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방법 논문

Cancer-Associated Fibroblasts from Mouse Mammary Tumors as Tools for Molecular and Computational Studies(분자 및 컴퓨터 연구를 위한 도구로서의 마우스 유방 종양에서 유래한 암 관련 섬유아세포)

1.5K 조회수

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DOI:

10.3791/68364

⸱

2025년 7월 3일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 체외/생체 내 기능 분석, 전사체학 및 컴퓨터 분석을 포함하여 쥐 CAF를 배양, 조작 및 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다. 또한, 인간 유방암 종양 컬렉션에서 레이저 캡처 미세 절개 기질 및 상피 구성 요소의 공개적으로 사용 가능한 전사체를 분석하기 위해 개발된 웹 기반 플랫폼에 대해 설명합니다.

초록

유방암(BC)의 성장과 공격성에서 종양 미세환경(TME)의 중요한 역할을 확인하는 강력한 연구 결과가 있습니다. TME의 우세한 세포 구성 요소인 암 관련 섬유아세포(CAF)는 종양 유래 활성화 신호에 반응하여 암 및 기타 기질 세포와의 복잡한 혼선을 통해 TME의 행동에 큰 영향을 미칩니다. 쥐 모델은 내인성 TME의 평가와 syngeneic xenograft 연구를 사용하여 면역 체계 관여의 평가를 가능하게 하기 때문에 BC 진행에서 CAF의 역할의 기저에 있는 메커니즘을 조사하는 데 광범위하게 사용됩니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo 접근법을 모두 사용하여 BC 유래 CAF를 배양하고, 유전자 발현을 조작하고, 종양 유발 기능을 평가하는 일련의 방법을 제시합니다. 또한 CAF 유전자 발현 프로파일링 및 전사체 분석을 위한 프로토콜과 공개적으로 사용 가능한 벌크 RNA-seq 데이터를 사용하여 원발성 종양에서 전사 서명을 추론하기 위한 컴퓨터 절차에 대해 설명합니다. 또한 레이저 캡처 미세 절제 BC 종양에서 기질 및 상피 구성 요소의 전사체를 분석하기 위한 사용자 친화적인 웹 기반 도구를 소개합니다. 궁극적으로 이러한 방법은 CAF-종양 상호 작용을 유도하는 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 새로운 치료 표적을 식별할 수 있는 잠재력을 가질 수 있습니다.

서론

유방암(BC)은 여성에게 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양이며 진단, 치료 결정 및 예후를 안내하는 뚜렷한 분자 프로필을 가진 상당한 분자 이질성을 특징으로 합니다. 종양 미세환경(TME)은 또한 매우 이질적이며 종양 진행, 면역 및 치료 결과에 중요한 역할을 합니다.

암 관련 섬유아세포(CAF)는 TME에서 가장 풍부한 세포 유형이며 종양 발달의 핵심 조절자입니다. 이들은 세포외 기질 침착 및 리모델링, 혈관 신생, 면역 회피 및 약물 내성에 기여합니다 1,2,3,4,5,6. CAF는 세포-세포 간 직접 접촉, 세포외소포체의 방출7, 다양한 용해성 인자의 분비 2,5를 통해 종양 세포에 영향을 미쳐 종양의 성장, 침습 및 치료 저항성을 촉진합니다 8,9,10. 실제로, 기질 관련 유전자 서명은 BC 진행 및 치료 반응에 대한 예측 가치를 가지고 있으며 화학요법에 대한 내성과 관련이 있습니다 11,12,13,14. 그러나 CAF가 매력적인 치료 표적으로 제시되는 상당한 증거에도 불구하고, 이러한 세포를 대상으로 하는 임상시험은 대부분 실패했다15. 한 가지 주요 과제는 CAF가 종양 행동을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 이해가 제한적이라는 것입니다. 최근 단세포 및 공간 전사체 분석의 발전으로 BC 16,17,18,19,20,21에서 CAF의 복잡성에 대한 심층적인 통찰력을 제공하여 특정 기능 프로그램16,22을 가진 별개의 CAF 하위 유형을 식별할 수 있게 하고 복잡성과 가소성을 더욱 강조할 수 있습니다23.

종양유전자 또는 종양억제유전자가 과발현되거나 비활성화된 유전자 조작 마우스 모델(GEMM)은 인간 암을 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다 24,25,26,27. 야생형 마우스에 종양 세포를 이식하는 syngeneic 모델과 비교했을 때,23,28, GEMM은 BC의 다단계 진행과 암세포와 TME 사이의 상호작용을 보다 정확하게 모방한다. 그러나 GEMM에서 CAF의 활동을 조작하는 것은 이질성으로 인해 어려웠으며, 이로 인해 다른 기질 또는 상피 구성 요소에 대한 off-target effect 없이 모든 CAF 아형을 표적으로 삼기가 어렵습니다5. GEMM을 in vitro CAF 조작과 같은 보완적 접근 방식과 결합하면 in vitro 및 in vivo 환경 모두에서 기능 상실 실험을 위한 세포 모델을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 특정 유전자의 기능적 역할을 탐구하기 위한 안정적인 세포 모델을 개발하는 것은 노화의 빠른 시작으로 인해 여전히 어려운 과제입니다.

여기에서는 CAF에서 안정적인 기능 상실 실험을 위한 강력한 플랫폼에 대해 설명하고, 그 다음에는 기능 적 체외 및 생체 내 분석과 엔지니어링된 세포의 전사 프로파일링을 설명합니다. 이 접근법은 유방암에서 CAF 발현 유전자의 기능적 관련성을 해부하기 위한 포괄적인 전략을 제공하며, 기존 방법에 비해 특이성, 재현성 및 적응성 측면에서 장점이 있습니다. 이 접근 방식은 또한 인간 유방 종양에서 레이저로 미세 절개된 기질 및 상피 구획의 전사체를 탐색하기 위한 새로운 웹 기반 도구로 보완되어 종 간 비교를 가능하게 하고 인간 데이터에서 가설 생성을 용이하게 합니다.

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프로토콜

이 연구는 마우스 취급 및 조직 샘플링에 관한 모든 기관 지침을 준수합니다. 모든 절차는 국내 및 국제 법률과 정책에 따라 수행되었습니다. 마우스는 50% 습도에서 22°C에서 12시간 라이트/다크 사이클 하에 특정 병원체가 없는 형질전환 유닛에 수용되었으며 음식과 물을 임의로 제공했습니다. 수술 절차는 절차 중과 수술 후 기간 동안 적절한 마취 및 진통제를 보장하기 위해 기관의 수의학 지침을 따라야 합니다. Table of Materials 는 이 프로토콜에 사용되는 재료, 시약 및 기기에 대한 세부 정보를 제공합니다.

