시 분배합니다.
      참고: DSS 치료 주간과 그 후 5일 동안은 케이지 교체를 삼가하십시오. 필요에 따라 시설의 사육 케이지 교체 서비스와 조정하십시오.
    8. 적절한 노즐이 장착된 50mL 원추형 튜브를 사용하여 식수에 DSS를 제공하여 대장염 유도를 시작합니다. 동물이 DSS 물에 제한 없이 접근할 수 있는지 확인하기 위해 매일 쥐를 확인하십시오. 격일로 DSS 물을 교체하십시오. 매일 각 마우스의 체중을 기록합니다.
    9. 14일째에 DSS 물을 일반 식수병으로 교체합니다. 동물의 고통과 고통을 계속 면밀히 모니터링하십시오.
    10. 14-19일째에, 매일 각 마우스의 체중을 측정한다. 체중의 25% 이상 감소한 동물을 안락사시키거나 동물이 승인된 동물 관리 및 사용 프로토콜에 설명된 인도적 종점 중 하나에 도달한 경우 안락사시킵니다. 또한 직장 출혈 사례를 모니터링하고 기록하십시오.
  2. 7-28일: DSS 치료의 1번째 주기
    1. 7일째에 장내 미생물군 균질화를 수행하여 케이지 간 변동성을 최소화합니다. 이를 위해 각 케이지에서 침구의 25%를 샘플링하고 완전히 혼합한 다음 각 케이지에 다시 분배합니다.
      참고: DSS 치료 주간과 그 후 5일 동안은 케이지 교체를 삼가하십시오. 필요에 따라 시설의 사육 케이지 교체 서비스와 조정하십시오.
    2. 적절한 노즐이 장착된 50mL 원추형 튜브를 사용하여 식수에 DSS를 제공하여 대장염 유도를 시작합니다. 동물이 DSS 물에 제한 없이 접근할 수 있는지 확인하기 위해 매일 쥐를 확인하십시오. 격일로 DSS 물을 교체하십시오. 매일 각 마우스의 체중을 기록합니다.
    3. 14일째에 DSS 물을 일반 식수병으로 교체합니다. 동물의 고통과 고통을 계속 면밀히 모니터링하십시오.
    4. 14-19일째에, 매일 각 마우스의 체중을 측정한다. 체중의 25% 이상 감소한 동물을 안락사시키거나 동물이 승인된 동물 관리 및 사용 프로토콜에 설명된 인도적 종점 중 하나에 도달한 경우 안락사시킵니다. 또한 직장 출혈 사례를 모니터링하고 기록하십시오.
  3. 29-49일: DSS 치료의 2주기
    1. 2.2.1-2.2.4단계와 동일한 절차에 따라 DSS 투여와 함께 미생물군 균질화를 반복합니다. 선택 사항: 두 번째 및/또는 세 번째 DSS 주기 후에 이전에 설명한 대로 대장내시경 검사를 수행합니다19.
  4. 50-70일: DSS 치료의 3주기
    1. 2.2.1-2.2.4단계와 동일한 절차에 따라 DSS 투여와 함께 미생물군 균질화를 반복합니다. 쥐는 DSS의 세 번째 주기 후 3일 후에 가장 많은 체중을 감량하는 경향이 있으므로 이 기간 동안 과도한 체중 감소 또는 직장 출혈의 징후가 있는지 모든 동물을 면밀히 모니터링하고 필요한 경우 지지 치료를 위해 촉촉한 음식을 제공합니다.

