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방법 논문

종양 미세환경의 PET 이미징을 위한 합성 모듈에서 [68Ga]Ga-3BP-3940의 자동 제조

1.7K 조회수

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DOI:

10.3791/68356

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2025년 4월 25일

 ,  ,  , 
1Nuclear medicine department, Institut régional du Cancer de Montpellier (ICM), University of Montpellier, 2IBMM, University of Montpellier, CNRS, ENSCM

이 논문에서

요약

이 연구는 섬유아세포 활성화 단백질의 PET 이미징을 위해 GAIA V2 신디사이저를 사용한 [68Ga]Ga-3BP-3940 생산을 위한 자동화 프로세스를 설명합니다. 3개의 테스트 배치에 대해 수행된 품질 관리 테스트의 결과도 제공됩니다.

초록

종양 미세환경의 양전자 방출 단층 촬영 이미징을 위해 섬유아세포 활성화 단백질을 표적으로 하는 분자 이미징 프로브인 3BP-3940의 자동 갈륨-68 방사성 라벨링을 위한 GAIA 합성 모듈에서 빠르고 효율적인 방법이 개발되었습니다. 반응 조건에는 아세테이트 완충액(최종 농도: 0.1 M), 방사선 분해 방지제로서의 메티오닌(최종 농도: 5.4 mg/mL) 및 3BP-3940 30 μg이 포함되었으며 98°C에서 8분 동안 가열되었습니다. C18 카트리지의 최종 정제 단계는 고순도의 방사성 표지 제품을 얻기 위해 필요했습니다. 대조적으로, 발생기에서 생산된 68Ga는 양이온 교환 카트리지에 농축 단계 없이 직접 사용되었습니다. 3개의 검증 배치를 생산하여 방사성 HPLC(99.1% ±± 0.1%) 및 방사성 TLC(99.2% ± 0.1%)에 의해 측정된 높은 방사성 화학적 순도(RCP)로 22.3분 0.6분 내에 [68Ga]Ga-3BP-3940을 합성할 수 있는 방법의 신뢰성을 확인했습니다. 방사성 HPLC로 측정한 RCP 값을 기준으로 한 평균 방사성 화학 수율은 74.4% ± 3.3%였습니다. 방사성 표지된 제품의 안정성은 준비 후 최대 4시간 동안 입증되었습니다. 이 프로토콜은 임상 환경으로 쉽게 전환될 수 있는 [68Ga]Ga-3BP-3940의 준비를 위한 신뢰할 수 있고 신속하며 효율적인 방법론을 제공합니다.

서론

최근 몇 년 동안 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 것은 진단 및 치료 응용 분야에서 상당한 관심을 불러일으켰습니다1. TME 내의 풍부한 세포 유형, 신호 분자 및 세포외 기질(ECM) 거대분자는 광범위한 잠재적 분자 표적을 제공합니다2. 상주 숙주 세포 및 침투 숙주 세포 중 암 관련 섬유아세포(CAF)는 TME 내에서 정상적인 섬유아세포와 표현형적으로 다른 섬유아세포의 뚜렷한 하위 집합을 형성합니다. CAF는 고유한 세포 및 분자 특성을 통해 종양 진행, 전이, 면역 회피 및 치료 저항성에 중요한 역할을 합니다3. 이러한 중간엽 세포는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 발현으로 표시되는 활성화된 표현형을 나타냅니다. 분자적으로 CAF는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자(예: TGF-β, IL-6 및 CXCL12) 및 ECM 단백질(예: 콜라겐, 피브로넥틴)의 복합 배열을 분비하여 ECM을 리모델링하고 종양 유발 촉진 환경을 조성합니다4.

CAF 막의 세포외 표면에서 과발현되고 국소화되는 매우 특이적인 단백질인 FAP는 특히 핵의학 및 방사성 의약품 응용 분야에서 신뢰할 수 있는 분자 표적의 모든 특성을 나타냅니다5. 이러한 맥락에서, DOTA 그룹과 함께 기능화된 FAP(FAPI)의 퀴놀린 기반 소분자 억제제가 개발되어 신속하게 임상에 도입되었습니다 6,7,8. 특히, 양전자 방출 단층촬영(PET) 이미징을 위해 갈륨-68(β+ 이미터, t1/2 = 68분)로 방사성 표지된 FAPI-04 및 FAPI-46은 섬유성 질환, 심장학 및 종양학에서 상당한 가치를 입증했으며8,9, 특히 [18 F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG)의 효용성이 제한된 암의 경우10. 그러나 종양학 및 비악성 질환 영상에 대한 기여는 부인할 수 없지만, 저분자 FAPI는 특히 건강한 조직에 대한 의도하지 않은 방사선 조사로 이어질 수 있는 최적이 아닌 종양 내 체류 시간으로 인해 표적 방사성 핵종 요법(TRT) 적용에 특정 한계를 나타냅니다11. 이 문제를 해결하기 위해 다가 리간드 11,12의 설계 또는 반감기가 짧은 치료용 방사성 핵종 13,14,15의 사용과 같은 몇 가지 전략이 검토되었습니다. FAP에 대한 친화력이 높고 세포 내재화의 높은 비율을 유발하는 새로운 분자 골격도 개발되었습니다.