1. 세포 배양

  1. DMEM(HEK293T, CAF 및 불멸 CAF(iCAFs)) 또는 RPMI 배지(4T1)에서 95% 상대 습도의 5% CO2 분위기에서 37°C에서 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신(1% Pen/Strepto)을 보충한 세포를 배양합니다.
    참고: 전체 매체(cDMEM, cRPMI) 구성: 10% 열 비활성화 FBS, 기아 매체(sDMEM, sRPMI) 조성: FBS 없음. 세포의 평균 배가 시간: HEK293T 및 iCAF는 24시간입니다. 4T1 셀은 12h입니다.
  2. 80% confluency에 도달했을 때 1:5 이상의 비율로 passage cell은 아래에 설명된 대로 표현형 표류를 피하기 위해 해동 후 10회 이상 수행하지 않습니다.
    1. 배지를 흡입하고 7mm 접시 측면에 PBS 100mL를 부드럽게 추가합니다. PBS를 흡인하고 트립신-EDTA 1mL를 추가합니다. 37 °C에서 2-3분 동안 배양합니다.
      주의: EDTA는 눈 자극에 대한 카테고리 2 위험 화합물로 등재되어 있습니다. 적절한 PPE를 착용하고 생물학적/흄 후드를 착용하십시오.
    2. 5mL의 cDMEM으로 트립신-EDTA를 비활성화하고, 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리하고, 원뿔형 15mL 튜브에 수집합니다. 290 x g 에서 5분 동안 원심분리기
    3. 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 5mL의 cDMEM에 재현탁합니다. 1:5 분할을 위해 9mL의 cDMEM이 포함된 100mm 접시에 재현탁 세포 1mL를 시딩합니다.
  3. 세포 계수: Neubauer 계수 챔버 측면에 1.2.3단계에서 세포 현탁액 10μL를 로드하고, 큰 사각형의 세포를 계수하고, 얻은 숫자에 1 x 104 를 곱하여 1mL의 세포 현탁액에 포함된 세포 수를 계산합니다.
  4. 냉동 보존: 아래 설명된 대로 100mm 접시(약 3 x10 6 셀)의 50%를 0.5mL의 얼음처럼 차가운 냉동 매체(열 비활성화 FBS의 10% DMSO)에 동결합니다.
    1. 100mm 접시에서 1.2.1 및 1.2.2 단계에 설명된 대로 세포를 트립신화하되, 세포가 1mL의 얼음처럼 차가운 동결 배지에 재현탁되는 것을 제외합니다.
    2. 각 극저온에 0.5mL를 투약하고 -80°C에서 용기에 넣고 약 1°C/분의 냉각 속도를 유지합니다. 각 부분 표본은 100mm 접시에서 해동할 수 있습니다.
  5. 마이코플라스마 오염 검사: 최소 3일 동안 배양된 융합 세포의 성장 배지 1mL를 수집합니다. 95°C에서 20분 동안 끓입니다. 실온(RT)에서 16200 x g 로 5분 동안 회전합니다. PCR 반응 혼합물 45μL에 상등액 5μL를 추가합니다(0.15mM dNTP, 1.5mM MgCl2, 1x 반응 완충액, 1U Taq 중합효소, 0.5μM 프라이머 A 및 B, 표 1 참조). 양성 및 음성 대조군을 포함한 PCR을 수행하고 DNA ladder와 함께 1% Agarose gel에서 PCR 산물을 분리합니다. 마이코플라스마에 오염된 샘플은 600bp 대역을 나타냅니다.

2. CAF와 유선종양의 분리

참고: 이 단계는 직경 5-10mm의 진행된 단계 종양에 최적화되어 있습니다(참조29 참조).

  1. 경추 탈구로 마우스를 희생시킵니다. 최소 125mm의 유방 종양을 분리하십시오3. 종양을 조심스럽게 절제하여 주변 피부, 유방 조직 및 눈에 보이는 괴사 부위를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 얼음 위에 놓인 1.5mL 마이크로튜브에 모읍니다.
  2. 정밀 저울로 종양의 무게를 측정하고 메스로 0.1-0.3g의 입방체 조각을 절제하고 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 새로운 1.5mL 마이크로튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 탈수를 방지하기 위해 조직이 물에 잠겨 있는지 확인하십시오.
  3. 얼음을 탄 직경 60mm 접시로 옮깁니다. 약 1-2mm 조각이 나올 때까지 메스로 PBS 1mL를 잘게 자릅니다.
  4. cDMEM의 종양 0.1g당 5mL와 10μg/mL 콜라겐분해효소를 함유한 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 손상을 방지하기 위해 절단 팁이 있는 P1000 피펫을 사용하여 동일한 배지 1mL로 접시를 헹굽니다. 누출을 방지하기 위해 밀봉 필름으로 캡을 고정하십시오.
  5. 오비탈 쉐이커에서 37°C에서 1시간 동안 수평으로 배양합니다. 50 mL 코니컬 튜브 위에 70 μm 세포 스트레이너를 놓고 10 mL 혈청학 피펫으로 균질액을 옮깁니다. 5mL 주사기 플런저 뒷면을 사용하여 샘플을 분쇄하고 필터를 통해 밀어 넣습니다.
  6. cDMEM(최종 부피 30mL 이하)을 사용하여 스트레이너에서 모든 것을 회수합니다. 129 x g 에서 4°C에서 10분 동안 세포를 회전시키고 상층액을 버립니다.
  7. 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 암모늄-염화-칼륨(ACK) 용해 완충액 3mL를 추가합니다. 튜브를 단단히 닫고 반전으로 혼합합니다. RT에서 오비탈 쉐이커로 5분 동안 배양합니다.
  8. 최종 부피 30mL에 PBS를 첨가하여 RBC 용해를 중지합니다. 129 x g 에서 4°C에서 10분 동안 세포를 회전시키고 상층액을 버립니다.
  9. 1mL의 cDMEM에 세포 펠렛을 재현탁하고 10μL의 메틸렌 블루를 사용하여 1.3단계에서와 같이 생존 가능한 세포를 계수합니다: 살아있는 세포는 염료를 무색 생성물로 환원시키고 염색되지 않는 반면 죽은 세포는 파란색으로 염색됩니다.
  10. 5 x 105 cells/60 mm dish를 cDMEM 5mL에 파종하고, 5% CO2 분위기에서 37°C에서 20분 동안 배양하고, 비부착성 세포를 수집하고, 밤새 다시 플레이팅합니다.
  11. 48시간 또는 72시간 후에 차등 트립신화를 수행합니다. 섬유아세포는 상피세포와 근피세포보다 빨리 분리되기 때문에30, 1.2단계에서 설명한 대로 진행한다. 그러나 현미경으로 세포 분리를 면밀히 모니터링하십시오. 섬유아세포 모양의 세포는 둥글게 되어 분리되는 반면 상피 세포는 부착된 상태로 유지됩니다.
  12. cDMEM을 추가하여 트립신을 비활성화하고 분리된 CAF를 수집하여 5mL의 cDMEM에서 새로운 60mm 접시로 옮깁니다. 3개의 계대에 대해 1차 CAF 1:3(1.2단계 참조)을 사용한 다음 1.4단계에서 설명한 대로 조기 계대 동결 분취액을 준비합니다.

