방법 논문

전립선암 관련 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

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DOI:

10.3791/68367

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2025년 8월 1일

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1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술에서 섬유아세포를 분리, 확장 및 불멸화하기 위한 포괄적인 절차를 제공합니다. 또한, 섬유아세포-종양 세포 누화의 기능적 효과를 평가하기 위해 개발된 분석법을 설명하며, 조건화된 배지를 사용한 치료와 공동 배양을 모두 활용합니다.

초록

종양 간질은 종양 세포에 의해 적극적으로 형성되어 종양 형성 특성을 채택할 수 있으므로 암 연구의 초점이 됩니다. 간질 구성 요소 중에서 암 관련 섬유아세포(CAF)는 종종 종양 미세 환경(TME)에서 가장 풍부한 세포 유형이며 종양 세포 및 기타 간질 구성 요소와의 상호 작용을 통해 암 진행을 촉진하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이러한 상호 작용의 메커니즘을 밝히려면 CAF를 분리하고 특성화하기 위한 강력한 방법이 필요하며, 이는 새로운 CAF 표적 암 치료법 개발의 토대를 마련할 수도 있습니다. 이 연구는 전립선암(PCa) 환자로부터 얻은 근치적 전립선 절제술 표본의 종양과 인접한 정상 영역 모두에서 섬유아세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 동일한 개체로부터 CAF와 정상 대응물(NF)을 동시에 분리하여 쌍을 이룬 실험 시스템을 제공할 수 있습니다. 다운스트림 시험관 내 분석을 위한 1차 CAF 및 NF의 유지 관리와 장기 연구를 용이하게 하기 위한 불멸화를 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 또한 증식, 이동 및 고정 독립적 성장을 포함하여 암세포 행동에 대한 CAF와 NF의 효과를 비교하기 위해 고안된 기능적 분석에 대해 설명합니다. 섬유아세포 유래 조절 배지(CM)를 사용한 암세포 치료 및 섬유아세포와 종양 세포의 직접 공동 배양이라는 두 가지 보완적인 접근법이 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 방법론은 PCa뿐만 아니라 잠재적으로 다양한 인간 암에 걸쳐 CAF와 종양 세포 간의 동적 상호 작용을 조사하기 위한 포괄적인 툴킷을 나타냅니다. 더욱이, 이러한 상호 작용의 분자적 특성화는 CAF 유발 발암의 주요 매개체를 밝혀 치료 개입을 위한 유망한 표적을 제공할 수 있습니다.

서론

전립선암(PCa)은 전 세계 거의 3분의 2 국가에서 남성에서 가장 자주 진단되는 암입니다. 2022년에는 약 150만 건의 새로운 사례가 보고되어 전 세계적으로 3,97,000명이 사망했습니다. 이러한 수치로 인해 PCa는 남성 중 두 번째로 흔한 암이자 암 관련 사망의 다섯 번째 주요 원인이 됩니다1.

PCa는 상당한 종양 간 이질성 2,3,4, 다양한 분자 아형 및 다양한 임상 결과5,6를 특징으로 하는 다발성 생물학적으로 복잡한 질병이며, 이 모든 것이 예후 및 치료 반응에 상당한 영향을 미칩니다7.

전립선 종양 시작 및 진행에서 종양 미세 환경(TME)의 중요한 역할은잘 확립되어 있지만8,9, 종양 세포와 주변 간질 구획 사이의 분자 상호 작용은 불완전하게 이해되어 있습니다. 전립선 종양 미세환경(TME)이 종양 시작 및 진행에 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있지만 종양 세포와 주변 간질 사이의 분자 상호 작용은 충분히 정의되지 않은 상태로 남아 있습니다. TME는 중간엽 및 면역 기원의 간질 세포를 포함한 다양한 간질 세포로 구성되며, 이는 종양 유래 신호에 반응하여 활성화되고 이후 종양 촉진 기능을 획득합니다10,11. 이 중 암 관련 섬유아세포(CAF)는 종종 가장 풍부한 간질 집단을 나타냅니다. CAF는 세포외 기질(ECM) 리모델링에 기여하고 종양 성장을 촉진하며 암세포 침범 및 이동을 촉진합니다 4,11,12,13. 분비 인자와 직접적인 세포-세포 상호 작용을 통해 CAF는 증식, 침습 및 치료 저항성에도 영향을 미칩니다. 특히 CAF는 이질적인 집단입니다. 일반적으로 종양 형성 기능과 관련이 있지만 일부 하위 유형은 종양 억제 역할을 할 수 있습니다14,15. 중요한 것은 CAF에 대한 고유한 마커가 없기 때문에 CAF의 정확한 식별과 다양한 역할의 기능적 해부에 어려움이 있다는 것입니다12,16.