그 중 하나가 슈도펩타이드 유도체 FAP-2286입니다. 그것은 1,3,5-벤젠트리메탄티올 부분16에 의해 고리화되고 DOTA 킬레이터에 연결된 7-아미노산 서열을 포함합니다. 인간을 대상으로 한 초기 연구에서는 [68Ga]Ga-FAP-2286이 [68Ga]Ga-FAPI-46과 유사한 생체 분포 프로파일을 나타내며 간, 신장 및 심장에서 약간 더 높은 생리적 흡수를 보임이 입증되었습니다17. 본 연구에서는 주로 목, 간, 위암, 췌장암, 난소암, 식도암을 앓고 있는 64명의 환자를 대상으로 암 병기 결정 또는 재발 감지를 위해 [68Ga]Ga-FAP-2286으로 PET 이미징을 진행했으며, 원발성 종양, 림프절 전이 및 원격 전이에서 [68Ga]Ga-FAP-2286의 흡수율이 [18F]FDG보다 현저히 높아 이미지 대비 및 병변 검출 가능성이 향상되었습니다. 모든 원발성 종양은 [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT에서 볼 수 있었지만, [18F]FDG PET/CT는 병변의 거의 20%를 놓쳤다. 침범된 림프절의 경우, [68Ga]Ga-FAP-2286과 뼈 및 내장 전이에서 검출률이 더 높았습니다. 다양한 암 질환을 앓고 있는 21명의 환자로 구성된 소규모 그룹을 대상으로 한 또 다른 연구에서도 이 이미징 에이전트의 우수한 민감도를 입증했으며, 이는 [68Ga]Ga-FAP-228618의 진단 효율성을 반영합니다. 보다 구체적인 연구는 요로상피암 또는 폐암과 같은 단일 유형의 암에 초점을 맞추었으며, 임상 분자 이미징에 대한 [68Ga]Ga-FAP-2286의 높은 잠재력을 다시 한 번 강조했습니다 4,5. 치료와 관련하여, 예비 연구에서는 다양한 진행성 전이성 암을 앓고 있는 환자 11명을 대상으로 루테튬-177(β-emitter, t1/2 = 6.7 d)로 방사성 표지된 FAP-2286의 사용을 조사했다19. 대부분의 환자는 8주 간격으로 두 번의 치료 주기를 받았으며, 주기당 평균 투여 용량은 [177Lu]Lu-FAP-2286의 5.8 ± 2.0 GBq였습니다. 이 약물은 뼈 전이에서 약 44시간의 효과적인 반감기와 함께 연장된 종양 내 저류를 입증했습니다. 수용 가능한 부작용을 감안할 때, 이러한 결과는 더 큰 규모의 임상시험을 위한 길을 열었습니다: [177Lu]Lu-FAP-2286의 안전성과 효능은 현재 Novartis (NCT04939610)7,8의 후원으로 1/2상 LuMIERE 임상시험에서 평가되고 있습니다. 더 작은 규모의 연구 프로토콜이 문헌에 문서화되어 있으며, 9,20 및 여러 사례 보고서가 발표되었습니다 21,22,23,24,25,26,이 TRT의 효능과 우수한 내약성을 입증합니다.

FAP-2286에 대한 최소한의 구조 수정으로 최적화된 아날로그 3BP-3940(그림 1)27이 구현되었습니다. 이 벡터 분자에 대한 과학 문헌은 여전히 제한적이지만, 이미징 및 치료 응용 분야 모두에 대한 초기 연구가 수행되었습니다. 예비 보고서에서는 다양한 말기 전이성 암종을 앓고 있는 18명의 환자에게 [68Ga]Ga-3BP-3940을 사용한 사례를 설명하고, 이 방사성 의약품이 우수한 종양 대 배경 비율과 매우 낮은 신장 흡수를 강조하면서 적합한 PET 이미징 에이전트라고 결론지었다28. 또 다른 연구에서는 간 전이가 있는 췌장암 환자 한 명이 PET 이미징을 위해 150MBq의 [68Ga]Ga-3BP-3940을 투여받았는데, 이는 원발성 종양과 전이성 병변에서 강렬한 흡수를 보여주었다29. 이후 동일한 환자는 TRT에 대해 9.7GBq의 [177Lu]Lu-3BP-3940을 1회 투여받았습니다. 치료는 내약성이 좋았으며, 활력 징후나 생물학적 매개변수에 큰 변화가 없었다. 다른 연구에서는 3BP-3940을 사용한 테라노스틱 접근법의 초기 인간 결과를 제시했다: 환자를 [68Ga]Ga-3BP-3940 PET 이미징으로 선정한 다음 다른 동위원소(177Lu, 90Y 또는 225Ac)로 표지된 3BP-3940을 1-5회의 치료 주기로 단독 또는 탠덤 조합(예: 177Lu + 225Ac)으로 투여했다30. 결과에는 1건의 완전 관해, 4건의 부분 관해, 3건의 안정 질환 및 12건의 질병 진행이 포함되었습니다. 코호트의 (n = 28) 전체 생존 중앙값은 TRT 시작 후 9개월이었다.

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그림 1 : [68Ga] Ga-3BP-3940의 화학 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FAP-2286 및 3BP-3940과 같은 실험용 방사성 의약품에 대한 68Ga 방사성 표지 공정에는 일반적으로 준비 단계를 자동화하기 위한 합성 모듈이 포함됩니다. 특히, 분석법 자동화는 공정 견고성 및 GMP 준수를 보장하고 수동 준비 방법 31,32,33과 비교하여 작업자 방사선 노출을 최소화합니다. 많은 경우, 이러한 프로토콜은 해당 실험용 방사성 의약품을 제조하기 위해 센터를 승인하기 전에 규제 당국에 의해 임상시험용 의약품 서류(IMPD)의 일부로 기대됩니다34. 현재까지 항-FAP 슈도펩티드의 자동화된 68Ga 방사성 표지에 대한 자세한 정보는 문헌 29,35,36,37,38에서 확인할 수 있습니다. 더욱이, 보고된 데이터는 일반적으로 주어진 신시사이저 모델에만 적용된다. 사용되는 68Ga 발생기의 유형은 다양한 상업적으로 이용 가능한 솔루션이 HCl(보통 0.1 M)에서 68Ga3+ 용리액의 특정 부피를 특징으로 하기 때문에 특정 특이성을 가져올 수 있으며, 이는 자동화된 방사성 표지 조건에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다.