3. 바이러스 형질도입에 의한 불멸화

참고: 다음 단계 중 일부는 레트로바이러스 벡터를 처리하기에 적합한 환경(예: BSL2+)에서 수행해야 합니다. 교육기관 규칙을 확인하십시오.

  1. 재조합 바이러스의 준비
    1. 세포를 HEK293T 배양하고 마이코플라스마 오염을 확인합니다(1단계 참조).
    2. ddH2O에 0.1 mg/mL 폴리-L-라이신 용액 6 mL를 피펫팅하여 100 mm 직경의 접시를 RT에서 5분 동안 코팅한 후 흡입한 다음 후드 아래에서 건조시킵니다(약 10분).
    3. 3.1.2단계에서 폴리-L-라이신 코팅 접시에 있는 10mL의 cDMEM에 3 x 106 HEK293T 세포 (낮은 계대, 마이코플라스마 음성)를 파종합니다(1.3단계 참조).
    4. 다음 날, 0.75mL의 무항생제 트랜스펙션에 최적화된 배지가 들어 있는 튜브 2개를 준비합니다. 그 중 하나에 30μL의 양이온 지질 매개 형질주입 시약(T1)을 추가합니다. 두 번째로, 2μg의 pCL-Ampho(레트로바이러스 패키징 벡터)와 2μg의 레트로바이러스 pBABE-neo largeT cDNA 벡터(T2)를 추가합니다. T2를 T1에 넣고 부드럽게 섞은 다음 10분 동안 배양합니다.
    5. 항생제가 없는 형질주입에 최적화된 배지 + 10% 열 비활성화 FBS로 교체한 후 배지를 세포 전체에 고르게 분포시킵니다. 플레이트를 Biosafety level 2+(BSL-2+) 조직 배양 시설로 이동합니다. 6-12시간 후에 배지를 cDMEM으로 교체하고 24-48시간 동안 세포를 배양합니다.
    6. 0.45μm 주사기 필터를 통해 유사바이러스 입자가 포함된 배지를 여과하고 4°C에서 며칠 동안 보관하거나 -80°C에서 장기 보관합니다.
  2. CAF의 바이러스 형질도입
    1. 2개의 60mm 접시 각각에 7.5 x 105 CAF를 4mL의 cDMEM(1.3단계 참조)에 파종하고 1.1단계와 같이 배양합니다.
    2. 다음 날, 한 접시의 배지를 3.1.6단계(transduced CAFs)의 슈도바이러스 함유 배지 2mL로 교체하고 cDMEM 2mL를 첨가한 다음 24시간 동안 배양합니다. 다른 요리는 손대지 않은 상태로 둡니다(전달되지 않은 CAF).
    3. 다음 날, transduction된 CAF에 대해 3.2.2단계를 반복합니다. 24시간 후 두 접시의 배지를 4mL의 cDMEM으로 교체합니다.
    4. 다시 24시간 후에 두 접시의 배지를 400μg/mL G418이 보충된 cDMEM으로 교체하여 선택을 시작합니다. 형질전환되지 않은 CAF의 대조군 접시에 살아있는 세포가 남아 있지 않을 때까지 G418 함유 배지를 2-3일마다 교체합니다.
      참고: 형질도입되지 않은 세포는 G418에 민감하며 7-10일 이내에 사멸하며, 이는 G418 내성 형질도입 세포만 형질도입된 CAF 조건에서 생존할 수 있음을 나타냅니다. 각 세포 유형에 대해 최적의 항생제 농도를 결정하고 사멸 곡선을 수행해야 합니다(7-10일 동안 50 - 1000 μg/mL G418 농도 범위를 테스트하고 10일 이내에 모든 세포를 사멸하는 용량을 선택합니다).
    5. BSL 시설을 나가기 전에 선택된 형질도입된 세포를 1:3 비율로 2배(1.2단계 참조)로 통과시킵니다. 1.4단계에서와 같이 초기 계대의 동결 보존된 부분 표본을 준비합니다.
    6. 세포가 여러 계대에 대해 노화 표현형을 나타내지 않고 계속 증식하는지 확인하고 표현형 및 기능적 특성화를 진행합니다(4단계 및 6-9단계 참조).

4. 표현형 특성화

참고: 알파 평활근 액틴(α-SMA), 카베올린, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), N-cadherin, 혈소판 유래 성장 인자 베타(PDGFR-β), S100A4 및 비멘틴29 와 같은 CAF 마커는 RT-qPCR 및 웨스턴 블롯으로 평가할 수 있습니다.

  1. RT-qPCR: 참고 문헌15에 설명된 대로 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트의 단상 용액으로 총 RNA를 추출합니다. 반응 조건에 대한 제조업체의 지침에 따라 20 μL의 부피에서 총 RNA 2 μg을 역전사합니다. cDNA를 1:20으로 희석하고 3 μL를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RT-qPCR 반응을 수행합니다(프라이머는 표 1 참조).
    참고: 12웰 접시에서 RNA를 준비하는 것이 좋습니다.
  2. 웨스턴 블롯
    1. 1.2.1단계에 설명된 대로 PBS로 2x 세척하고, 0.2mL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 추가하고, 스크레이퍼로 세포를 분리하고,29에 설명된 대로 1.5mL 마이크로튜브에 수집합니다. 얼음 위에서 20분 동안 그대로 두십시오.
    2. 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 에서 샘플을 회전시키고 상층액을 수집합니다. 제조업체의 지침에 따라 비색 분석으로 단백질을 정량화합니다. 웨스턴 블롯에는 최소 20μg의 단백질을 사용합니다(항체는 표 2 참조).
      참고: 한 접시에 6개 이상의 웰에서 단백질을 준비하는 것이 좋습니다.
  3. 분비된 단백질의 분석
    1. 100mm 직경의 접시에 2 x 106 iCAFs(1.3 단계 참조)를 10 mL의 cDMEM에 파종하고 1.1 단계에 설명된 대로 배양합니다.
    2. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS 10mL로 2x 세척한 다음 10mL의 sDMEM(단계 1.1 참조)으로 48시간 동안 배양하여 컨디셔닝 배지(CM)를 생성합니다.
    3. 다시 48시간 후에 0.2μm 주사기 필터를 통해 CM을 15mL 원추형 튜브에 여과합니다. 주사기와 튜브를 모두 단단히 잡고 약간의 저항에 대비하십시오. CM은 -80 °C에서 최대 6 개월 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 농축 CM(conCM)을 생성하기 위해 제조업체의 지침에 따라 단백질 농축기를 사용하여 CM을 약 10배 농축합니다. conCM을 정량화하고, 끓여서 웨스턴 블롯을 수행합니다(항체는 표 2 참조).