CAF와 종양 세포 사이의 기능적 누화를 조사하기 위한 강력한 접근 방식은 1차 CAF와 일치하는 정상 섬유아세포(NF)를 분리한 다음 증식, 이동, 콜로니 형성 및 고정 독립적 성장과 같은 종양 세포 거동에 대한 각각의 영향을 평가하는 것입니다 17,18,19. 이 기사에서는 고위험 PCa 환자의 근치적 전립선 절제술 표본에서 CAF 및 NF를 분리하기 위한 정제되고 재현성이 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 전문 비뇨기병리학자가 종양 및 종양이 없는 영역을 정확하게 식별하고 해부하여 동일한 환자로부터 CAF 및 NF를 도출할 수 있도록 하는 것입니다. 이 쌍 샘플 접근법은 섬유아세포 표현형에 영향을 미칠 수 있는 종양 간 이질성 및 개별 환자별 변수를 제어하는 데 도움이 됩니다 20,21,22. 충분한 종양 조직을 사용할 수 있도록 글리슨 점수가 ≥7인 환자의 표본에 중점을 둡니다.

분리된 섬유아세포의 신뢰할 수 있는 표현형 특성화는 중첩 마커 발현을 공유할 수 있는 다른 세포 유형, 특히 상피 세포와 구별하기 위해 여러 마커를 사용해야 합니다16. 일차 PCa 섬유아세포는 일반적으로 10-15회 계대 후에 노화를 겪어 장기 분석을 복잡하게 만들기 때문에 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT)23의 안정적인 발현을 통한 세포 불멸화를 위한 프로토콜도 제시합니다.

종양 세포에 대한 CAF 및 NF의 기능적 효과를 탐색하기 위해 우리는 몇 가지 실험 전략을 테스트하고 최적화했습니다. CAF가 분비 인자와 직접적인 세포-세포 접촉 모두를 통해 영향을 미친다는 점을 감안할 때24, 두 가지 보완적인 분석 시스템이 개발됩니다: (1) 섬유아세포 조절 배지(CM)로 암세포를 치료하고, (2) 섬유아세포와 종양 세포의 직접 공동 배양. 이러한 분석은 증식, 고정 독립적 성장 및 이동을 포함한 주요 암세포 특성을 평가합니다. 분비 인자의 영향을 표준화하기 위해 CAF 및 NF의 컨디셔닝 배지를 농축하고 총 단백질 함량을 기준으로 정량화(conCM)했습니다.

이러한 분석을 통해 상당한 기능적 효과를 입증하면 CAF 기반 종양 형성의 중요한 매개체 식별을 지원하여 치료 개입을 위한 잠재적 표적을 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구는 이탈리아 토리노에 있는 Città della Salute Molinette 병원의 생명윤리 위원회가 승인한 임상 샘플 사용에 대한 기관 지침을 완전히 준수하여 수행되었습니다. 모든 샘플은 참여 환자의 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 채취되었습니다. 다음 섹션에서는 암 관련 섬유아세포(CAF)와 일치하는 정상 섬유아세포(NF) 대응물의 분리를 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 종양 및 인접한 비종양 영역의 해부, 조직 처리, 세포 배양, 분리된 세포의 표현형 및 기능적 특성화가 포함됩니다. 모든 절차는 인증된 생물안전 캐비닛 내의 멸균 조건에서 수행되어야 합니다. 세포는 달리 명시되지 않는 한 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충한 완전한 Dulbecco's Modified Eagle 배지(cDMEM)를 사용하여 5%CO2 를 포함하는 가습 분위기에서 37°C에서 배양되었습니다. 모든 원심분리 단계는 브레이크가 걸린 상태에서 수행됩니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 시약, 재료 및 장비의 포괄적인 목록은 재료 표 를 참조하십시오. 이 방법론은 글리슨 점수가 4+3 이상인 고위험 전립선암 표본에 최적화되었습니다.

1. 외과적 샘플 해부

참고: 이 절차는 고급 전립선암(PCa) 환자에게 수행된 근치적 전립선 절제술절차25에서 수집한 수술 표본에 대해 수행되었으며 내부 기관 지침과 확립된 국제 문헌 및 모범 사례 26,27,28에 따라 표준화된 프로토콜에 따라 관리되었습니다.

  1. 멸균 드레이프의 생물 안전 후드 아래에 전립선을 놓고 해부학적 랜드마크에 따라 방향을 잡습니다.
    참고: 이 절차는 숙련된 비뇨기병리학자가 수행해야 합니다.
  2. 멸균 칼날을 사용하여 수술 전 생검 보고서에서 종양성 또는 종양 세포가 없는 것으로 확인된 부위에서 조직 절편을 절제합니다.
  3. WHO 분류30의 최신판의 전립선 선암종에 대한 진단 기준에 따라 2.5μm 두께의 조직 절편을 준비하고 헤마트실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 선택된 영역에서 종양 세포의 존재 여부를 확인함으로써 두 조직 샘플에 대해 신속한 극저온 분석29를 수행합니다(그림 1A 참조).
    참고: 불일치가 발생하면 종양 및 비종양 영역 모두의 조직학적 확인이 얻을 때까지 샘플링 과정을 반복합니다.
  4. 종양 및 비종양 영역에서 약 10mm2 샘플을 절제하고 7mL의 얼음처럼 차가운 조직 저장 완충액이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 후속 절차를 위해 얼음 위에 보관합니다.
    참고: 샘플은 이 완충액에서 최대 48시간 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 섬유아세포 분리

참고: 다음 모든 처리 절차는 달리 언급되지 않는 한 4°C의 얼음 위에서 수행해야 합니다. 체계는 그림 1 A를 참조하십시오.