이러한 맥락에서 GAIA V2 합성 모듈을 사용하여 68Ga의 슈도펩타이드 3BP-3940의 빠르고 효율적인 자동 방사성 표지를 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 합성기는 유체 흐름을 제어하기 위해 연동 펌프에 연결된 각각 5개의 매니폴드로 구성된 3개의 램프로 구성된 튜빙 세트의 사용에 의존합니다. 또한 반응 매체 가열을 위한 바이알 오븐, 여러 방사능 프로브 및 시스템 내에서 이러한 매개변수를 모니터링하기 위한 압력 센서를 갖추고 있습니다. 다른 모델만큼 널리 보급되어 있지는 않지만이 자동화 장치는 우리 센터에서 일상적으로 사용되며 점점 더 많은 시설 31,39,40,41,42,43,44에 설치되고 있습니다. GALLIAD 68Ge/68Ga 발생기는 68Ga 용리액의 사전 정제 없이 이 작업에 사용되었습니다. 이 방법은 [68Ga]Ga-3BP-3940 생산을 위한 견고하고 빠르며 편리한 솔루션을 제공하도록 설계되었으며, 방사선 라벨링 중 작업자의 방사선 보호를 최적화합니다. 이것은 또한 이 특정 합성기 모델에 대해 보고된 이 방사성 의약품에 대한 첫 번째 준비 프로토콜이며 매우 자세합니다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜은 방사성 동위원소 작업을 포함합니다. 이 절차를 수행하는 사람은 밀봉되지 않은 방사성 물질을 취급하는 방법에 대해 적절한 교육을 받아야 하며 해당 기관의 방사선 안전 책임자의 승인을 받아야 합니다. 자동 합성기는 지정된 차폐 핫 셀에 배치해야 합니다. 방사성 물질과 관련된 모든 수동 절차는 차폐된 핫 셀 또는 적절한 방사선 차폐 뒤에서 수행해야 합니다.

1. 시약의 준비

참고 : [68Ga] Ga-3BP-3940 ( 재료 표 참조)의 자동 생산에 필요한 시약은 방사성 의약품 준비 장치 (GMP 등급 C 클린 룸)에서 준비되었습니다. 시약은 어떤 순서로든 준비할 수 있으며 합성 2시간 전까지 준비할 수 있습니다.

  1. 완충 용액 (아세트산 나트륨 0.8 M)의 제조
    1. 다음 원료를 획득하십시오 : 아세트산 나트륨 삼수화물 EMPROV API Ph Eur, BP, JP, USP, FCC, E262.
    2. 올바르게 식별된 멸균 용기(예: 마이크로 원심분리기 튜브, 5mL)에서 정밀 저울을 사용하여 544.32mg에 가까운 아세트산 나트륨 트리하이드레이트의 정확한 질량을 칭량합니다.
    3. 보정된 마이크로피펫과 멸균 콘을 사용하여 WFI가 아래 설명된 대로 되도록 5mL에 가까운 주입수(WFI)의 부피에 아세트산나트륨을 용해합니다.
      WFI 부피 = (계량 버퍼 질량 x 5)/544.32
    4. 용액을 와류로 가열하고 초음파 수조(40kHz, ~1분)를 통해 실행하여 가용화를 촉진합니다.
    5. 21G 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 완충 용액을 빼냅니다. 주사기와 새 바늘 사이에 0.22μm 필터를 설치한 다음 격막을 소독한 후 적절하게 식별된 멸균 밀봉 바이알(예: TC-ELU 5)에 완충 용액을 직접 여과합니다.
  2. 방사선 분해 방지 화합물 용액(메티오닌 10mg/mL)의 제조
    1. 다음 원료를 획득하십시오 : L-메티오닌 (Ph. Eur., USP) 순수, 제약 등급.
    2. 올바르게 식별된 멸균 용기(예: 마이크로 원심분리 튜브 5mL)에서 정밀 저울을 사용하여 50mg에 가까운 L-메티오닌의 정확한 질량을 칭량합니다.
    3. 보정된 마이크로피펫과 멸균 콘을 사용하여 WFI가 아래와 같이 되도록 5mL에 가까운 WFI 부피에 L-메티오닌을 용해시킵니다.
      WFI 부피 = (계량된 버퍼 질량 x 5)/50
    4. 용액을 와류로 가열하고 초음파 수조(40kHz, ~1분)를 통해 실행하여 가용화를 촉진합니다.
    5. 21G 바늘이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 메티오닌 용액을 빼냅니다. 주사기와 새 바늘 사이에 0.22μm 필터를 설치한 다음 격막을 소독한 후 적절하게 식별된 멸균 밀봉 바이알(예: TC-ELU 5, Curium)에 용액을 직접 여과합니다.