5. 유전자 넉다운 분석

참고: 유전자 발현을 안정적으로 방해하기 위해 특별히 설계된 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 입자로 iCAF를 transduction합니다. 이는 https://www.addgene.org/protocols/plko/#C 에서 사용 가능한 프로토콜에 따라 pLKO.1-Puro와 같은 적절한 렌티바이러스 벡터에서 표적화 염기서열을 클로닝하여 얻을 수 있습니다. 특이적 표적화 염기서열은 공개적으로 사용 가능한 shRNA 설계 도구(예: Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/ 의 GPP-Genetic Perturbation Portal)를 사용하여 선택할 수 있습니다. 대안적으로, 미리 만들어진 표적화 벡터 세트가 상업적으로 이용 가능합니다(https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). 각 유전자에 대해 4-5개의 서로 다른 shRNA를 설계하고 실험에 가장 적합한 2개를 선택하는 것이 좋습니다. 또한 비타겟팅 벡터를 negative control로 생성합니다. 다음 단계 중 일부는 HIV 유래 바이러스(예: BSL2+)를 처리하기에 적합한 환경에서 수행해야 합니다. 교육기관 규칙을 확인합니다.

  1. 렌티바이러스 입자의 생성
    1. 3.1.1-3.1.3 단계와 같이 3 x 106 HEK293T 세포를 시드합니다. 다음 날, 0.75mL의 무항생제 형질주입 최적화 배지에서 각각 9μg 및 3μg의 패키징 벡터 pCMV-R8.74 및 pCMV-VSVG와 7μg의 shRNA 함유 pLKO.1 구축물을 사용하여 3.1.4단계와 같이 양이온 지질 매개 형질주입 시약-DNA 복합체를 준비하고, 3.1.5 및 3.1.6단계에서 설명한 대로 진행합니다.
  2. CAFs 형질전환
    1. 3.2.1, 3.2.2 및 3.2.4단계에 설명된 대로 세포를 감염시킵니다. 24시간 후, 감염 배지를 제거하고 cDMEM에서 2μg/mL 퓨로마이신으로 선택을 시작합니다. 최적의 농도를 결정하기 위해 3.2.5단계의 참고 사항을 참조하십시오.
    2. 48시간 후에 puromycin/cDMEM을 교체하십시오. 선택은 일반적으로 3일 이내에 완료됩니다. 3.2.6단계와 같이 셀을 확장하고 고정합니다. 단계 4.1에 설명된 대로 RT-PCR과 웨스턴 블롯 모두에 의해 넉다운 효율을 평가합니다. 및 4.2.

6. 종양 세포에서 CM을 가진 iCAF의 슈퍼 활성화

참고: 다음 단계는 iCAF의 전종양 활성의 체외 특성화 방법을 보여줍니다. CAF의 전종양 활성은 아래와 같이 마우스 BC 종양 세포(super-activation, s.a.)의 CM과 함께 배양함으로써 강화될 수 있습니다.

  1. 1.3단계에서 설명한 대로 4T1 murine BC cell을 계수하고 10mL의 cRPMI에 100mm 직경의 접시에 2 x 106 개의 세포를 seed합니다(1.1단계 참조).
  2. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS 10mL로 2x 세척한 후 10mL의 sRPMI로 48시간 동안 배양하여 CM을 생성합니다(1.1단계 참조).
  3. 다음 날, 100mm 직경의 접시에 2 x 106 iCAFs를 10mL의 cDMEM(1.3단계 참조)에 파종하고 1.1단계에 설명된 대로 배양합니다. 0.2 단계와 같이 4.3.3 단계와 같이 0.2 μm 주사기 필터를 통해 CM을 15 ml 원추형 튜브로 필터링합니다.
  4. 슈퍼 활성화(s.a.): iCAF 접시에서 배지를 제거하고 PBS 10mL로 2x 세척한 다음 여과된 4T1CM(8-10mL)를 추가합니다. 48시간 동안 배양하여 s.a. iCAF를 얻습니다.

7. 종양 세포 증식

  1. 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3 단계와 같이 준비된 iCAFs CM으로 48시간 동안 4T1 세포를 전처리합니다.
  2. trypsinize하고 계수한 다음 1.3단계에서 설명한 대로 100μL의 cRPMI에 96웰 플레이트의 4 x 103 세포/웰을 시딩하고 1.1단계와 같이 배양합니다. 플레이트 기술 삼중.
    1. 시간 코스의 하루에 96웰 플레이트 1개를 준비합니다. 여기에 제안된 세포의 수는 4일 프로토콜에 최적화되어 있습니다. 더 오랜 시간 동안 축소하십시오.
  3. 4 시간 후 또는 세포가 부착 되 자마자 매체를 제거하고 100 μL를 부드럽게 첨가하여 PBS로 세척하고 멀티 채널 피펫을 사용하고 멸균 저장소를 사용하여 팁을 웰 가장자리에 올려 놓아 세포가 분리되지 않도록주의하십시오. PBS를 제거한 다음 마찬가지로 2% 열 불활성화 FBS가 보충된 100μL의 sDMEM(대조군) 또는 iCAF CM을 추가합니다(4.3.1, 4.3.2, 4.3.3 단계 참조).
  4. 4시간 후 0번 포인트에서 설명한 대로 7.5일 플레이트를 중지합니다. 다른 시점의 경우 실험이 끝날 때까지 격일로 배지를 교체합니다.
  5. 세포 밀도를 평가하려면 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 7.3단계에 설명된 대로 100μL의 PBS로 웰을 2x 세척합니다.
  6. 흄 후드 아래에서 각 웰에 100μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가하고 RT에서 10분 동안 셀을 고정합니다.
    주의 : PFA는 심각한 눈 손상과 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 삼키거나 흡입하면 유해하며 유전적 결함 및 암을 유발하는 것으로 의심됩니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 배기 후드를 다루십시오.
  7. 7.3단계와 같이 100μL의 PBS로 3회 세척하고 흄 후드 아래에서 건조시킵니다(약 10분).
  8. 20% 메탄올 중 0.1% 크리스털 바이올렛 50μL를 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    주의: 크리스탈 바이올렛은 심각한 눈 손상을 일으킬 수 있으며 경구 급성 독성에 대한 범주 4 위험 및 발암 물질로 범주 2 위험으로 보고됩니다. 적절한 PPE를 착용하고 흄 후드에서 처리하십시오.
  9. 100μL의 ddH2O로 3회 세척하고 웰을 비우고 흡수 패드나 종이 타월에 플레이트를 두드려 액체를 완전히 제거합니다.
  10. RT에서 15분 동안 10% 아세트산 100μL에 크리스털렛을 용해시키고 10% 아세트산 100μL를 블랭크로 사용하여 마이크로플레이트 리더에서 600nm 파장의 광학 밀도(O.D.)를 측정합니다. 해당 날짜의 O.D.를 조건별 0으로 정규화합니다.