3. 대장염 중증도 및 CAC 심안병리 평가

  1. 70일째에 각 마우스에서 2-3개의 신선한 대변 알갱이를 수집하여 잠혈 및/또는 리포칼린-220 과 같은 염증 표지자의 존재를 테스트하여 대장염 중증도를 평가합니다. 적절한 시약/키트(재료 및 장비 목록 참조)를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 아래에 간략하게 설명된 분석을 수행하십시오.
  2. 염증 표지자 리포칼린-2 수치 평가를 위해 대변 샘플을 준비하려면 신선한 대변 펠릿을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 균일한 용액이 될 때까지 와류 혼합기를 사용하여 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL에 펠릿을 용해시킵니다. 용액을 10,000 x g으로 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액은 리포칼린-2 ELISA에 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  3. 키트 제조업체의 지침에 따라 마우스 리포칼린-2 ELISA를 수행합니다. 파일럿 연속 희석 실험을 실행하여 표준과 비교하여 대변 샘플의 최적 희석을 결정합니다.
    참고: 리포칼린-2 수치는 수처리된 대조군 동물에 비해 DSS 처리된 마우스에서 최소 1000배 증가할 것으로 예상됩니다20.
  4. 단계 1.8-1.10에 설명된 대로 설사 점수 시스템17을 사용하여 대장염 중증도를 평가합니다.
  5. 70일째에 CO2 질식 또는 기타 승인된 인도적 방법을 사용하여 동물을 안락사시킵니다.
  6. 각 동물의 복부에 70% 에탄올을 뿌려 후속 단계에서 오염을 최소화합니다.
  7. 미세한 수술용 겸자를 사용하여 피부와 복막층을 들어 올리십시오. 가위로 수평 절개를 하여 복강을 노출시킵니다.
  8. 소장을 바깥쪽으로 당기고 맹장을 식별합니다. 집게를 사용하여 맹장과 결장을 부드럽게 들어 올립니다. 가위를 사용하여 장간막과 관련 맥관 구조를 절단하여 결장을 조심스럽게 해부하고 결장에 구멍을 뚫거나 절단하지 마십시오.
  9. 골반 뼈와 직장-항문 부위 주변의 피부를 절단하여 완전한 원위 결장을 노출시킵니다. 대부분의 종양은 일반적으로 이 부위에서 발생하므로 원위 부분을 손상되지 않은 상태로 전체 결장을 해부하는 것이 중요합니다.
  10. 해부된 결장을 깨끗한 여과지 위에 놓고 부드럽게 곧게 펴십시오.
  11. 눈금자로 결장 길이를 측정하고 사진으로 기록합니다. 축척을 위해 사진에 자를 포함하십시오.
  12. 결장 외부의 파이어 패치를 청소하고 조직에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오.
  13. 차갑고 멸균된 PBS로 결장을 헹굽니다.
  14. 파라핀 필름을 사용하여 200μL 마이크로피펫 팁(필터 제외)을 3mL 주사기에 고정합니다. 이 설정을 사용하여 주사기에 멸균 PBS를 채우고 피펫 팁을 결장 내강에 삽입한 다음 결장의 내용물을 2-3회 부드럽게 씻어내어 대변 알갱이를 완전히 제거합니다.
  15. 깨끗하고 미리 적신 여과지 스트립에 결장을 부드럽게 펴십시오. 결장을 세로로 잘라 여과지 위에 평평하게 놓습니다.
  16. 일반적으로 염증이 있는 붉은 모양과 함께 결장벽에서 돌출된 눈에 띄는 수포로 나타나는 더 큰 종양을 식별합니다.
  17. 더 작은 종양의 경우 식별하는 동안 추가적인 주의를 기울여야 합니다. 멸균 박테리아 파종 루프를 사용하여 결장 표면에 불규칙성이나 돌기가 있는지 부드럽게 조사합니다. 감지된 돌기가 결장벽 외부에 위치한 림프절이나 혈관의 잔여물이 아닌지 확인하십시오.
  18. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 각 종양의 너비와 길이를 측정합니다.
  19. 종양 수와 각 종양의 크기 및 위치를 미리 인쇄된 결장 지도에 기록합니다.

4. 조직학 평가

  1. 두 쌍의 끝이 가는 겸자를 사용하여 원위 결장의 양쪽 측면 끝을 잡습니다. 결장을 말단에서 근위 끝으로 굴려 다른 곳에서 설명한 대로 스위스 롤 모양으로 굴립니다21. 원위 끝이 롤의 중앙에 있고 근위 끝이 가장 바깥쪽 층을 형성하는지 확인하십시오.
  2. 271/2G 바늘을 사용하여 각 스위스 롤 결장을 고정합니다.
  3. 고정된 각 스위스 롤 결장을 적절하게 라벨이 붙은 조직 카세트에 넣습니다.
  4. 스위스 압연 결장이 포함된 조직 카세트를 멸균 PBS의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 담그십시오. 조직이 24시간 동안 고정액에 남아 있도록 합니다.
  5. 24시간 후, 조직을 70% 에탄올로 옮깁니다. 조직은 4°C에서 70% 에탄올에 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
  6. Swiss-roll은 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, 면역조직화학 및 면역형광을 포함한 여러 조직병리학 검사에 사용할 수 있습니다.