2. 품질 관리를 위한 장비의 준비

  1. 최종 제품의 pH 제어
    1. 적절한 보호막 뒤에 최종 제품의 후속 검사를 위해 pH 종이 스트립을 배치합니다.
  2. radio-TLC에 의한 방사성 화학적 순도 제어
    1. 적절한 이동상을 포함하는 두 개의 TLC 마이그레이션 탱크를 준비합니다. 이동상 A: 물에서 구연산염 완충액 0.1M pH 4, [68Ga]Ga-3BP-3940에 대해 예상 Rf = 0-0.2 및 자유 68Ga3+에 대해 Rf = 0.8-1. 이동상 B: 물과 메탄올(v/v)의 1:1 혼합물에서 암모늄 아세테이트 완충액 1M, [68Ga]갈륨 콜로이드에 대해 예상 Rf = 0-0.2 및 [68Ga]Ga-3BP-3940에 대해 Rf = 0.8-1.
    2. 적절한 보호 실드 뒤에 두 개의 TLC 마이그레이션 탱크를 두 개의 iTLC-SG 플레이트 옆에 배치하여 최종 제품의 RCP를 후속 제어할 수 있습니다.
    3. 방사선 크로마토그래프를 켜고 작동 컴퓨터에서 관련 수집 소프트웨어를 엽니다. 수행할 첫 번째 분석에 대한 식별 정보를 미리 입력합니다.
  3. 방사성 HPLC에 의한 방사성 화학적 순도 제어
    1. 해석에 필요한 컬럼 모델(C18 ACE Equivalence)이 시스템에 설치되어 있는지 확인합니다.
    2. HPLC에 대한 새로운 이동상, 즉 HPLC + 0.1% TFA(용매 A) 및 아세토니트릴 + 0.1% TFA(용매 B)에 대한 물을 준비합니다. 용매 A와 용매 B 병을 radio-HPLC의 해당 라인에 연결합니다.
    3. 운영 컴퓨터를 켜고 제어 소프트웨어에 연결합니다.
    4. 필요한 경우 펌프 모듈의 퍼지 밸브를 열고 해석에 사용할 라인(즉, 라인 A 및 라인 B)을 퍼지합니다. 이 작업 후에 퍼지 밸브를 닫으십시오.
    5. 시스템이 그래디언트 시작과 동일한 용매의 비율(즉, 95% A/5% B)과 0.6mL/분 동안 최소 20분 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. [68Ga] Ga-3BP-3940 HPLC 분석 시퀀스의 경우, 0.6 mL / 분으로 유지되는 유속을 사용하고 다음과 같이 물 (A)의 0.1 % TFA에서 아세토 니트릴 (B)의 0.1 % TFA까지 이동상 구배를 프로그래밍합니다 : 0 - 1 min 95/5 A / B; 95/5 A/B에서 60/40 A/B까지 1 - 8분 선형 그라디언트; 8 - 9 분 60/40 A/B; 60/40 A/B에서 95/5 A/B까지 9 - 10 분 선형 그라디언트; 10 - 12 분 95/5 A/B
    6. 2.3.5.단계에서 설명한 이동상 구배를 사용하여 분석 방법을 선택한 다음 수행할 첫 번째 분석에 대한 식별 정보를 미리 입력합니다.
    7. 차폐된 용기에서 유리 인서트가 있는 HPLC 바이알을 준비하여 분석할 샘플을 수용하고 적절한 보호 실드 뒤에 배치합니다.

3. 합성 모듈 준비

  1. 차폐된 셀의 전원과 조명을 켭니다. 신디사이저를 제어하는 랩톱을 켜고 모듈 소프트웨어에 로그온합니다.
  2. 필요한 경우 신디사이저에서 기존 키트를 제거하고 폐기물을 적절한 용기에 버리십시오.
  3. 합성 모듈을 수용하는 차폐 캐비닛 내부와 합성기 자체를 해당 위생 기준에 따라 청소하십시오.
  4. 신디사이저 소프트웨어에서 사용자를 누른 다음 사용자 이름을 선택하고 팝업 창에 관련 암호를 입력합니다. 방법을 누르고 [68Ga]Ga-3BP-3940 합성을 위해 이전에 구성된 자동 프로토콜을 선택합니다.
  5. Preparation을 누르고 synthesis title, vector batch number, reagent kit batch number 및 설명을 해당 텍스트 상자에 입력합니다. 이 단계에서 다양한 키트 준비 단계가 포함된 체크리스트를 설정하고 따를 수도 있습니다(보충 그림 1).

4. 합성 카세트 및 카세트 설치 준비

  1. 방사선 약국 실험실 작업대를 물티슈와 적절한 세제 소독제로 청소하고 작업대 위에 멸균 드레이프를 놓습니다.
  2. 멸균 [68Ga]Ga 라벨링 카세트(참조 RT-01-H)와 시약 키트(보충 그림 2)를 구합니다. 튜빙 세트의 3개 램프는 모듈에서 왼쪽에서 오른쪽으로 A, B 및 C로 식별됩니다. 각 경사로의 매니폴드는 위에서 아래로(경사로 A 및 C) 또는 왼쪽에서 오른쪽으로(경사로 B) 1에서 5까지 번호가 매겨집니다.
  3. 아래 단계에 따라 카세트를 조립합니다.
    1. [68Ga]Ga 카세트 봉투의 포장을 풀고 손상 여부를 확인한 다음 카세트의 각 Luer 연결을 조입니다. 모든 스파이크 캡을 제거합니다.
    2. 5mL Luer Lock 주사기와 21G 바늘을 사용하여 시약 키트에서 절대 에탄올 5mL를 추출하고 C18 카트리지에 매우 천천히 통과시킨 다음 WFI(키트에 제공되지 않음)를 추출하고 동일한 C18 카트리지에 매우 천천히 통과시켜 프리컨디셔닝합니다.
    3. 위치 amp 합성 모듈에 설정된 튜브의 A를 선택하고 두 개의 래치를 돌려 램프를 제자리에 고정합니다. 수직 A1 튜브의 다른 쪽 끝을 19G 바늘에 연결하고 폐기물 바이알에 삽입합니다.
    4. 폐기물 바이알에 환기 바늘을 추가하고 배출 바이알을 받을 차폐 용기 뒤에 최적으로 뒤쪽으로 배치합니다. 0.22μm 필터를 A4 위치에 놓습니다.
    5. 수평 A1 튜브를 모듈 전면 패널의 왼쪽 하단에 있는 압력 센서에 연결합니다.
    6. 수/수 어댑터를 사용하여 30 μ 단자 필터와 80mm 20G 바늘로 끝나는 수평 A5 위치에 연결합니다.
    7. 위에서 언급한 20G 바늘을 밀봉된 멸균 배출 바이알(예: TC-ELU 5)에 삽입하고 폭기 바늘을 추가한 다음 배출 바이알을 차폐된 용기에 넣습니다.
    8. 수직 A1을 수직 C1에 연결하는 튜빙 라인을 램프 B 위의 고정 고리 뒤에 놓습니다.
    9. 위치 A2에 이미 장착된 어댑터를 사용하여 수평 매니폴드 A1 및 B1을 짧은 연장선(키트에 포함되지 않았거나 처음에 위치 C5 수평 라인에 연결된 라인)으로 연결합니다.
    10. 위치 amp 합성 모듈의 B를 클릭하고 두 개의 래치를 돌려 r을 고정합니다.amp 제자리에 있습니다.
    11. 수평B18 밸브를 왼쪽의 C2에 연결하는 어댑터를 유지하면서 사전 컨디셔닝된 C 2 카트리지를 수평 C2 위치에 연결합니다.
    12. 위치 amp C를 합성 모듈에서 하고 두 개의 래치를 돌려 r을 고정합니다.amp 제자리에 있습니다.
    13. 수/수 어댑터를 사용하여 수평 C50에서 GALLIAD 50Ga 발전기까지 58cm 연장선을 연결합니다.
    14. 튜빙 세트의 스테인드글라스 반응 바이알을 모듈의 오븐에 넣습니다. 연동 펌프에 수직 A5에서 수직 C5까지 튜브를 조심스럽게 배치하고 펌프를 닫고 튜브가 올바른 위치에 있는지 확인한 다음 펌프 왼쪽에 있는 활동 센서를 통해 튜브를 통과시킵니다.
  4. 중간 검사를 수행하여 그림 2와 같이 카세트와 튜브가 아직 시약 없이 방사성 합성기에 조립되어 있는지 확인합니다.