8. 이주와 침략

  1. 700μL의 DMEM을 피펫으로 24웰 플레이트의 웰에 1% 열 비활성화 FBS, 1% Pen/Strepto를 보충했습니다. 각 웰에 생물학적 활성 매트릭스로 코팅(침습) 또는 코팅되지 않은(마이그레이션) 8μm 공극 트랜스웰 인서트를 배치합니다. 인큐베이터의 플레이트를 37°C에서 평형을 이루는 동안 1.3단계와 같이 4T1 세포를 수집하고 계수합니다.
  2. 트립신-EDTA 대신 5mM EDTA 1mL를 사용하여 4.3.1, 4.3.2 및 4.3.3 단계와 같이 직경 100mm 접시에서 iCAF CM으로 48시간 동안 전처리된 4T1 세포를 분리합니다.
  3. 5mL의 cDMEM을 추가하고, 15mL 원뿔형 튜브에서 세포를 수확하고, 1.2단계와 같이 원심분리하여 펠릿화합니다. sDMEM에서 세포를 재현탁하고, 1.3단계에서와 같이 계수하고, 1 x 105 cells/100 μL로 희석합니다.
  4. 100μL의 세포 현탁액을 트랜스웰의 상부 챔버에 추가합니다. 도금 대조군으로, 500μL의 cDMEM에 24웰 플레이트에 100μL의 세포를 시딩합니다. 16시간(이동) 또는 24시간(침입) 동안 배양하고 아래 설명된 대로 실험을 중지합니다.
    참고: 배양 시간은 다른 세포를 사용하는 경우 경험적으로 결정되어야 합니다.
  5. 윗면의 삽입물에 얇은 마커로 라벨을 붙이고 PBS로 채워진 50mL 원뿔형 튜브에 담가 핀셋을 사용하여 세척합니다. 면봉으로 트랜스웰 내부 부분을 조심스럽게 청소합니다.
  6. 흄 후드 아래에서 RT에서 10분 동안 700μL의 4% PFA로 샘플을 배양합니다(7.6단계 참조).
  7. 700μL의 PBS로 3회 세척하고 후드 아래에서 건조시킵니다(약 10분). RT에서 10분 동안 20% 메탄올에 700μL의 0.1% 크리스탈 바이올로 인서트를 배양합니다(6.10단계 참조).
  8. 핀셋을 사용하여 ddH2O로 채워진 50mL 원추형 튜브에 삽입물을 3번 담그십시오. 면봉으로 트랜스웰 내부 부분을 조심스럽게 청소합니다. RT에 샘플을 보관하고 최대 3일 후까지 사진을 촬영합니다.
  9. 위상차 현미경을 사용하여 10x 대물렌즈로 웰 표면의 대부분을 이미징하여 하나의 사진을 촬영한 다음 20x 대물렌즈로 5개의 독립적인 영역에서 사진을 획득합니다.
  10. 다음과 같이 크리스탈 바이올렛을 10% 아세트산에 용해시키십시오: 웰의 경우 100μL의 아세트산을 첨가하고 RT에서 10분 동안 궤도 셰이커에서 혼합합니다. Transwell의 경우, 벤치에 낮은 표면을 위로 향하게 놓고 표면에 50μL의 아세트산을 침전하고 크리스탈 바이올렛이 완전히 용해될 때까지 피펫팅으로 혼합합니다.
  11. 위 단계에서 50μL의 용해된 물질을 사용하여 96웰 플레이트에서 600nm에서 흡광도를 읽습니다. 10% 아세트산을 블랭크로 사용하십시오.
  12. 8.5단계에서 도금 제어의 광학 밀도(O.D.)를 정규화하고 제어 조건과 관련하여 마이그레이션 또는 침입을 표현합니다.

9. 원발성 종양 성장 및 폐 전이 형성

참고: 다음 단계는 CAF의 전종양 활성의 생체 내 특성화 방법을 보여줍니다. 이 단계는 syngeneic 마우스 모델에서 동시 주입을 통해 CAF의 in vivo pro-tumorigenic feature를 평가하는 데 최적화되어 있습니다. CAF와 4T1 셀은 모두 BALB/c 마우스 배경에서 가져온 것이므로 BALB/c 마우스가 사용됩니다.