  1. 1일차: 조직 샘플의 무게를 측정합니다.
    참고: 평균적으로 70-100mg을 얻습니다.
  2. 6cm 접시로 이동하고 얼음처럼 차가운 PBS 4mL에 2회, 얼음으로 차가운 cDMEM 4mL에 2회, 둘 다 200U/mL 페니실린, 200μg/mL 스트렙토마이신(2x)을 보충하여 멸균 겸자를 사용하여 조직을 한 접시에서 다음 접시로 옮깁니다.
  3. 100U/mL 페니실린-G 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 1mL의 DMEM과 함께 얼음 위의 6cm 플레이트에 조직을 놓은 다음 가위나 칼날을 사용하여 작은 조각(<1mm2)으로 다진 다음 조직을 기계적으로 파괴합니다.
  4. 얼음처럼 차가운 cDMEM 5mL가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 5분 동안 754 x g 에서 원심분리합니다.
  5. 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 얼음처럼 차가운 cDMEM 5mL에 재현탁합니다. 4°C에서 5분 동안 754 x g 으로 다시 원심분리합니다.
  6. 위와 같이 상청액을 제거하고 1mL/100mg의 조직을 사용하여 펠릿을 콜라게나제 II(DMEM에서 1mg/mL)에 재현탁합니다. 1.5mL 마이크로튜브로 이동합니다.
    참고: 콜라게나제 배치의 가변성으로 인해 다양한 배치를 테스트하고 예측된 모든 분리를 수행하기에 충분한지 확인하십시오.
  7. 튜브를 파라핀 필름으로 덮고 37°C에서 연속적으로 흔들면서 샘플 O/N(8-12시간)을 분해합니다.
    참고: 2일차에 다음 단계를 수행합니다.
  8. 샘플을 15mL 원추형 튜브로 옮기고 5mL의 얼음처럼 차가운 cDMEM을 세포 현탁액에 첨가하여 콜라게나제를 비활성화한 다음 4°C에서 5분 동안 754 x g 로 원심분리합니다.
    참고: 콜라게나제는 세제가 포함된 용기에 흡인하여 폐기합니다.
  9. 10mL 피펫을 사용하여 상청액을 흡인하고 펠릿을 1mL의 0.05% 트립신/EDTA에 재현탁합니다. 37°C에서 5분 동안 배양하고 가끔 흔듭니다.
  10. 샘플에 DNase I 1mL를 첨가하고 잘 혼합합니다. PBS에서 새로 준비된 25mg/mL 용액을 사용합니다.
    참고: 이 단계의 DNase I 처리는 단일 세포 용액을 얻는 데 도움이 됩니다.
  11. 4°C에서 5분 동안 754 x g 에서 원심분리합니다.
  12. 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 펠릿을 5mL의 차가운 cDMEM에 재현탁합니다. 754 x g 에서 5 분 4 °C 동안 원심분리합니다.
  13. 20% FBS cDMEM에 세포를 재현탁합니다. 37°C, 5% CO2 및 95% 습도에서 최소 3일 동안 플레이트 및 배양합니다. 접시를 움직이거나 기울이지 않도록 주의하십시오. 70-100mg의 조직에 대해 세포 현탁액을 2 x 3.5cm 접시, 2mL의 배지에 분배합니다. 필요한 경우 그에 따라 축소하십시오.
    참고: 50mg 미만의 조직은 비효율적인 세포 유도를 초래합니다. 분할 및 동결 방식은 그림 1B에 나와 있습니다.
  14. 3일 후 세포의 형태/생존력을 확인하고 배지의 2/3를 교체하여 세포 생산 성장 인자를 유지합니다. 세포가 합류에 도달하는 데 약 7-10일이 걸리고 격일로 배지를 교체합니다.
  15. 합류하면 세포를 20% FBS cDMEM에 있는 하나의 10cm 접시에 전달합니다.
  16. 15% FBS 배지를 두 번, 한 번, 12.5%, 10%를 사용하여 격일로 배지를 교체합니다. FACS 분석의 경우 RNA 및 단백질 추출 및 동결 스톡은 그림 1B의 방식을 따릅니다.
  17. 약 100% 합류할 때 세포를 분할합니다(약 10일). 풍부한 PBS로 각각 5분 동안 2-3회 세척합니다. 1% 트립신/EDTA(2x)를 첨가하고 인큐베이터에 넣고 몇 분마다 세포 박리를 확인합니다.

3. 배양 조건

  1. 100% 합류할 때만 세포를 1:3 이하로 통과시킵니다.
  2. 0.5mL의 얼음처럼 차가운 동결 배지(FBS의 경우 10% DMSO)에 합류 10cm 접시의 50%에 해당하는 분취량을 동결합니다. 10cm 접시에 각 분취량을 해동합니다.
    참고: 평균 배가 시간은 80-90시간입니다.