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그림 2: 합성 모듈 구성. (A) 합성 모듈에서 [68Ga]Ga-3BP-3940의 자동 합성을 위한 설정. (B) GAIA 합성 모듈을 사용하여 [68Ga]Ga-3BP-3940의 자동 생산을 위한 시약 위치에 대한 세부 정보. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 시약 설치

  1. 일단 ramps가 모듈에 설치되면 아래 설명된 대로 시약을 설치합니다.
    1. Spike 어댑터를 사용하여 시약 키트의 WFI 250 mL 백을 C4 튜빙에 연결하고 백을 모듈 오른쪽의 전용 고리에 걸어둡니다.
    2. 20G 바늘이 장착된 3mL 3피스 Luer Lock 주사기를 사용하여 미리 준비한 L-메티오닌 10mg/mL 용액 1.5mL를 빼내고 주사기를 수평 C1 튜브에 연결한 다음 모듈 오른쪽의 전용 슬롯에 주사기를 걸어둡니다. 완전한 액체 전달을 보장하기 위해 액체 표면과 주사기 플런저 씰 사이에 약 2mL의 공기를 남겨 두십시오.
    3. 20G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 이전에 준비한 10mg/mL L-메티오닌 용액 750μL를 빼내고 격막 소독 후 시약 키트에서 0.9% NaCl 바이알(파란색 크림프)에 주입합니다.
    4. 20G 바늘이 있는 10mL 3피스 Luer Lock 주사기를 사용하여 0.9% NaCl + L-메티오닌 바이알(파란색 크림프)의 내용물을 빼내고 8.6mL로 조정한 다음 B4 위치의 스파이크를 제거한 다음 대신 B4에 주사기를 연결합니다. 완전한 액체 전달을 보장하기 위해 액체 표면과 주사기 플런저 씰 사이에 약 2mL의 공기를 남겨 두십시오.
    5. 20G 바늘이 있는 3mL 3피스 Luer Lock 주사기를 사용하여 격막 소독 후 60% 에탄올 바이알(주황색 크림프)의 내용물을 빼냅니다. 부피가 1.5mL 이상인지 확인하고 B5 위치에서 스파이크를 제거한 다음 대신 주사기를 B5에 연결합니다. 완전한 액체 전달을 보장하기 위해 액체 표면과 주사기 플런저 씰 사이에 약 2mL의 공기를 남겨 두십시오.
    6. 20G 바늘이 있는 저데드 볼륨 1mL 주사기를 사용하여 미리 제조한 0.8M 아세트산 나트륨 완충 용액 0.25mL를 빼내고 3BP-3940 30μg이 들어 있는 바이알에 주입하여 연속 주입/재흡인 주기로 가용화합니다. 0.25mL 용액을 동일한 주사기에 빼내고 바늘을 분리한 다음 버퍼 + 벡터 주사기를 B3에 놓습니다. 완전한 액체 전달을 보장하기 위해 액체 표면과 주사기 플런저 사이에 약 0.25mL의 공기를 남겨 두십시오.
  2. 아래 설명된 대로 합성을 시작하기 전에 최종 검사를 수행합니다.
    1. 그림 3과 같이 모든 시약이 카세트 또는 튜브에 연결되어 있는지 확인합니다.
    2. 각 키트의 연결이 충분히 조여져 있는지 확인하십시오. 튜브가 끼이거나 기울어지지 않았는지 확인하십시오.
  3. 시스템이 준비되었습니다. 전면 패널을 닫고 차폐 셀의 환기를 켭니다.

figure-protocol-2
그림 3: 키트 설정 68Ga로 3BP-3940의 방사성 표지를 위한 신디사이저에 튜빙 세트와 시약의 최종 설치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. [68Ga] Ga-3BP-3940 생산을위한 자동 방사성 라벨링 시퀀스