5. 종양 및 주변 결장에서 단백질 및 RNA 분리를 위한 조직 수확

  1. 얼음 위에서 작업하고 사전 냉각된 튜브와 시약을 사용하여 생물학적 물질의 무결성을 보존합니다.
  2. 종양 평가 후, 종양을 해부하고 얼음 위에 적절한 완충액(아래 참조)을 사용하여 미리 냉각되고 미리 라벨이 붙은 튜브에 수집합니다. 실험 설계에 따라 동일한 동물의 모든 종양을 모으거나 개별적으로 처리합니다. 원하는 경우 유사하게 ~1cm 조각의 주변 비종양 결장 조직을 수집합니다.
  3. 단백질 분리
    1. 0.5mL의 800μm 분쇄 유리 구슬과 400μL의 용해 완충액(20mM Tris-HCl(pH 7.5)이 포함된 150mM NaCl에 1% NP-40 및 1% 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 각 조직 균질화 튜브에 넣고 결장/종양 조직을 각 튜브로 옮깁니다.
    2. 비드 기반 조직 균질화기를 사용하여 30초 동안 6M/S로 결장/종양 조직을 균질화하고, 완전한 균질화를 위해 두 번 반복합니다.
      알림: 기계적 균질화로 인한 샘플 과열을 방지하기 위해 사이클 사이에 얼음 위에 튜브를 놓습니다.
    3. 균질화 후 150μL의 용해물(상층액)을 흡인하고 깨끗한 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    4. 4°C에서 10,000g의 용해물을 회전 시켜 불용성 물질을 펠릿화합니다. 원하는 경우 상청액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다.
    5. 비신코닌산(BCA) 분석 또는 기타 적절한 방법으로 총 단백질 농도를 정량화합니다.
    6. 원하는 경우 동일한 용해 완충액을 사용하여 각 샘플에 대해 총 단백질 농도를 4 mg/mL로 조정합니다.
    7. 면역블로팅 또는 사이토카인 분석과 같은 다운스트림 분석을 위해 단백질 용해물을 즉시 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관하십시오.
  4. RNA 정제:
    1. 해부 후 결장/종양을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣고 200μL의 적절한 RNA 보존 시약에 담급니다.
      참고: 일시 중지 지점: 신선한 결장/종양 조직은 액체 질소에서 급속 냉동하고 나중에 처리하기 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
    2. 얼음 위에서 결장/종양 조직을 해동합니다.
    3. 결장/종양을 RNA 분리에 적합한 적절한 용해 완충액 500μL와 분쇄 유리 비드 200μL가 들어 있는 조직 균질화 튜브로 옮깁니다.
    4. 비드 기반 조직 균질화기를 사용하여 30초 동안 30회 균질화하고 각 사이클 사이에 2분의 휴식 시간을 둡니다.
      참고: 기계적 균질화 중 과열로 인한 RNA 분해를 방지하기 위해 사이클 사이에 얼음 위에 튜브를 옮깁니다.
    5. 300μL의 용해물을 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    6. 필요에 따라 적절한 RNA 정제 절차를 사용하여 총 RNA를 분리합니다. 다운스트림 사용에 적합한 RNA 농도, 순도 및 품질/무결성을 측정합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험 조건에 대해 DSS 용량 최적화를 수행했습니다. DSS 투여량은 모든 동물 시설, 마우스 계통, 연구 설계 및 DSS 로트에 대해 재보정되어야 합니다. 이 연구를 위해 C57BL/6J 마우스를 임의로 표준 조사된 18% 단백질 설치류 사료와 함께 환기된 케이지의 특정 병원균이 없는 비바리움에 수용했습니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 DSS 물에 놓인 후 5일째부터 체중 감소를 시작하여 DSS 중단 후 3일 후에 가장 낮은 체중에 도달합니다(그림 1A,C). 체중 감소가 가장 큰 날, 수컷 마우스는 약 15%의 체중 감소를 보인 반면, 암컷 마우스는 약 20%의 체중 감소를 보였습니다(그림 1B,D). 이러한 결과를 바탕으로 특정 실험 조건에 대한 최적 용량은 여성의 경우 3.0%, 남성의 경우 3.25%라고 결정했습니다. AOM/DSS에 대한 치료 일정은 그림 2A에 요약되어 있으며, 케이지 효과와 가변성을 완화하기 위해 실험이 끝날 때까지 각 DSS 치료 주기가 시작될 때 마이크로바이옴 균질화가 발생합니다. 전체 실험 기간 동안 동물의 체중 감소 및 회복의 일반적인 역학은 그림 2B에 나와 있습니다. 동물은 DSS 투여 중단 후 2주 이내에 원래 체중으로 완전히 회복됩니다. 잘 보정된 DSS 대장염 모델은 설사 대신 부드럽지만 여전히 형성된 대변 알갱이를 초래하며(대변 일관성 점수 1-2), 무증상 출혈을 나타내는 대변에서 잠혈이 가끔 검출되고 대변에서 눈에 보이는 혈액이 거의 없는 경우(혈액 존재 점수 1-2)17. 대장염의 중증도를 추가로 평가하기 위해 대변 샘플을 수집하여 염증 표지자인 리포칼린-2 수치를 분석했습니다. 잠혈의 존재는 DSS 처리된 동물과 달리 실험 전반에 걸쳐 규칙적인 식수를 섭취한 마우스에서 검출되지 않았습니다(그림 2C). 일관되게, 리포칼린-2 수치는 AOM/물 전용 대조군에 비해 AOM/DSS 처리된 마우스에서 약 1,000배 상승했습니다(그림 2D).