  1. 주사 2일 전에 6주 된 암컷 BALB/c 마우스에 금속 ID 귀표를 부착하고 면도기로 4번째 유선 부위를 면도합니다.
  2. 6단계에서 설명한 대로 준비된 4T1 세포와 s.a. iCAF를 수집하고 계수합니다. 15mL 코니컬 튜브에서 최소 20%의 초과분을 고려하여 1 x 105 4T1 세포와 3 x 105 s.a. iCAFs/mouse를 혼합합니다. 4T1은 컨트롤로만 사용합니다.
  3. 290 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고, 50μL에서 위의 세포/마우스 수를 얻기 위해 계산된 PBS 부피에 재현탁하고, 1.5mL 마이크로튜브로 옮기고, 얼음 위에 보관합니다.
    참고: 예를 들어, 10개의 마우스를 주입하려면 1.2 x 106 4T1 세포를 3.6 x 106 s.a. iCAF, 펠렛 세포와 혼합하고 600μL의 PBS에 재현탁합니다. 마우스당 50μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
  4. 층류 후드의 표면을 청소하고 소독하여 작업 영역을 준비합니다. 폼 수술 보드를 벤치 프로텍터 시트로 덮습니다.
  5. 제도적 절차에 따라 한 번에 한 마리씩 마우스를 마취합니다(우리는 틸레타민 베이스/졸라제팜 베이스 + 자일라진 70mg/kg + 5mg/kg의 복강 내 주사 사용). 건조를 방지하기 위해 동물용 연고를 눈에 바르십시오. 화장솜 끝을 사용하여 포비돈 요오드 용액으로 피부를 소독한다.
  6. 발가락 꼬집음 테스트를 사용하여 마우스가 적절한 마취 상태인지 확인하십시오. 피하 주사 바늘로 세포 현탁액 50μL를 4번째 유방 지방 패드에 주입합니다. 유두를 기준으로 하여 동측 다리 쪽으로 약 3mm를 주입합니다.
  7. 주사 후 몇 시간 동안과 다음 날 동안 마우스를 검사하십시오. 종양은 4일 후에 만져질 수 있습니다.
  8. 캘리퍼로 48시간마다 종양 크기를 측정하여 최대 및 최소 직경을 결정합니다. 다음 공식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다: (길이 x 너비2)/2.
  9. 주사 10일 후 아래와 같이 원발성 종양을 외과적으로 제거합니다.
    1. 9.5단계와 같이 수술 부위를 준비합니다. 고압증기멸균으로 도구를 살균하고 작업하는 동안 멸균된 표면에 놓으십시오. 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 동물 간 도구를 살균합니다.
    2. 9.6 및 9.7 단계와 같이 마우스를 마취합니다. 메스 날을 사용하여 종양 가까이에서 5-8mm 절개를 만들고 피부를 부드럽게 당겨 종양에 접근할 수 있는 작은 주머니를 만듭니다. 해부 시 출혈을 피하기 위해 저온 소작 펜으로 눈에 보이는 모든 혈관을 소작하십시오.
    3. 메스를 사용하여 종양을 제거하되 피부를 제거하지 않도록 노력하십시오. 피부 피판을 원래 위치로 다시 놓고 17mm 1/2c 바늘이 있는 5-0 수술실을 사용하여 함께 봉합한 다음 수술용 접착제를 추가하여 상처를 완전히 봉합합니다.
    4. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오. 수술을 받은 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌아갈 수 없습니다.
  10. 수술 후 동물을 면밀히 모니터링하고 다음 날에 기관 프로토콜에 따라 필요한 경우 진통제를 투여합니다. 우리는 Carprofen (3-5 mg / kg)의 피하 주사를 사용합니다.
  11. 2.2단계에서와 같이 정밀 저울을 사용하여 종양의 무게를 측정합니다. 메스를 사용하여 종양을 반으로 자릅니다. 1.5mL 마이크로튜브에 절반을 넣고 액체 질소에서 스냅 동결한 다음 분자 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다. 조직학적 분석을 위해 원뿔형 15mL 튜브에 4% PFA 5mL에 나머지 절반을 4°C에서 24시간 동안 고정합니다.
  12. 주사 후 21일째에 CO2 노출로 마우스를 희생하고 아래와 같이 4% PFA로 기관내 주입 시 폐를 수집합니다. 흄 후드 아래에서 작업하십시오.
    1. 수술용 가위를 사용하여 흉강을 엽니다. 턱밑 부위와 침샘의 피부를 제거하여 기관을 명확하게 노출시킵니다.
    2. 4% PFA 용액이 함유된 22G 바늘 주사기를 준비합니다. 바늘을 쥐 기관에 삽입하여 폐 쪽으로 향하게 하면서 기관을 머리 쪽으로 고정합니다. 폐가 부풀어 오를 때까지 용액을 주입합니다(약 2mL).
    3. 폐를 절개하여 4% PFA 용액이 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집고 4°C에서 24시간 동안 고정합니다.
  13. 폐의 반연속 절편을 수행하고 참고 문헌31에 설명된 대로 표본이 소진될 때까지 50/100μm마다 한 조각씩 Hematoxylin 및 Eosin(H&E)으로 염색합니다.
  14. H&E로 염색된 절편의 현미경 사진에 대한 소프트웨어 안내 분석에 대한 전이 점수를 매깁니다.

10. 유전자 발현 서명

  1. 아래에 설명된 대로 유전자 서명을 정의합니다.
    1. 실험 환경 및 조사된 특정 생물학적 질문에 따라 여러 가지 방법으로 유전자 서명을 얻습니다. 가장 일반적으로, 두 질환(예: CAF와 정상 질환 또는 여러 가지 방법으로 치료됨(예: 과활성화 또는 침묵) 대 미치료) 간의 차등 발현을 평가합니다.
    2. 또는 분석된 샘플에서 가장 다양하게 발현되거나 유익한 유전자를 식별합니다(예: 주성분 분석의 첫 번째 성분에 대한 분산이 높거나 부하가 높은 유전자). 여기서는 STAT3 규제 서명을 예로 사용합니다. 이 서명은 아래에 설명된 바와 같이 BC CAFs29에서 STAT3 침묵 시 하향 조절되는 유전자로 정의되었습니다. RNA 염기서열분석에 대한 자세한 설명은 참고 문헌 32,33을 참조하십시오.
  2. 4.1.1단계에서와 같이 각 샘플에서 총 RNA를 기술적 삼중으로 추출하고 RNA 품질을 평가하여 RNA 무결성을 확인합니다(RIN ≥ 9).
  3. 2μg의 폴리(A) 선택된 RNA에서 라이브러리를 준비하고 염기서열분석을 수행합니다. 우리는 NextSeq 500 플랫폼을 사용했습니다.
  4. Map은 TopHat v2.0을 사용하여 Mus musculus mm9 참조 어셈블리를 읽습니다. 1034.
  5. HTSeq 패키지(http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html)의 htseq-count 도구를 사용하여 유전자 수를 계산합니다.
  6. R 및 DESeq2 패키지(http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html)를 사용하여 미분 발현 분석을 수행합니다. FDR < 0.05로 하향 조절된 유전자를 필터링하여 STAT3 시그니처를 정의합니다.

11. 원발성 종양에서 시그니처 발현 추정

참고: 다음 단계는 공개적으로 사용 가능한 BC 원발성 종양의 전사체 데이터에서 STAT3 조절 시그니처29 의 발현을 전산적으로 추정하여 동일한 샘플 세트에서 추정된 기질 비율과의 관계를 테스트하는 절차를 설명합니다.

  1. R(https://cran.r-project.org/) 및 RStudio(https://posit.co/products/open-source/rstudio/)를 설치합니다. 그것을 시작하고 필요한 라이브러리를 설치하십시오 : GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. https://portal.gdc.cancer.gov/ 의 TCGA 데이터, http://synapse.org/ 의 METABRIC 데이터(syn1757063) 또는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/(Gene Expression Omnibus)의 기타 전사체 데이터와 같은 1차 종양 유전자 발현 데이터를 사전 정규화된 발현 매트릭스로 다운로드합니다. 데이터는 행을 유전자로, 열을 샘플로 사용하는 숫자형 행렬로 형식을 지정해야 하며, 플랫폼에 따라 정규화하고 오프셋 1을 사용하여 로그 스케일링해야 합니다.
    1. https://www.ensembl.org/biomart/martview/ 의 Biomart에서 마우스-인간 유전자 ortholog 목록을 다운로드하고, ensembl genes 데이터베이스를 선택하고, human genes 데이터 세트를 선택한 다음 왼쪽 탭에서 속성 선택을 클릭합니다.
    2. 사전 선택된 기능에서 EXTERNAL 탭을 열고 HGNC 기호에 플래그를 지정하고, 페이지 상단의 상자에서 Homologues 를 선택하고, Mouse orthologues / Mouse gene name에 플래그를 지정합니다.
    3. 왼쪽 상단 모서리에 있는 결과 버튼을 클릭하고 CSV 형식을 선택한 다음 GO 버튼을 클릭하여 파일을 다운로드합니다.
  3. 유전자 발현 서명(유전자 집합)을 R에 불러옵니다. 이 경우, 우리는 쥐 CAF에서 STAT3 침묵에 하향 조절된 유전자 목록을 사용합니다.
  4. R에서 마우스-인간 유전자 ortholog 목록을 로드하고 Biomart 테이블을 통해 STAT3 서명을 해당 human ortholog에 매핑합니다.
  5. 원발성 종양 유전자 발현 데이터를 R에 불러오고, 원발성 종양 데이터 및 STAT3 시그니처를 포함하는 리스트를 포함하여 파라미터가 있는 GSVA 함수를 ssgseaParam 객체로 호출합니다.