4. FACS 분석

참고: 이 프로토콜은 섬유아세포 집단의 신뢰할 수 있는 특성화를 보장하고 상피, 내피 또는 면역 세포의 잠재적 오염을 식별합니다. FACS 분석은 그림 2A와 같이 2절에서 수행됩니다.

  1. 세포를 수확하고 FACS 완충액(PBS 플러스 2% FBS)에 106 cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
  2. 유세포 분석 튜브에 라벨을 붙이고 각각에 100μL 부피의 1 x 105 세포를 추가합니다. 4개의 항체로 염색하는 경우, 다음과 같이 염색과 게이팅을 모두 고려하여 11개의 튜브를 준비합니다(표 1).
    참고: 1개의 튜브, 항체 없음(염색되지 않은 대조군), 세포 자가형광을 평가하기 위해, 항체 이소형 대조군이 있는 1개의 튜브, 비특이적 결합을 평가하기 위해, 보상을 위해 각각 단일 항체가 있는 4개의 튜브; 보상 비드는 세포를 대체할 수 있으며, 각각 항체 중 하나를 생략한 게이팅용 FMO(Fluorescence Minus One) 튜브 4개, 4개의 항체(실제 샘플)가 모두 포함된 튜브 1개를 대체할 수 있습니다. 다음과 같은 형광 표지 항체가 사용됩니다( 재료 표 참조): (1) 항-EpCAM-PE(상피 세포 마커), (2) 항-CD31-VioBlue(내피 세포 마커), (3) 항-CD45-FITC(면역 세포 마커), (4) 항-CD90-APC(섬유아세포 마커). 사용 가능한 유세포분석기 필터에 따라 다른 형광단에 접합된 항체를 사용할 수 있습니다. 세포 생존력을 보존하기 위해 얼음 위에서 모든 단계를 수행합니다.
  3. 정제된 항-CD16/CD32 항체 또는 차단 완충액(PBS 1%-2% BSA)과 같은 Fragment Crystallizable 수용체(FcR) 차단제와 함께 세포를 배양합니다. 세포 현탁액 100μL당 1-5μL FcR 차단 시약을 사용하고 4°C에서 10-15분 동안 배양합니다.
  4. 씻지 않고 바로 염색을 진행하십시오. 표 1에 지정된 대로 적절한 항체 희석액 또는 해당 이소형 대조군을 튜브에 추가합니다.
  5. 부드럽게 혼합하고 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
  6. 2mL의 FACS 완충액으로 세척합니다.
  7. 4°C에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  8. 상청액을 버리고 세포를 신선한 FACS 완충액 1mL에 재현탁합니다.
  9. 제조업체의 지침에 따라 생존율 염료(요오드화 프로피듐)를 첨가하십시오( 재료 표 참조).
  10. 유세포 분석기에서 샘플을 수집합니다.
  11. 단일 염색 보정 컨트롤을 사용하여 보정 매트릭스를 설정합니다. 데이터 분석을 위해 FACS 밀도 플롯에 다음 게이팅 전략을 적용합니다.
  12. 전방 및 측면 산란 게이팅: FSC-A 대 SSC-A를 사용하고 세포 파편을 배제하기 위해 주요 세포 집단 주변의 영역을 설계합니다.
  13. 이중항 제외의 경우: FSC-A 대 FSC-W(또는 FSC-H 대 FSC-A)를 선택하고 영역에 비해 너비가 증가(또는 높이에 비해 영역이 증가)을 나타내는 세포 덩어리를 제외하는 영역을 설계합니다. 단일 셀을 선택하고 동일한 절차를 수행하여 SSC-A 대 SSC-W(또는 SSC-H 대 SSC-A)를 사용하여 단일 세포 집단의 순도를 높입니다.
  14. 생존율 염료(즉, 요오드화 프로피듐) 대 SSC-A를 선택하고 음성 살아있는 세포를 선택합니다.
  15. 살아있는 세포에서 CD326(x축) 대 CD31(y축); 해당 FMO 샘플을 사용하여 게이트를 정확하게 설정합니다. FMO를 사용하면 다른 형광단에 의해 발생하는 특정 채널로의 형광 확산을 설명할 수 있습니다.
    1. CD326 FMO 샘플을 보고 왼쪽 사분면의 모든 세포를 포함하는 사분면 게이트를 그립니다(즉, CD326에 대해 음성). CD31 FMO 샘플을 사용하여 동일한 절차를 반복하여 모든 FMO 세포가 하위 사분면(즉, CD31에 대해 음성)에 있도록 게이트를 조정합니다. 이 사분면을 사용하여 샘플을 분석하고 왼쪽 하단 사분면(CD31-CD326-)에서 세포를 선택합니다.
  16. CD326(x축) 대 CD45(y축), CD326 FMO 및 CD45 FMO를 사용하여 사분면 게이트를 설정합니다. 이 사분면을 사용하여 모든 샘플을 분석하고 왼쪽 하단 사분면(CD45-CD326-)의 세포를 선택합니다.
  17. 플롯 CD90 대 SSC-A를 사용하고 CD90 FMO를 사용하여 음성 세포를 배제하고 CD90+만 포함하는 영역을 설정합니다. 이 영역을 사용하여 모든 샘플을 분석하여 CD90+ 세포의 백분율을 측정합니다. 대표적인 결과는 그림 2A에 나와 있습니다.