종점에서 결장을 해부하고 종양 기록 지도를 사용하여 종양을 계산했습니다(그림 3A). DSS-대장염은 AOM/물 전용 대조군과 달리 결장 길이가 상당히 짧아집니다(그림 3B). 또한, AOM/DSS 처리된 동물은 눈에 보이는 결장 종양이 발생하며, 대부분은 원위 말단에 형성됩니다(그림 3C). H&E-염색된 결장 절편의 조직학적 검사에서 AOM/DSS 마우스에서 상당한 상피 세포 침식, 면역 침윤 및 궤양이 나타났습니다(그림 4A). 결장 조직병리학의 중증도는 면역 침윤 및 부종(0-3), 궤양(0-3), 결장 상피 형태(0-4) 및 신생물(0-4)22,23,24. 그림 4A의 조직학 예에 적용된 이러한 평가 결과는 그림 4C에 제시되어 있습니다. 결장 상피 증식은 Ki67 염색을 이용한 면역조직화학적 분석을 통해 평가되었으며, DSS 치료가 결장 상피 세포의 증식을 촉진한다는 것을 입증했습니다. 또한, 결장 절편은 혈관신생 마커 CD31과 같은 다양한 마커의 면역형광 염색에 활용될 수 있습니다(그림 4D,E).

우리는 각 동물의 결장 염증의 크기, 체중 감소 및 누적 종양 부담과 같은 실험 종점에 대한 미생물군 균질화의 효과를 추가로 평가했습니다. 한 그룹의 마우스는 미생물군 균질화를 달성하기 위해 0일에 더러워진 침구의 혼합 및 재분배를 받은 케이지에 수용되었으며, 이 조작이 생략된 우리에서 대조군 동물과 함께 있었습니다. 두 그룹의 동물은 7일 동안 2.5% DSS 물을 받았습니다. 8일째 케이지당 대변 내 염증 표지자 리포칼린-2의 평균 수준은 그룹 간에 유의한 차이가 없었지만(Welch의 t-테스트), 미생물군 균질화를 거친 케이지의 데이터 포인트 간 변동성이 유의하게 낮은 것을 관찰했습니다(그림 5A, 분산을 비교하기 위한 Welch의 F-테스트, p<0.0001). 일관되게, 8일째까지 모든 동물은 0일 기준선과 비교하여 비슷한 정도의 체중 감소를 보였습니다. 그러나 미생물군 균질화 그룹의 마우스는 대조군에 비해 체중 감소의 변동성이 적었습니다(그림 5B). 또한, 각 DSS 주기 전에 (미생물군 균질화) 및 (대조군) 케이지 침구 혼합이 없는 10주 CAC 유도 프로토콜(그림 2A)에서, 마우스당 누적 종양 부담은 유의하게 더 가변적인 대조군에 비해 미생물군 균질화 그룹에서 더 일관되었습니다(그림 5C). 전반적으로 이러한 데이터는 미생물군 균질화가 AOM/DSS 모델의 견고성과 재현성을 크게 향상시킨다는 강력한 증거를 제공합니다.