12. 유전자 서명의 발현과 임상적 특징 사이의 관계를 시험합니다.

  1. 관심 있는 변수를 식별합니다. 기질 비율(Stromal percentage)은 종양 기질에 속하는 염기서열 분석된 종양 샘플에서 세포의 비율을 나타냅니다. 오믹 데이터와 자주 관련된 다음과 같은 임상 특징을 사용하십시오: 종양 크기, 병기, 진단 시 환자의 연령, 림프절 상태, 전이 상태 등. TCGA에 대해 사전 계산된 기질 백분율 추정치를 사용할 수 있습니다.
    참고: 구체적으로 사용 가능한 기질 추정치는 다음과 같습니다: EDec Immune/Stromal = 기질/면역 비율의 Epigenomic Deconvolution37; 면역 점수 = 141개 면역 유전자의 유전자 발현 프로파일에 기초한 ssGSEA38; LUMP = Leukocytes Unmethylation for Purity, 평균 44개의 비메틸화 면역 특이적 CpG 부위39; 기질 점수 = 141개 기질 유전자의 유전자 발현 프로파일에 기초한 ssGSEA38; IHC = Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40에서 제작한 헤마톡실린 및 에오신 염색 슬라이드의 이미지 분석으로 추정; ABSOLUTE = 체세포 사본 번호 데이터41을 기반으로 합니다.
  2. http://genboree.org/theCommons/documents/569 의 EDEc 데이터, https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html 의 기질 및 면역 점수(RNASeqV2) 및 TCGAbiolinks의 종양 순도 데이터(LUMP, IHC, ABSOLUTE)를 다운로드합니다. 다른 데이터 세트의 경우, GSVA 패키지를 사용하여 기질의 백분율을 계산하고, Yoshihara et al.38에서 얻은 기질 및 면역 서명에 대한 ssGSEA를 계산합니다.
  3. 원발성 종양 샘플에서 추정된 기질 비율의 숫자형 벡터와 STAT3 시그니처 발현의 숫자형 벡터 간의 상관관계를 계산합니다. 이것은 R의 cor.test 함수를 사용하여 달성할 수 있습니다.
  4. 원발성 종양의 전사체 데이터 세트와 관련된 임상 데이터를 샘플이 행에, 임상 특징이 열에 있는 테이블로 다운로드합니다.
  5. R에서 임상 데이터를 로드하고 transcriptomic matrix 및 metadata 테이블의 샘플이 match 함수와 동일한 순서인지 확인합니다.
  6. 숫자형 변수(예: 종양 크기)의 경우, cor.test 함수를 사용하여 원발성 종양 샘플에 대한 STAT3 시그니처 표현식의 숫자형 벡터와 임상 특징 값 벡터 간의 상관관계를 계산합니다.
  7. 범주형 변수(예: 전이 상태)의 경우 비모수 Wilcoxon 순위합 검정(두 샘플 그룹이 독립적이라고 가정)을 사용하여 두 샘플 그룹(예: 전이성 대 비전이성 종양) 간의 STAT3 시그니처 발현의 차이를 테스트합니다. 이것은 R의 wilcox.test 함수를 사용하여 달성할 수 있습니다.

13. 종양 기질에 대한 서명 조절 테스트

참고: 벌크 RNA 염기서열분석을 통해 분석된 원발성 종양에서 기질 서명의 발현은 상세한 임상 주석이 있는 대규모 환자 코호트에 의존할 수 있는 이점이 있습니다. 반면에, 기질과 상피를 분리하는 것만이 정상 조직과 비교했을 때 종양의 두 세포 구획 중 하나에서 유전자 발현 변화를 정의할 수 있다42. MetaLCM은 레이저로 캡처한 미세절부 유방 종양의 전사체 데이터 세트 분석을 용이하게 하는 ShinyApp입니다. 이 도구를 통해 사용자는 레이저 캡처 미세절부 유방 종양의 전사체 데이터 세트에서 두 질환 간에 차등적으로 발현된 강력한 유전자를 검색하고 종양 기질에서 이전에 정의된 유전자 서명의 조절을 테스트할 수 있습니다. 다음 단계에서는 MetaLCM을 사용하는 방법을 설명합니다.

  1. 링크 https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ 에서 앱에 액세스합니다. 해석을 시작하려면 비교된 조건의 피쳐를 선택합니다.
  2. 비교 방향을 선택합니다. 상향 조절된 유전자를 선택함으로써, 조건 1에서 더 높은 발현을 가진 유전자를 보여줍니다.
  3. 차등 표현식에 대한 p-값 임계값을 선택하고 Run 을 눌러 설정이 변경될 때마다 분석을 실행합니다.
  4. 사전 정의된 유전자 목록으로 분석을 제한하려면 쉼표로 구분된 유전자 기호를 입력하거나 단일 열에 유전자 기호가 포함된 CSV 파일을 가져옵니다.
  5. Submit gene list(유전자 목록 제출)를 눌러 유전자 기호를 가져옵니다. Reset을 눌러 모든 유전자를 사용하여 분석을 복원합니다. 차등적으로 발현된 유전자 목록 저장: 유전자 목록이 제공되면 해당 유전자에 대해서만 다중 검사 보정이 수행됩니다. 이 테이블은 평균 logFC, 축소된 p-값, 사용 가능한 각 데이터 세트에서 차등 발현을 위한 개별 logFC 및 p-값으로 구성됩니다.
  6. 차등적으로 발현된 유전자의 접힘 변화를 포함하는 히트맵을 플로팅합니다. 히트맵은 데이터 세트 전반에 걸쳐 완전히 일관된 차등 발현 기호와 함께 차등적으로 발현된 유전자만 보여줍니다.