  1. 모든 시약이 램프에 배치되고 모든 정보가 소프트웨어에 올바르게 기록되면 Run Synthesis(합성 실행 )를 클릭합니다.
  2. 합성 시퀀스 전반에 걸쳐 튜빙 세트에서 방사능 분포의 일반적인 프로파일은 다음과 같습니다. 그림 4. 준비를 위한 자동화된 방법의 연속 단계를 따릅니다. [68Ga]Ga-3BP-3940을 아래와 같이 설명한다.
    1. 키트 무결성 테스트: 튜브를 폐기물 바이알 쪽으로 잠시 퍼지한 후(기본적으로 C18 카트리지에 남아 있는 액체를 제거하기 위해) 시스템은 A4를 열고 연동 펌프를 통해 여과된 공기를 펌핑하여 내부 압력을 높입니다. A1에 연결된 압력 센서가 1500mbar> 튜빙 압력을 감지하는 즉시 시스템이 닫히고 연동 펌프가 멈춥니다. 압력 강하가 15초 동안 400mbar를 초과하지 않으면 키트의 무결성 테스트를 성공적인 것으로 평가하고 합성을 시작합니다. 테스트에 실패하면 시스템 누수를 의심하고 합성 시퀀스를 중단합니다.
    2. 반응 바이알에 벡터 추가: 완충 용액에 용해된 3BP-3940이 매니폴드 B2를 통해 약 30초 내에 반응 바이알로 유입되는지 확인합니다.
    3. 반응 바이알에 L-메티오닌 첨가: C1의 주사기에 포함된 메티오닌 용액이 매니폴드 B2를 통해 반응 바이알로 전달되고, C를 내려간 다음 A를 상향 램프하여 매니폴드 A2에 의해 램프 B에서 분기됩니다.
    4. WFI를 사용한 C18 카트리지 활성화: C4의 백에 포함된 WFI가 C18 카트리지를 통과하도록 하고 벡터 및 메티오닌 용액이 뒤따르는 경로에서 램프 A, B 및 C를 헹굽니다. 그런 다음 다음 후속 단계를 위해 튜브에 물이 남아 있지 않도록 동일한 경로를 여과된 공기로 세척합니다.
    5. 반응 바이알의 발생기 용리(수동 개입): GALLIAD 발생기를 용리시키려면 10-20초 동안 기다리기 전에 발생기 상단의 녹색 손잡이를 로딩 위치로 90° 돌립니다: 이 시간을 통해 발생기는 1.1mL의 고정 용출액 부피를 준비할 수 있습니다. 녹색 손잡이를 초기 위치로 되돌리고 제어 소프트웨어에서 프롬프터를 클릭합니다. 그런 다음 연동 펌프는 3분 동안 68Ga용리액을 반응 바이알로 끌어옵니다. 이 시간 간격 동안 반응 바이알의 온도는 1분에 걸쳐 60°C로 점진적으로 상승한 다음 2분에 걸쳐 90°C로 점진적으로 상승하여 방사성 표지 단계의 설정 온도에 더 빨리 도달합니다.
    6. 방사성 라벨링: 방사성 라벨링 단계 시작 시 120°C의 설정 온도가 30초 동안 적용되어 빠르고 효율적인 가열이 가능한지 확인합니다. 그런 다음 설정 온도가 98분 동안 2°C로 조정되었는지 확인합니다. 반응 바이알의 가열 및 압력 상승으로 인해 일부 반응 매체는 B2에 연결된 튜브로 역류하는 경향이 있습니다. 이를 제한하기 위해 10분 가열 후 2초 라인 퍼지가 설정됩니다. 그런 다음 방사선 라벨링이 약 5.5분 동안 계속됩니다.
    7. C18 카트리지에 트랩핑: 여과된 공기가 C3에 의해 반응 용기로 펌핑되는지 확인합니다. 액체 표면에 가해지는 압력은 반응 매체가 B2에 연결된 튜브를 통해 위쪽으로 흐른 다음 SPE 카트리지로 흐르도록 합니다. 그런 다음 반응 바이알을 C4의 백에서 WFI로 헹구고 이 헹굼 액체를 동일한 방식으로 SPE 카트리지로 옮깁니다. 카트리지는 결국 새 WFI로 헹구고 여과된 공기로 플러시합니다.
    8. C18 카트리지 및 제형의 용리(NaCl 0.9% + L-메티오닌 첨가): SPE 카트리지는 초기에 방사성 표지된 제품과 갈륨 콜로이드를 유지하고 자유 68Ga3+ 가 통과할 수 있도록 합니다. 카트리지를 용리하고 말단 바이알에서 [68Ga]Ga-3BP-3940을 회수하려면 NaCl 0.9%(각각 3x 0.5mL)의 에탄올 60% 및 메티오닌 ~0.9mg/mL의 연속 분획을 용출을 위해 카트리지 위로 끌어옵니다. 그런 다음 B4에서 주사기의 전체 내용물을 제형 단계에서 C18 카트리지를 통과하여 단자 바이알에서 <10%의 최종 에탄올 농도를 달성합니다.
    9. 필터 무결성 테스트(수동 개입): 단자 바이알을 합성 및 제거한 후 버블 포인트 테스트를 사용하여 단자 필터의 무결성을 확인하기 위해 단자 필터를 폐바이알에 연결하고 폐바이알에서 환기 필터를 제거하라는 프롬프트에 따릅니다. 버블 포인트 테스트 중에 필터는 처음에 30초 동안 WFI에 의해 습윤됩니다. 라인을 제거한 후 시스템의 압력은 <2분 동안 최대 >2500mbar까지 천천히 증가하며, 이 동안 신디사이저는 필터 배출구에 압력 증가가 없는지 확인합니다. 그런 다음 시스템은 기포 지점을 확인하기 위해 압력을 천천히 높입니다. 신디사이저는 버블 포인트 압력을 결정하기 위해 필터 배출구의 압력이 증가할 때 최종적으로 압력을 기록합니다.
  3. 합성이 끝나면 자동화 소프트웨어는 방사성 표지 과정을 설명하고 반응 바이알의 온도, 시스템의 압력 및 관련된 방사능의 양을 추적하는 합성 보고서를 생성합니다(그림 4). 보완책으로, 다음 공식에 따라 감쇠 보정된 방사성 화학 수율(RCY)을 수동으로 계산합니다.
    RCY = figure-protocol-3
    잔류 활성은 반응 바이알, C18 카트리지 및 합성 종료 시 폐기물 바이알에 남아 있는 활성을 설명합니다.