figure-results-1
그림 1. 수컷 및 암컷 마우스의 DSS 용량 적정. (A-D) 표시된 DSS 농도(1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 암컷의 경우 2%, 3%, 4%)로 물에 유지된 14주 된 수컷(A, B) 및 암컷(C, D) C57BL/6J 야생형 마우스에서 0일 대비 체중 변화율. (ᅡ, ᅡ) 동물에게 7일 동안 DSS를 투여하고 최대 12일 동안 체중 감소를 모니터링했습니다. B 및 D는 DSS 치료 시작 후 8일(B)에 수컷 마우스의 체중 감소를 나타내고 9일(D)에 암컷 마우스의 체중 감소를 나타냅니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. A & B에서 n=3, C & D에서 n=4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2. AOM/DSS로 인한 CAC 타임라인 및 모니터링. (A) AOM/DSS 유도 CAC 실험 일정. (B) 실험적 AOM/DSS 처리(빨간색) 또는 대조군(AOM 전용, DSS 없음, 검은색) 암컷 C57BL/6J 야생형 마우스에서 0일 대비 체중. 모든 동물은 AOM(10mg/kg)을 1회 투여받았고 총 70일 동안 3% DSS(빨간색) 또는 일반 식수(대조군, 검은색)의 3주기로 무작위 배정되었습니다. 데이터는 SEM± 평균, n=2 및 11로 표시됩니다. (C) 대조군(AOM만) 또는 DSS 처리(AOM 및 1.5% DSS) 암컷 마우스의 분변 혈종 검사. (D) 70일에 6마리의 대조군(AOM만, 검은색) 또는 35마리의 처리된(AOM 및 1.5% DSS, 빨간색) 암컷 마우스의 분변 리포칼린-2 수준. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. 결장의 거시적 평가. (A) 종양 기록 지도의 예. (B) 70일에 대조군(AOM만) 또는 DSS 처리(AOM 및 1.5% DSS) 암컷 마우스의 대표적인 결장 사진. 결장 길이 단축은 DSS 처리된 동물에서 더 큰 염증을 나타냅니다. 바 - 5mm; , p=0.002, Mann-Whitney 순위 합계 테스트; n=12 &; 30. (C) AOM 및 3% DSS로 치료한 암컷 마우스로부터 70일째에 종양이 있는 결장의 대표적인 육안적 병리학 사진(종양은 원으로 표시되고 검은색 삼각형으로 표시됨). 바 - 5mm. 콜아웃 - 종양이 있는 원위 결장 부위의 확대 보기; 막대 - 1mm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. CAC 조직학 평가. (A) 오른쪽에 표시된 3마리의 동물의 확대된 원위 영역이 있는 70일째에 AOM/DSS 처리 및 대조군(AOM만) 마우스의 스위스 롤링 결장의 대표적인 H&E 염색 절편. 대조군 결장은 온전한 결장 선와조직을 보여줍니다. AOM/DSS 치료 마우스의 결장은 점막하 비후(화살촉), 면역 침윤(화살표), 선와구조의 파괴 또는 손실(별), 상피층의 침식, 상피 증식 또는 선종 및 선암종 형성을 동반한 이형성 상피(원)를 특징으로 합니다(점선으로 윤곽선). 바 - 500 μm. (B) CAC 표현형의 중증도를 평가하는 데 사용되는 조직병리학 점수 시스템. (C) A에 표시된 AOM 단독 또는 AOM/DSS 처리 마우스의 결장 조직학 점수의 예. (D) DSS의 1 또는 3주기 후 AOM 처리 동물의 스위스 압연 결장에서 Ki67 증식 마커에 대한 대표적인 면역조직화학 염색. 증식하는 Ki67 양성 세포(갈색)는 결장 선와의 바닥에 국한되지만 위쪽으로 퍼져 CAC 개시 및 보다 진행된 병리를 통해 선와복 내부를 침범합니다. 바 - 100 μm. (E). CD31 내피 마커(빨간색)를 기반으로 혈관 형성을 평가하고 DAPI로 대조염색하여 AOM/DSS 처리 마우스의 결장 절편에서 핵(파란색)을 시각화하는 대표적인 면역형광 염색. 바 - 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5. 미생물군 균질화는 결장 염증 및 CAC 종양 부담의 가변성을 감소시킵니다. (A) 8일째에 2.5% DSS로 처리된 마우스의 평균 분변 리포칼린-2 수치. 두 그룹 간의 평균 대변 리포칼린-2 수치를 비교하기 위해 Welch의 t-test를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다(p=0.137, n=6 &; 12 케이지). 또한 분산에 대한 F-테스트를 수행하여 p-값이 0.0001로 두 그룹 간의 분산에 상당한 차이가 있음을 나타냅니다. (B) 8일째에 DSS 물을 투여받은 AOM/DSS 처리 동물의 평균 체중 감소. 두 그룹 간의 평균 체중 감소는 유의하게 다르지 않지만(Welch의 t-테스트, p=0.194, n=6 &; 12), 그룹 내 분산은 유의하게 다릅니다(F-테스트, p=0.027). (C) AOM/DSS 치료 10주 후 마우스당 종양 부담. 통계 분석은 그룹 간 평균 종양 부담의 차이를 평가하기 위해 Welch의 t-테스트(p=0.211, n=8 &; 18)와 분산 간의 차이를 평가하기 위한 F-테스트(p=0.013)를 사용하여 수행되었습니다. (A-C) 파란색 바이올린 플롯은 미생물군 균질화를 거친 그룹을 묘사하는 반면, 녹색 바이올린 플롯은 대조군(미생물군 균질화 없음)을 나타내며 ns는 유의하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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AOM/DSS 프로토콜은 1996년 Okayasu et al.25에 의해 처음 도입되었으며 이후 Suzuki et al. 200626, 특히 결장 염증의 맥락에서 입증된 바와 같이 정상 조직에서 선종 변화 및 궁극적으로 암종으로 결장암의 시작 및 진행을 충실하게 모방하는 우수한 모델로 인식되었습니다. 후속 연구에서는 다양한 마우스 계통에 걸쳐 AOM 및 AOM/DSS의 효과와 다양한 치료 기간이 종양 표현형 및 침투도에 미치는 영향을 평가했습니다 26,27,28. 2018년 크리스토퍼 윌리엄스와 그의 그룹은 이 방법론 개발을 위한 중요한 토대를 마련한 업데이트된 프로토콜29를 발표했습니다. 최근의 발전은 장 면역 침윤의 분리 방법과 유세포 분석을 통한 면역 표현형 분석을 통합함으로써 점막 면역 연구를 위한 AOM/DSS 모델의 유용성을 추가로 입증했습니다30.