5. 섬유아세포 불멸화

참고: CAF 및 NF 집단의 불멸화는 hTERT를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 사용한 안정적인 형질도입에 의해 달성됩니다. 다음은 감염성 유사 바이러스 입자를 준비하고 세포를 형질도입하는 프로토콜입니다.

  1. 레트로바이러스 입자 생산
    1. 1일차, 폴리-L-라이신 코팅 및 세포 도금: 10cm 접시에 폴리-L-라이신 용액 6mL(H2O에서 0.1mg/mL)를 코팅하고, TC 후드 아래에서 5분 동안 배양하고, 흡인하고, 3 x 106 HEK293T 세포를 도금하기 전에 개봉한 접시를 후드 아래에서 건조시킵니다.
    2. 2일차: 양이온 지질 매개 형질감염 시약 30μL를 0.75mL 무항생제 지방감염 최적화 배지에 첨가합니다.
    3. 동시에 pCL-Ampho 레트로바이러스 패키징 벡터 2μg과 pBABE-puro-hTERT 플라스미드 2μg을 항생제가 없는 지방 페딕션 최적화 배지 0.75mL에 추가합니다.
    4. RT에서 5분 동안 배양합니다.
    5. 15mL 원뿔형 튜브에 두 희석액을 혼합하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
    6. 한편, HEK293T 배지를 10% FBS가 보충된 6mL의 지방 흡수 최적화 배지로 교체합니다.
    7. DNA 복합체를 접시 표면에 부드럽게 분배하고 가습된 CO2 인큐베이터에서 O/N까지 6시간 동안 배양합니다.
    8. 3일: 배지를 7mL의 cDMEM으로 교체하고 48시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 단계부터 시작하여 기관 규칙에 따라 생물안전 수준 3(BSL3) 조직 배양 시설에서 작업을 수행해야 합니다.
    9. 5일째에 바이러스 함유 배지를 수집하고 0.22μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
    10. 분취하여 -80°C에서 보관합니다.
  2. 바이러스 형질도입
    1. 1일차: 6웰 플레이트의 2웰에 60% 합류로 저계대 섬유아세포를 플레이트합니다.
    2. 2일차: 배지를 8μg/mL의 폴리브렌을 포함하는 이전에 생성된 pBABE-puro-hTERT 레트로바이러스 제제 1mL로 교체하고 12-16시간 동안 배양합니다.
    3. 3일차: 바이러스 함유 배지를 2mL의 cDMEM으로 교체합니다.
    4. 4일: 24시간 후, 퓨로마이신 선택(2μg/mL)의 48시간 라운드를 두 번 시작합니다.
      참고: 농도는 항생제 및 세포 유형의 각 배치에 대해 경험적으로 결정되어야 하며, 선택 후 4일 이내에 모든 세포를 죽이기 위해 가장 낮은 농도를 선택해야 합니다.
    5. 8일차: 감염되지 않은 대조군 세포가 모두 죽었는지 확인합니다. 배지를 cDMEM으로 교체하고 감염된 세포를 1:3으로 계대하기 전에 합류할 때까지 성장시킵니다. 세포가 합류에 도달하고 다시 1:3으로 분할되도록 합니다. 이 단계에서 셀은 BLS3 시설을 종료할 수 있습니다.
      참고: 가능한 한 빨리 냉동 분취량을 준비하십시오. 불멸화가 발생했는지 확인하려면 세포를 5-6회 계대하고 계대에 따라 변하지 않아야 하는 형태 및 복제율을 점수화합니다. 아래에 설명된 방법을 사용하여 불멸화된 세포를 1차 대응 세포와 기능적으로 비교합니다.

6. 섬유아세포 특성화

  1. CAF/NF 마커의 발현에 대해 분리된 세포를 표현형적으로 분석하고 종양 세포에 대한 잠재적인 발암성 촉진 활성을 기능적으로 특성화합니다.
    참고: RNA 및 단백질 수준 모두에서 마커 발현 수준을 평가하도록 최적화된 qPCR 올리고뉴클레오티드 및 항체는 각각 표 2 및 재료 표에 보고되어 있습니다. 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 대한 항체는 종종 비특이적이라는 점에 유의하십시오. 적절한 양성 및 음성 대조군31,32를 포함해야 합니다. 섬유아세포와 종양 세포 사이의 누화를 평가하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 CAF 또는 NF에서 유래한 컨디셔닝 배지(CM)로 종양 세포를 처리하거나 섬유아세포와 종양 세포를 공동 배양하는 두 가지 대체 접근법이 설명됩니다. 종양 세포의 증식을 향상시키는 두 접근법의 효능이 설명됩니다.