figure-protocol-4
그림 4: 모듈 내 방사능의 일반적인 분포 프로파일.(A) 반응 바이알; (B) [68Ga]Ga-3BP-3940의 합성 중 C18 카트리지. 반응 바이알로의 68Ga 용출액의 흐름은 6분에 발생합니다. 활성은 방사성 표지 반응 전반에 걸쳐 반응 바이알에 남아 있습니다. 16분 후 활동이 SPE 카트리지로 전송됩니다. 카트리지는 19.5분 후에 용리된 후 약 150MBq의 잔류 활성이 고정상에 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. [68Ga] Ga-3BP-3940의 분배 및 품질 관리

  1. 방사능 측정 및 환자 선량 준비를 위해 터미널 바이알을 적절한 차폐 셀로 옮깁니다.
  2. 적절하게 보정된 용량 교정기로 말단 바이알의 활성을 측정하고 준비물을 컴퓨터에 기록합니다.
  3. 바이알을 올바르게 식별하고 적절한 차폐 용기에 넣습니다. 적절한 무균 기술과 방사선 보호 기술을 사용하여 품질 관리를 위해 터미널 바이알에서 ~0.5mL 샘플을 추출합니다.
    1. 육안 검사로 준비물의 모양을 평가합니다. pH 종이 스트립에 제품 용액 한 방울을 떨어뜨려 제제의 pH를 평가합니다.
    2. 이전에 준비된 두 개의 iTLC-SG 플레이트 각각에 제품 용액 한 방울을 증착하여 radio-TLC에 의한 방사성 화학적 순도를 측정합니다. 그런 다음 플레이트가 해당 이동상으로 이동하고 방사선 크로마토그래프로 판독하도록 합니다. 생성물 신호와 불순물 신호의 곡선 아래 면적을 측정하여 결과 방사선 크로마토그램을 통합한 다음 공식에 따라 방사성 화학적 순도를 계산합니다.
      RCP(%) = 100 - %AUC불순물 1 - %AUC불순물 2
    3. 미리 준비된 HPLC 바이알에 제제의 ~50 μL를 주입하여 방사성 HPLC로 방사성 화학적 순도를 측정합니다(2.3.7 단계 참조). HPLC 자동 시료 주입기의 바이알을 필요한 위치에 놓고 분석 시퀀스를 시작합니다. 샘플이 시스템에 주입되면 자동 샘플러에서 바이알을 제거하고 차폐된 용기에 다시 넣어 방사선 조사를 최소화합니다. 분석이 끝나면 제품 신호와 불순물 신호의 곡선 아래 면적을 측정하여 결과 방사선 크로마토그램을 통합한 다음 공식에 따라 방사성 화학적 순도를 계산합니다.
      RCP(%) = 100 - Σ(%AUC불순물)
    4. 1mL의 WFI가 들어 있는 감마 계수기 튜브에 ~5 μL의 제제를 첨가하여 제제에 포함된 방사성 동위원소의 반감기(감마 계수기)를 확인합니다. 감마 카운터가 있는 튜브를 10회 연속으로 계산합니다(각각 1분 계산). 10번의 측정에서 관찰된 방사성 붕괴를 기반으로 반감기를 계산합니다.
    5. 감마 카운터를 사용하여 감마 분광 분석을 수행하고 소멸 광자에서 511keV 및 1077keV 피크를 찾아 반감기 분석과 동일한 샘플에서 방사성 핵종 식별 분석을 수행합니다.
    6. 이전 샘플의 48시간 붕괴 기간 후 방사성 핵종 순도를 평가합니다. 감마 카운터에서 120분 측정을 수행하여 68Ge돌파 및 기타 긴 반감기 방사성 핵종 불순물로 인해 현장에서 형성된 잔류 68Ga활동을 감지할 수 있습니다.

8. [68Ga] Ga-3BP-3940 제제의 안정성

  1. 시간 경과에 따른 안정성에 대해 3개의 테스트 배치를 평가합니다. 이를 위해 EoS 직후 1시간마다, 그리고 합성 후 최대 4시간까지 말단 바이알에서 약 200μL의 제제를 회수합니다.
  2. 위에서 설명한 절차에 따라 HPLC로 RCP를 측정하기 위해 각 시점에서 방사성-HPLC 분석을 수행합니다. 앞서 설명한 절차에 따라 TLC별로 RCP를 측정하기 위해 각 시점에서 Radio-TLC 분석을 수행합니다.

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결과

GAIA 모듈에서 개발된 합성 공정은 21-22분 내에 3BP-3940의 빠른 68Ga방사성 라벨링을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 0.1M HCl에서 1.1mL의 68Ga용리액을 생성하는 제약 등급 68Ge/68Ga 발생기 GALLIAD와 함께 작동하도록 설계되었습니다. 반응 완충액의 부피 및 몰 농도는 최적의 방사성 표지45에 필요한 3.5와 4 사이의 반응 pH를 얻기 위해 이 산의 양에 따라 미세하게 조정되었습니다. 따라서, 최종 몰 농도가 0.1 M인 아세트산 나트륨이 사용되었다. 메티오닌 10 mg/mL를 가열 단계 동안 벡터 분자의 분해를 제한하기 위해 방사선 분해 방지제로서 반응 매질에 첨가하였다. 말단 정제를 사용하지 않은 예비 테스트에서는 이 항산화제를 겐티식산 16mg/mL 및 아스코르브산 12mg/mL와 비교한 결과, 메티오닌의 최종 RCP가 다른 두 화합물보다 더 우수했습니다(

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토론

이 작업은 GAIA 모듈과 GALLIAD 발생기를 사용하여 [68Ga]Ga-3BP-3940 합성을 위한 GMP 준수 자동 준비 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 임상 PET 이미징을 위해 PSMA 리간드44 및 기타 FAP 억제제43,46과 같은 벡터의 갈륨-68 방사선 표지를 위해 본 센터에서 사용하는 프로토콜에서 약간의 수정을 가하여 조정되었습니다.