AOM/DSS 프로토콜의 주요 강점 중 하나는 거의 모든 쥐 계통에 쉽게 적응할 수 있어 다양한 유전적 배경의 영향에 대한 조사를 촉발한다는 것입니다. 따라서, Suzuki et al. 결장 선종 침투율을 판독값으로 사용하여 4개의 다른 마우스 계통에서 AOM/DSS 유도 결장 발암에 대한 감수성을 비교했으며, 다음 결과를 얻었습니다: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. 추가 연구에서 FVB/N 마우스는 C57BL/6J 및 129/SvJ 균주에 비해 반복적인 AOM 치료 후 결장 종양이 더 쉽게 발생하는 것으로 나타났습니다27. 특히, 10주 AOM/DSS CAC 유도 프로토콜에서 거의 100% 침투도를 갖는 잘 분화된 결장 선암종의 발달이 FVB/N 마우스에서 보고되었습니다31. 이러한 발견은 종합적으로 다양한 마우스 계통이 AOM/DSS 치료에 동등하게 민감하지 않을 수 있음을 시사하며, 이는 종양 형성의 변화에 기여하고 마우스 계통, 주거 시설 및 기타 변수에 걸쳐 AOM/DSS 프로토콜 조화 및 재현성에 대한 일관된 지침 세트의 필요성을 더욱 강조합니다. 그 중 장내 미생물군집의 상당한 가변성은 염증 및 종양 침투율에 초점을 맞춘 연구의 재현성을 방해합니다 9,10. 특히, Duncaniella muricolitica 및 Alistipes okayasuensis 종을 포함한 장내 미생물군집의 구성은 DSS 대장염의 중증도에 막대한 영향을 미칠 수 있습니다13. 또 다른 연구는 NLRP3 결핍 마우스가 박테리아 문 Bacteroidetes(특히 Prevotellaceae) 및 TM7의 존재 증가를 특징으로 하는 악화된 대장염 표현형을 나타낸다는 것을 입증함으로써 CAC 유도에서 미생물군 구성의 중요성을 강조했습니다10.

이 방법의 인기에도 불구하고 기존 AOM/DSS 프로토콜은 실험 그룹32 내에서 동물 간에 관찰되는 높은 변동성의 중요한 문제를 해결하지 못했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 DSS 적정(동물 성별 고려) 및 미생물군 균질화를 구현하여 프로토콜 최적화 및 조화에 대한 일련의 권장 사항을 제시했습니다. 우리의 접근 방식은 동물 계통, 실험 설계 및 종점 전반에 걸쳐 AOM/DSS 모델의 변동성을 줄이고 재현성을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 표본 크기에 대한 구체적인 권장 사항을 제공할 수는 없지만 실험 반복 횟수는 특정 연구 설계와 각 실험에 대한 예상 효과 크기에 따라 결정됩니다. 이러한 개선에 의해 달성된 더 낮은 그룹 내 변동성은 이러한 차이를 감지하는 데 동일한 통계적 검정력을 달성하기 위해 각 조건에서 더 적은 수의 동물을 필요로 합니다. 우리는 이러한 개선을 통해 동물의 윤리적 사용, 연구 자금의 책임 있는 관리, 노동력 감소를 더욱 촉진하여 효율성 향상으로 이어질 것으로 기대합니다.