7. 컨디셔닝 배지의 준비 및 농축

참고: 조절된 배지는 서로 다른 세포 간의 비교를 용이하게 하기 위해 수집 후 농축되고 정확하게 투여됩니다.

  1. cDMEM의 15cm 접시에 70% 합류에서 세포를 도금합니다.
  2. 다음날, 15mL의 기아 배지(FBS가 없는 DMEM)로 전환하고 48시간 동안 배양하여 CM을 생성합니다.
  3. CM을 수집하고 RT에서 5분 동안 300 x g 로 원심분리한 다음 0.22μm 필터를 통해 여과하여 세포 파편을 제거하고 멸균합니다.
  4. 농축 튜브(MWCO 10,000 Da)로 옮기고 2000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리하거나 제조업체의 지침에 따라 약 1mL의 농축 CM(conCM), 즉 15 x 농도를 얻습니다.
  5. conCM을 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
  6. 비색 단백질 분석을 사용하여 수집된 conCM의 단백질 함량을 정량화합니다.
    참고: 얻은 평균 농도는 0.5 및 2 μg/μL입니다. 더 낮은 농도를 계속 사용할 수 있습니다.

8. 증식 분석

참고: 세포 증식(DU145 또는 LNCaP 인간 PCa 세포주 사용)은 종양 세포를 conCM으로 처리하거나 CAF 또는 NF와 공동 배양하는 두 가지 다른 설정에서 살아있는 세포 분석 기기를 사용하여 평가되었습니다. 이 경우 형광 종양 세포를 사용해야 합니다. 대표적인 결과는 그림 3에 나와 있습니다.

  1. conCM으로 치료한 증식 분석
    참고: 이 프로토콜은 DU145 세포에 최적화되어 있습니다. 다른 셀에는 조정이 필요할 수 있습니다.
    1. 조건당 최소 3회 반복을 고려하여 96웰 플레이트(750세포/웰)의 cDMEM에서 종양 세포를 플레이트하고 O/N을 배양합니다.
    2. cDMEM을 보충 여부에 관계없이 50μg/mL의 conCM로 기아 배지로 대체합니다.
    3. 플레이트를 인큐베이터 내의 살아있는 세포 분석 기기 챔버로 옮깁니다.
    4. 37°C에서 30분 동안 데운 다음 첫 번째 스캔을 시작합니다.
    5. 위상차 채널을 사용하여 적절한 대물렌즈와 원하는 필드/웰 수(10x 대물렌즈 및 5개 필드/웰 권장) 및 표준 스캔 유형을 선택합니다. 4-5일 동안 6시간마다 스캔합니다(기간은 조건 및 세포 유형에 대해 경험적으로 결정되어야 함).
    6. 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
    7. 각 웰(각 조건에 대한 기술 반복)에 대해 시간 0에서의 값에 대한 폴드 변화를 계산합니다. 해당 그래프를 생성하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의성을 평가합니다.
  2. 공동 배양 시 증식 분석
    1. 750 RFP 발현 DU145 세포와 CAF 또는 NF를 96웰 플레이트의 cDMEM에서 1:3 비율로 공동 플레이트합니다.
    2. 다음날 2% FBS DMEM으로 전환합니다. 플레이트를 인큐베이터의 살아있는 세포 분석 기기 챔버로 옮기고 위상차 및 주황색 채널을 모두 사용하여 4일 동안 6시간마다 표준 스캔을 시작합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 증식 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
    4. 각 웰(각 조건에 대한 기술 반복)에 대해 시간 0에서의 값에 대한 폴드 변화를 계산합니다. 해당 그래프를 생성하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의성을 평가합니다.

9. 상처 치유 이동 분석

참고: 여기서, 살아있는 세포 분석 기기를 사용하여 세포 이동을 측정하기 위해 고전적 스크래치 분석(33)의 자동화된 버전이 제시된다.

  1. 합류 단층을 얻기 위해 살아있는 세포 분석 기기에 적합한 96웰 플레이트에 종양 세포를 플레이트합니다.
  2. 다음날, 10ug/mL의 미토마이신 C로 세포를 2시간 동안 처리합니다.
    참고: 이 단계는 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 분석 중 세포 증식을 방지하는 데 필수적입니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 우물에 스크래치를 적용하십시오( 재료 표 참조).
  4. 100μL의 PBS로 세척하여 분리된 세포를 제거합니다.
  5. 50 mg/mL 또는 없음(대조군)으로 기아 배지를 추가합니다.
  6. 인큐베이터의 살아있는 세포 분석 챔버에 플레이트를 놓습니다.
  7. 30분 후, 세포와 상태에 따라 1일 이상 동안 4시간마다 권장되는 상처 치유 스캐닝 프로토콜을 프로그래밍합니다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 결과를 분석하십시오( 재료 표 참조).