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결과

CAF의 활동에 대한 체외 평가
유방암(BC)의 공격적인 특징에 대한 유선종양 유래 암 관련 섬유아세포(CAF)의 기여도는 3단계에 따라 생성된 불멸 CAF(iCAF)를 사용하여 연구되었습니다. iCAF는 6단계에서 설명한 대로 초활성화한 다음 sDMEM에서 굶주려 CM을 수집하여 48시간 동안 4T1 세포를 처리하는 데 사용되었습니다(7.1단계 참조). 이 치료 후에는 시험관 내 기능 분석이 이어졌습니다. 그림 1 은 대조군 기아 배지(CTR)에 비해 s.a. iCAFs CM을 사용한 치료로 4T1 세포의 증식이 크게 향상되었음을 보여줍니다. 이러한 증식 증가는 일반적으로 24시간 이내에 시작되어 다음 며칠 동안 계속 증가합니다. 이러한 실험의 경우, CM으로 치료하기 전에 도금된 세포의 수와 배지의 혈청 비율을 모두 최적화하는 것이 중요합니다. s.a. iCAFs CM은 또...

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토론

이 연구에서는 쥐 CAF의 불멸화와 in vitro 및 in vivo 모두에서 종양 유발 촉진 활성의 특성화를 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 마커 발현을 기반으로 특정 CAF subtype을 선택적으로 분리하는 대신, 이질성을 보존하기 위해 전체 세포 집단을 유지하기로 결정했습니다. 세포는 전체적으로 기능적으로 특성화되었으며 유전자 발현 프로파일을 분석하여 다양성을 포착했습니다. CAF를 불멸화하는 것은 1차 CAF가 노화되기 전에 거칠 수 있는 계대 수가 제한되어 있기 때문에 이 연구에서 매우 중요했습니다. 이 접근법을 사용하여 생성된 불멸화된 세포는 CAF가 다양한 치료에 대한 암세포 반응에 어떻게 영향을 미치는지 조사할 수 있기 때문에 화학요법 내성을 포함한 다양한 CAF 매개 현상을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 불멸화된 세포에서 유전자 조작이 용이하기 때문에 기능 연구에 특히 유용합니다. 그러나 불멸화는 세포의 표현형과...

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공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 이탈리아 암 연구 협회(AIRC, IG16930 및 IG24851 to V.P.)의 지원을 받았습니다. 이탈리아 대학 연구부(MIUR PRIN 2017 및 2022에서 VP로); Truus and Gerrit van Riemsdijk 재단, 리히텐슈타인, V.P. 기부; 피에몬테 지역(굴절). A.S.는 이탈리아 암 연구 재단(FIRC)의 박사 후 연구원의 지원을 받았고, L.A.는 Fondazione Umberto Veronesi의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1Kb 플러스 DNA 사다리써모피셔 사이언티픽10787018
24웰 플레이트사르슈테트833922
96웰 플레이트사르슈테트833924
아세트산시그마 알디르치695092
에이지I-HF뉴잉글랜드 바이오랩스R3552-20 > C
베타딘메다 파마23907076
Bü rker 계수 챔버 VWR40443703
소작 저온 FineTip Disp킬러AX10339KL
원심 분리기에펜도르프5810 R
원뿔형 튜브 15mL사르슈테트62554502
원뿔형 튜브 50mL사르슈테트62547254
Cryopure 2 mL 마이크로튜브사르슈테트72380992
크리스탈 바이올렛시그마 알디르치C0775RT에 보관하고 Fume 후드에서 사용 
배양판 직경 100mm 사르슈테트833902
배양 플레이트 직경 60mm 사르슈테트833920
ddH20만든RT에 보관하고 생물학적 후드에서 사용
디지털 캘리퍼스프레시바02-301-2
디지털 현미경라이카DM6B
디메틸 설폭사이드시그마 알디르치D8418생물학적 후드에서 사용
덜베코' s 수정된 독수리' s 중간(DMEM)깁코119650924 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
에코리-HF뉴잉글랜드 바이오랩스R3101-20 > C
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마 알디르치E6758RT에 보관하고 생물학적 후드에서 사용
태아 소 혈청(FBS)깁코160000444 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
필터링된 팁 10 & 마이크로; L사르슈테트703010255
필터링된 팁 100 및 마이크로; L사르슈테트703030255
필터링된 팁 1000 및 마이크로; L사르슈테트703060255
필터링된 팁 20 및 마이크로; L사르슈테트703030265
필터링된 팁 200 & micro; L사르슈테트703031255
필트로푸르 S 플러스 0,20 & 마이크로; m 사르슈테트831826102
필트로푸르 S 플러스 0,45 & 마이크로; m 사르슈테트831826
가는 가위2바이오1406009
집게(Forcep)2바이오1102412
유전적깁코101310354 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
Lipofectamine 2000 형질감염 시약써모피셔 사이언티픽116680194 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
8 & mu의 Matrigel 침입 챔버; m PET 멤브레인 코 닝354480
마이크로플레이트 리더(600nm 흡광도)프로메가GM3500 시리즈
마이크로튜브 1.5mL 사르슈테트7269001
Optimem깁코319850474 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
파라포름알데히드(PFA)시그마 알디르치158127RT에 보관하고 퓨마 후드에서 사용
pBABE-neo 대형 TcDNA 아드진1780-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
pCL-암포노부스 바이오로지컬 18746853-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
pCMV-R8.74아드진22036-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
pCMV-VSVG 아드진8454-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
페니실린-스트렙토마이신(Pen Strepto, 10,000 & mu; g/mL) 깁코151401224 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
위상차 현미경 올림푸스 BX42 시리즈
인산염 완충 식염수  (PBS)만든RT에 보관하고 생물학적 후드에서 사용
pLKO.1-퓨로 아드진10878-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
폴리-L-라이신 용액시그마 알디르치P89204 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
푸로마이신 디하이드로클로라이드  스트렙토미세스 알보니거시그마 알디르치P8833
rCutSmart 버퍼 뉴잉글랜드 바이오랩스B6004-20 > C
설치류 면도기에스쿨랍GT416
로스웰 파크 기념 연구소(RPMI)깁코618700104 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
둥근 팁 갈증 면봉시그마 알디르치Z744127
메스기마27041
Secura 세미 마이크로 저울사토리우스SECURA125-1S
혈청학적 피펫 10mL 사르슈테트861254001
혈청학적 피펫 2mL 사르슈테트861252001
혈청학적 피펫 25 mL 사르슈테트861256001
혈청학적 피펫 5 mL 사르슈테트861253001
스티치 5-0에티콘1866년
주사기 10mL펜타페르테00202250E14
주사기 5mL펜타페르테00202250E12
주사기 옴니칸 인슐린 1mL브라운9151125S
티슈 아데시브3M 베트본드1469SB
Transwell 인서트 8 & 마이크로; m 기공 송골매353097
Transwell Matrigel 인서트 8 & micro; m 기공 코 닝354480
트립신-EDTA(0.5%), 페놀 레드 없음깁코15400054
Vivaspin 20 원심 농축기 MWCO 10,000 Da 시그마 알디르치Z614602

참고문헌

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