AOM/DSS 모델은 인간 대장염 관련 대장암을 연구하는 데 상당한 번역 가치가 있습니다. 복잡한 병인으로 인해 인간 CRC를 모델링하는 데 어려움이 있다는 점을 감안할 때 AOM/DSS 모델이 산발성 CRC의 병인에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 염증 관련 악성 종양에 대한 연구에 가장 적합하다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 또한, AOM/DSS 유발 암은 전이 발생률이 낮기 때문에33,34 전이 확산 연구에는 부적절합니다. 이러한 한계에도 불구하고 AOM/DSS 모델은 침투력이 뛰어나고 신뢰성이 높으며 인간 관련 조직병리학을 입증하고 염증에서 이형성증, 선암종에 이르는 질병 진행을 정확하게 모방하는 동시에 비용 효율성을 유지합니다. 이 프로토콜에서는 재현 가능한 결과를 생성하고 기존 워크플로를 기반으로 교란 요인을 최소화하기 위한 권장 사항을 제공합니다 8,35.

동물의 성별을 생물학적 변수 16,36,37로 설명하는 용량-반응 파일럿 실험을 통해 최적의 DSS 용량을 식별하는 것은 강력한 AOM/DSS 프로토콜을 확립하기 위한 첫 번째 중요한 단계입니다(그림 1). 우리는 7일 동안 3% DSS로 치료한 결과 남성(~15%)에 비해 여성(~20%)의 체중이 더 크게 감소한다는 것을 발견했습니다(그림 1B,D). 그러나 수컷 마우스는 암컷에 비해 DSS에 더 많거나 덜 또는 동등하게 민감할 수 있습니다. 이는 동물 시설 전반에 걸쳐 다양한 마우스 계통과 장내 미생물 구성의 변화에 기인할 수 있으며, 각 특정 실험 세트에 맞게 DSS 농도를 재조정해야 합니다. 최적의 DSS 농도는 허용 가능한 독성을 초과하지 않고 결장 염증을 최대화하는 것과 종양 유도 사이의 절충안입니다. 우리의 경험에 따르면 이 균형은 DSS 용량에서 달성될 가능성이 가장 높으며 첫 번째 주기 후 약 20%의 체중 감소를 초래합니다. 동물은 치료의 두 번째 주기에서 체중이 덜 감소하는 경향이 있지만 일반적으로 DSS의 세 번째 주기에서 더 큰 체중 감소가 관찰되며, 이는 잠재적으로 결장의 종양 형성으로 인해 관찰됩니다. 따라서 25%의 체중 감소는 기관 동물 사용 프로토콜의 인도적 종점으로 채택될 수 있습니다. 또한, 잘 보정된 DSS 대장염은 설사보다는 부드러우지만 여전히 형성된 대변 알갱이와 가끔 양성 혈혈 검사를 초래하지만 대변에 눈에 보이는 혈액 흔적이 있는 경우는 거의 없으며 동물은 DSS 투여 중단 후 2주 이내에 완전히 회복될 것으로 예상됩니다.