10. 연질 한천 분석에 의한 고정 독립적 성장

  1. 12웰 플레이트에 70% 합류로 CAF 또는 NF를 플레이트링하고 3개의 빈 웰을 대조군으로 남겨둡니다.
  2. 다음날, 멸균 조건에서 50mL 원추형 튜브에 0.45g의 저융점 한천을 12.5mL PBS에 첨가하여 4x 연질 한천 원액(3.6%)을 준비합니다.
  3. 전자레인지에 녹입니다. 용액이 농축될 수 있는 과도한 끓임에 주의하십시오.
  4. 37°C에서 식힌 다음 예열된 cDMEM으로 1:4로 희석하여 1x 작업 용액을 준비합니다.
  5. 12웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 각 웰에 500μL의 1x 한천 용액을 첨가합니다.
  6. 4°C에서 20분 동안 응고시키고 나머지 한천 용액은 37°C에서 보관합니다.
  7. 한편, 종양 세포를 트립신화하고 2 x 104 세포/mL의 세포 현탁액을 준비합니다.
  8. 여러 번 피펫팅하여 동일한 부피의 세포 현탁액과 한천 1x 용액을 혼합하고 각 웰의 첫 번째 한천 층 위에 500μL(즉, 5000개의 세포)를 분배합니다. 최소 10% 이상의 세포 현탁액을 준비해야 합니다.
  9. 한천을 4°C에서 20분 동안 배양하여 응고시킵니다.
  10. 각 웰에 1mL의 cDMEM을 추가하고 웰 가장자리에서 배지를 부드럽게 흡인하고 신선한 배지를 중앙에 거의 적가하여 연질 한천층이 변위되지 않도록 격일로 갱신합니다.
  11. 쉽게 볼 수 있는 식민지가 나타날 때까지 배양합니다. DU145 세포는 일반적으로 약간의 차이가 있지만 약 12일이 소요됩니다.
  12. 200μL의 니트로블루 테트라졸륨 염화물 용액(PBS에서 1mg/mL)을 첨가하여 배지 및 염색 콜로니를 버립니다. 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
  13. 콜로니가 염색되면 염료 용액을 버리고 실체현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 배율을 가장 낮은 값(0.8x)으로 설정하여 전체 웰이 보이도록 합니다. 거친 초점 노브를 사용하여 콜로니에 선명한 초점을 맞춘 다음 이미지를 캡처하기 전에 조명 및 모드 설정을 조정합니다.
  14. 적절한 소프트웨어(34 )를 사용하여 보충 파일 1에 제공된 단계에 따라 콜로니 수 및 점유 면적을 정량화한다.
  15. 콜로니의 수와 크기 분포에 점수를 매깁니다( 그림 4 참조).

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결과

7명의 고급 PCa 환자의 CAF 및 NF 쌍이 이 프로토콜로 성공적으로 분리되었습니다. 수술 시 환자의 연령과 글리슨 점수는 표 3에 요약되어 있습니다. 파생된 섬유아세포 집단의 순도를 평가하기 위해, 계대 2개의 1차 CAF 및 NF를 분리하고 표시된 형광 항체 또는 요오드화 프로피듐으로 염색하여 세포사멸을 평가했습니다. 후속 FACS 분석의 대표적인 결과는 그림 2A에 표시되어 게이팅 전략과 각 마커에 대해 양성인 세포의 백분율을 강조합니다. 분석에는 상피 세포(EpCAM), 내피 세포(CD31), 면역 세포(CD45) 및 활성화 섬유아세포(CD90)에 대한 마커가 포함되었습니다. 결과는 세포가 대부분 상피, 내피 또는 면역 세포 마커에 대해 음성이었고 CAF 활성화의 마커로 간주되는 CD90에 대해 다양한 양성을 보였기 때문에 순수 섬유아세포의 성공적인 분리를 확인했습니다

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토론

PCa 조직으로부터의 세포 유도 및 분석은 특히 이용 가능한 동물 모델이 인간 전립선 해부학 및 질병 진행을 완전히 복제하지 못한다는 점을 고려할 때 관련 실험 모델을 제공합니다37. 침팬지의 전립선은 해부학적으로 인간과 유사하지만 윤리적 한계를 암시하는 것 외에도 느리고 확률적인 질병 진행을 보입니다. 개는 전립선 구조와 병리생물학이 크게 다르며 산발적인 연령 관련 전립선 질환이 발생합니다. 쥐와 생쥐와 같은 일반적인 실험실 모델은 전립선 해부학적 구조, 상피-간질 비율 및 줄기 세포 마커 발현이 다릅니다. 또한 마우스는 전립선 악성 종양 유도에 내성이 있는 반면 쥐는 호르몬 발암 물질을 필요로 하므로 이러한 모델은 인간 전립선 질환을 연구하는 데 최적이 아닙니다37. 생체 내에서 인간-마우스 이종이식편은 특히 전임상 치료 테스트에 귀중한 모델을 제공합니다. 그러나 ...