생산 공정은 간단하고 직관적으로 설계되었으며 (i) 모든 시약을 반응 바이알로 이동, (ii) 68Ga로 3BP-3940의 방사성 표지, (iii) 제품 정제 및 제형의 세 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다. 중요한 것은 이 자동화된 방법의 가장 큰 강점 중 하나는 3개의 테스트 배치...

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공개 사항

저자는 이 저작물과 관련하여 공개해야 할 실제 또는 인지된 이해 상충을 초래할 수 있는 상업적 파트너십이나 자금 출처를 가지고 있지 않습니다.

감사의 글

저자는 이 원고에 제시된 방사선 표지 반응을 준비하는 데 도움을 준 Yasmine Soualy, Stéphane Renaud 및 Élodie Gaven에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로 필터VWR514-0515완충액 및 항산화 용액 및 최종 방사성 표지 제품의 여과용
HPLC 용 아세토니트릴Sigma Aldrich34851-2.5L방사화학적 순도의 HPLC 제어용
모늄 아세테이트Sigma Aldrich238074TLC 제어용 이동상 중 하나의 제조용
HPLC VWR용 C18 컬럼EQV-3C18-1503방사화학적 순도의 HPLC 제어용
선량 교정기(CRC25)Capintec-최종 제품의 방사능 및 모듈의 다양한 성분 측정 후
구연산염 완충액, pH 4Thermofisher258585000TLC 제어용 이동상
Eppendorf 튜브 5mL BiopurSigma AldrichEP0030119479완충액 및 항산화 용액 제조용
연장선(30cm)Vygon1159.03튜빙 세트에 발전기 연결용
륨-68 발생기IRE Elit-68Ga]염화갈륨의 현장 생성용
감마 계수기(Hidex AMG)Hidex-반감기 및 방사화학적 순도 평가용
HPLC 스테이션시마즈-방사화학적 순도
iTLC-SG 플레이트AgilentSGI0001방사화학적 순도의 TLC 제어용
L-메티오닌AppliChemA1340항산화 용액 준비용
수/수 어댑터Vygon893.00세트에 발전기 연결용
탄올Sigma Aldrich320390-1LTLC 제어용 이동상 중 하나의 준비용
바늘(21G, Sterican)B Braun4657543B방사성 표지 pH
지VWR85409.600의 pH 테스트용
; L (Gilson PIPETMAN)Fisher Scientific12346132-1000정확한 액체 측정 및 이송용
피펫 200 및 마이크로; L (Gilson PIPETMAN)Fisher Scientific12326132-200정확한 액체 측정 및 이송용
피펫 팁, 100-1000 & L찰스 리버D1000IW정확한 액체 측정 및 이송용
피펫 팁, 2-200 & LCharles RiverD200IW정밀 액체 측정 및 이송용
사성 크로마토그래프Elysia-Raytest-방사성 화학 순도의 TLC 제어용
HPLC용 방사선 센서Elysia-Raytest-사성 화학 순도의 HPLC 제어용
시약 키트ABXRT-101에탄올 60%, NaCl 0.9%, WFI 백, C18 카트리지, 0.2 및 마이크로를 제공합니다. 터미널 필터, 폭기 바늘, 터미널 바늘 및 폐기물 바이알
차폐 용기LemerPax방사성 라벨링 제품의 방사선 감쇠용
일회용 플라스틱 주걱Corning3005시약 준비용
아세트산나트륨 삼수화물 EMPROVESigma Aldrich1.28204반응 완충액 준비용
멸균 밀봉 바이알(유리형) 1)큐륨TC-ELU-5완충액, 항산화제 및 방사성 표지 용액의 최종 컨디셔닝용
균 튜브 세트ABXRT-01-H[68Ga]Ga-3BP-3940 관
개용 멸균수Braun0082479ETLC 제어용 이동상 중 하나의 제조용
모듈(GAIA)Elysia-Raytest-[68Ga]Ga-3BP-3940
주사기 자동 합성용 (1 mL, 저사량 용량)B Braun9166017V완충액 컨디셔닝 및 NaCl 0.9% 주사기 내 메티오닌 첨가의 펩타이드용
Becton Dickinson309649NaCl 0.9% 및 컨디셔닝 내 메티오닌
사기 (3 mL)Becton Dickinson309658티오닌 및 에탄올 60% 컨디셔닝용
TLC 마이그레이션 탱크Fisher Scientific50-212-281방사성 순도의 TLC 제어용
Trifluoroacetic acid (HPLC에 적합)Sigma Aldrich302031-100ML방사성 순도의 HPLC 제어용
감마 카운터 용 튜브-반감기 및 방사성 화학 순도 분석 준비 초음파
수조Selecta3000683초음파 처리용 준비된 용액
벡터 분자(3BP-3940)MedChemExpressHY-P10131 방사성 표지할 벡터 분
유리 인서트가 있는 HPLC용 바이알Sigma Aldrich29385-U 및 SU860066방사화학적 순도의 HPLC 제어용
Vortex 믹서VWR444-5900P준비된 용액 교반용
HPLC용 물Sigma Aldrich34877-2.5L-M방사화학적 순도의 HPLC 제어용
사용 물, 10mL 플라스크Aguettan34009 370 641 0 1용액용 준비
암 교정 갈[의 HPLC 제어용 튜브 메 용 방사성 표지 제품 Pipette 1000 & micro 방방 멸 자동 합성용 B 합성 주 메자 주

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