DSS는 분자량이 36,000에서 50,000 Da 사이인 폴리머입니다. DSS 제조의 로트 간 변동성으로 인해 제품의 각 새로운 배치에 대해 DSS 용량 재보정 실험을 수행하는 것이 필수적입니다. 일관성을 유지하려면 동일한 로트에서 전체 연구를 구매하는 데 필요한 DSS의 총량을 추정하는 것이 실용적입니다. 또한, 이 프로토콜은 또한 CAC 유도 동안 마우스의 전체 실험 코호트에 걸쳐 미생물군 구성을 표준화하여 잠재적인 케이지 효과를 완화하여 변동성을 줄이는 단계를 설명합니다. 케이지 효과를 최소화하기 위한 추가 예방 조치로 가능하면 서로 다른 실험 그룹의 동물을 함께 수용하는 것이 좋습니다. 특정 실험 목표와 윤리적인 동물 사용 정책에 따라 이러한 고려 사항은 파일럿 실험에 반영되어야 합니다. 미생물군 표류는 또한 음료수가 새는 젖은 케이지의 침구 교체에 의해 촉진될 수 있습니다. DSS 배송 중 및 그 후 5일 동안은 케이지 교체를 삼가는 것이 가장 좋습니다. DSS 물 투여에 50mL 튜브를 사용하면 누출 위험이 줄어들고 DSS 낭비가 최소화됩니다. 이러한 물류 고려 사항에는 연구 직원과 케이지 교체 및 사육 서비스를 수행하는 동물 관리 기술자 간의 긴밀한 협력이 필요할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 조직 및 세포 수확과 데이터 수집을 위한 기본 워크플로도 제공합니다. 여기에는 잠혈의 존재에 대한 테스트(그림 2C) 및 종양 매핑(그림 3A)이 포함됩니다. AOM/DSS 모델은 면역 적격 마우스에 적합하며, 이종 이식 접근법과 달리 완전히 온전한 면역 체계38,39 때문에 종양 면역 미세 환경을 탐색하는 데 이상적인 시스템입니다. 특히, 세포 유형 특이적 유전자 녹인/아웃 또는 리포터 카세트를 위한 유전적 Cre-Lox 시스템을 통해서든 특정 세포 집단의 생착 또는 고갈을 통해 면역 체계 또는 간질 구성 요소의 실험적 교란에 순응할 수 있습니다. 한 가지 예로, AOM/DSS 모델을 골수 이식과 결합하여 이전에 조혈계의 돌연변이가 CAC 중증도와 부담을 어떻게 조절하는지 조사했습니다40. 이러한 연구를 지원하기 위해 면역 표현형, 기능 분석 및 단일 세포 다중 오믹스와 같은 추가 분석에 적합한 생존 가능한 종양 침윤 백혈구를 분리하기 위한 우수한 발표된 방법이 있습니다41. 마지막으로, 높은 침투율과 일관된 잠복 시간으로 인해 AOM/DSS 모델은 총 종양 부하를 1차 판독값으로 사용하는 전임상 치료 연구에 적합합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 NIH 어워드 R01 DK121831(OAG) 및 R01 AI067846(DA)에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다. OAG는 또한 Edward P Evans Foundation과 Oxnard Family Foundation의 지원을 받았습니다. DA는 Merit Society 상의 지원을 받습니다. UFHCC는 NCI 지정 암 센터(P30 CA247796)입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아족시메탄 분말Sigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586결장 종양을 유도하는 발암 물질
치탑 미세 원심분리기NA  NA샘플 준비용 
C57BL/6J 마우스잭슨 연구소000664각 특정 연구에 적합한 균주 및 연령
원뿔형 튜브, 50mL피셔14955239DSS 물
덱스트란 황산나트륨염 투여, MW 약 40,000Cayman Chemical 23250결장 염증을 유도하기 위해 
에탄올, 70%피셔 43655223작업 표면 및 해부 도구 소독 유리
구슬 연삭, 800 및 마이크로; m VWR12621-148결장/종양 조직의 균질화를 촉진하기 위해
HemoCue America  Beckman Coulter Heoccult ICT 면역화학 분변 잠혈 테스트 키트HemoCue America 395065A카탈로그 번호 23280010대변 내 잠혈 검출용
인슐린 주사기 27GX5/8 1CC BD 3294-12AOM 주사용
Lixit 차단제NANA마우스 케이지로의 자동 물 전달을 차단하기 위해(동물 시설에서 제공, 멸균)  
마그네틱 교반 바 및 교반판 NANADSS 를 용해하려면;
마이크로튜브 비드 균질화기, BeadBlaster 24 벤치마크D2400결장/종양 균질화
마우스 리포칼린-2/NGAL 듀오셋 ELISAR& D Systems카탈로그 번호 DY1857대변 샘플에서 리포칼린-2 검출
NP-40 용액, 10%Thermo Fisher Scientific85124용해 종양/결장 조직용
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher ScientificA65453총 조직 용해물 또는 기타 적절한 방법의 단백질 농도 정량화 프로
테아제 및 인산염 억제제 칵테일 피셔PI78440사이토카인/단백질 분석을 위한 샘플 준비 
RLTplus 완충액Qiagen1053393RNA 또는 기타 적절한 RNA 분리 방법
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021RNA 분리 전에 조직 샘플을 보존하기 위해
RNeasy Microprep kit QIAGEN74004RNA 분리 또는 기타 RNA 분리 및 정제 방법 설치
류 물병 노즐(30mm)비전유형 E물 또는 DSS 용액 투여용
멸균 가위 및 겸자NANA조직 해부용
주사기 바늘, 27G x 1/2인치 길이(짧음)BD 305109결장 스위스 롤 조직 고정용 
사기, 루어 잠금 장치, 3 mLBD 309657해부 및 병기 결정 전에 결장을 세척하기 위해
TapeStationAgilentRNA 농도 및 품질/무결성 평가용
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15표준 설치류 사료, 18% 단백질, 조사
조직 카세트VWR#87002-472포매용 샘플 보존 탑
로딩 실험실 저울, 0-220gNANA동물의 무게를 측정하기 위해
Whatman 압지VWR 국제Cat# 28298-020육안적 병리 및 종양 계수를 위해 해부된 결장의 병기 결정용
벤주

참고문헌

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