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공개 사항

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 이탈리아 암 연구 협회(AIRC)의 지원을 받았으며 IG16930 및 VP에 IG24851했습니다. 이탈리아 대학 및 연구부(MIUR PRIN 2017 및 2022에서 VP까지); 리히텐슈타인의 Truus 및 Gerrit van Riemsdijk 재단, VP에 기부; 피에몬테 지역(편향). A.S.는 이탈리아 암 연구 재단(FIRC) 박사후 연구원의 지원을 받았고, L.A.는 Fondazione Umberto Veronesi의 지원을 받았습니다. 그림 2 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12웰 플레이트사르슈테트833921
24웰 플레이트사르슈테트833922
6웰 플레이트사르슈테트833920
96웰 플레이트사르슈테트833924
항-GAPDH 마우스 mAb (6C5)시그마 알드리치CB1001 시리즈출처: 마우스; WB 희석: 1:1000
aSMA시그마 알드리치A5228 출처: 마우스; WB 희석: 1:3000
카베올린세포 신호 전달 기술CST3267출처: 토끼; WB 희석: 1:1000
CD31-비오블루밀테니 바이오텍130-119-980유세포 분석 Ab, 내피 세포 마커
CD326-PE(EpCAM)밀테니 바이오텍130113-826Flow Cytometry Ab, 상피세포 마커
CD45-FITC밀테니 바이오텍130-110769유세포 분석 Ab, 판 백혈구 마커
CD90-APC밀테니 바이오텍130-114-903유세포 분석 Ab, 섬유아세포 마커
콜라겐 VI(COL6A1)아브캠AB182744출처: 토끼; WB 희석: 1:1000
원뿔형 튜브 15mL사르슈테트62554502
원뿔형 튜브 50mL사르슈테트62547254
Cryopure 2 mL 마이크로튜브사르슈테트72380992
배양판 직경 100mm 코 닝353003
배양판 직경 100mm 코 닝353025
배양 플레이트 직경 60mm 코 닝353002
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마 알디르치D8418생물학적 후드에서 사용
덜베코' s 수정된 독수리' s 중간(DMEM)깁코119650924 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
팍아브캠AB53066출처: 토끼; WB 희석: 1:500
FcR 차단 시약, 인간밀테니 바이오텍130-059-901Fc 차단기
태아 소 혈청(FBS)깁코160000444 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
필터링된 팁 10 & 마이크로; L사르슈테트703010255
필터링된 팁 100 및 마이크로; L사르슈테트703030255
필터링된 팁 1000 및 마이크로; L사르슈테트703060255
필터링된 팁 20 및 마이크로; L사르슈테트703030265
필터링된 팁 200 & micro; L사르슈테트703031255
필트로푸르 S 플러스 0,20 & 마이크로; m 사르슈테트831826102
집게(Forcep)2바이오1102412
FSP1/S100A4세포 신호 전달 기술D9F9D (13018)출처: 토끼; WB 희석: 1:2000
IL6Abclonal 기술A0286출처: 토끼; WB 희석: 1:1000
이미지J국립 보건 연구소버전 1.53c이미지 분석용 소프트웨어
Incucyte ImageLock 96-웰 플레이트사토리어스BA-04857
Incucyte® SX5사토리어스SX5살아있는 세포 분석 기기 
Lipofectamine 2000 형질감염 시약써모피셔 사이언티픽11668019양이온 지질 매개 형질감염 시약
맥스® 티슈 스토리지 솔루션밀테니 바이오텍130-100-008
마이크로플레이트 리더(600nm 흡광도)프로메가GM3500 시리즈
마이크로튜브 1.5mL 사르슈테트7269001
엔카드아브캠AB18203출처: 토끼; WB 희석: 1:1000
니트로 블루 테트라졸륨 시그마 알디르치엔5514
파라필름 시그마 알디르치HS234526B
p베이브-푸로-hTERT아드진1771-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
pCL-암포노부스 바이오로지컬 NBP2-29541-20 > C, 생물학적 후드에서 사용
PDGFRB산타크루즈SC-432출처: 토끼; WB 희석: 1:1000
페니실린-스트렙토마이신(PS, 10,000 & g/mL) 깁코151401224 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
위상차 현미경 올림푸스 BX42 시리즈
인산염 완충 식염수  (PBS)만든NaCl, 137mM; KCl, 2.7mM; Na2HPO4, 10mM, KH2PO4, 1.8mM. 오토클레이브 및 RT에 보관
폴리-L-라이신 용액시그마 알디르치P89204 °에서 보관하십시오. C, 생물학적 후드에서 사용
퓨로마이신 이염산염시그마 알디르치P8833
Secura 세미 마이크로 저울사토리우스SECURA125-1S
혈청학적 피펫 10mL 사르슈테트861254001
혈청학적 피펫 2mL 사르슈테트861252001
혈청학적 피펫 25 mL 사르슈테트861256001
혈청학적 피펫 5 mL 사르슈테트861253001
능력치3중부 표준시9139출처: 마우스; WB 희석: 1:1000
통계3 Y705중부 표준시9131출처: 토끼; WB 희석: 1:1000
실체현미경라이카MZ125
주사기 10mL펜타페르테00202260D12
테르모믹서에펜도르프22331
트립신-EDTA(0.5%), 페놀 레드 없음깁코15400054
빔산타크루즈SC-6260 시리즈출처: 마우스; WB 희석: 1:2000
Vivaspin 20 원심 농축기 시그마 알디르치Z614602MWCO 10,000 Da 
바그너 가위2바이오14070-12

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