Long-Read Sequencing Technologies를 사용한 Amplicon Sequencing

Summary

이 프로토콜은 긴 판독 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 결핵균 의 18개 약물 내성 영역에 대한 표적 심층 시퀀싱에 최적화되었으며, 이어서 장기 판독 데이터용으로 설계된 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인으로 분석했습니다.

Abstract

세계보건기구(WHO)는 결핵(TB) 및 약물내성 결핵(DR-TB)에 대한 신속하고 비용 효율적이며 사용자 친화적인 진단 방법에 대한 시급한 필요성을 지속적으로 강조하고 있습니다. WHO가 승인한 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술은 DR-TB 검출을 크게 향상시켰습니다. 이 중 표적 NGS(tNGS)를 사용하면 약물 내성과 관련된 유전적 돌연변이를 집중적으로 검출할 수 있어 전통적인 배양 기반 진단이 필요하지 않습니다. 널리 사용되는 tNGS 분석 중 하나는 신속하고 포괄적인 약물 감수성 테스트를 제공하지만 주로 높은 정확도의 시퀀싱 플랫폼에 최적화되어 있습니다. 그러나 이러한 시퀀싱 시스템의 높은 비용으로 인해 저소득 및 중간 소득 국가, 특히 아프리카 전역에서 접근성이 제한되었습니다. 휴대용 시퀀싱 기술은 유연성을 제공하고 인프라 요구 사항을 줄이는 유망한 대안을 제시합니다. 이 연구에서는 리팜피신 내성 결핵(RR-TB) 분리주에서 DNA를 추출하고 tNGS 분석을 사용하여 증폭한 다음 휴대용 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱했습니다. 동일한 증폭 산물도 참조 역할을 하기 위해 고정밀 단판 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱되었습니다. 휴대용 시퀀서의 데이터는 긴 판독 시퀀싱을 위해 설계된 생물정보학 파이프라인을 사용하여 처리되었으며, 짧은 판독 시퀀싱 데이터는 확립된 웹 기반 애플리케이션을 사용하여 분석되었습니다. 분석 결과 장판독 시퀀싱 접근법은 단판독 시퀀싱으로 검출된 고주파 저항 관련 변이를 성공적으로 식별했지만 저주파 변이를 검출하는 데는 한계가 있는 것으로 나타났습니다.

Introduction

결핵(TB)은 전 세계적으로 계속해서 사망의 주요 원인이며 특히 저소득 및 중간 소득 국가에서 지속적인 공중 보건 문제를 제기하고 있습니다^1,2. 결핵 통제 조치를 강화하기 위한 이니셔티브에도 불구하고 부분적으로는 신속하고 정확하며 비용 효율적이며 포괄적인 진단 기술을 달성하는 데 어려움이 있기 때문에 발전이 더디게 진행되었습니다 ^3,4,5. 라인 프로브 분석(LPA) 및 자동 핵산 증폭 검사(NAAT)와 같은 분자 진단 방법은 결핵 및 약물 내성 결핵(DR-TB)의 식별 속도를 높였지만 제한된 돌연변이 검출로 인해 철저한 약물 감수성 검사(DST)가 제한됩니다. 이러한 제한은 결핵 고부담 국가에서 특히 중요합니다 6,7,8,9.

이러한 한계를 해결하기 위해 세계보건기구(WHO)는 결핵 감시 및 내성 검출을 위한 강력한 도구로 부상한 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술의 사용을 권장했습니다^10,11. 전체 게놈 시퀀싱(WGS) 및 표적 NGS(tNGS) 접근법은 모두 더 넓은 돌연변이 범위를 제공하여 여러 약물에 걸쳐 내성 관련 변이를 식별할 수 있습니다 8,12,13,14,15. 전체 게놈 시퀀싱(WGS)은 포괄적인 DST 보고서를 제공하지만, 배양에 의존하기 때문에 배양에 최대 6주가 소요될 수 있으므로 신속한 진단에는 적합하지 않습니다15,16,17. 표적 NGS는 배양에 의존하지 않기 때문에 더 나은 대안을 제공합니다. 시퀀싱은 임상 표본으로부터 직접 수행될 수 있습니다¹⁸. 그 결과, WHO는 DST에 대해 세 가지 tNGS 분석법의 사용을 권장했습니다. Deeplex Myc-TB 분석: 이 분석법은 리팜피신, 이소니아지드, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코사이드(아미카신, 카나마이신, 카프레오마이신), 에탐부톨, 피라진아미드 및 에티오나미드에 대한 내성을 검출합니다 19,20,21. 센티넬 결핵 분석: 이것은 리팜피신, 이소니아지드, 플루오로퀴놀론 및 2차 주사제에 대한 내성을 표적으로 합니다^18,20. AQ-TB 분석: 이것은 리팜피신, 이소니아지드, 플루오로퀴놀론 및 2차 주사제에 대한 내성을 식별합니다. 이러한 분석은 높은 정확도로 인해 짧은 판독 플랫폼에서 사용하도록 최적화되었습니다²⁰. 반면에 ONT MinION 장수 판독 플랫폼은 실시간 데이터, 이식성 및 비용 효율적인 구현 가능성을 제공합니다^22,23. 그러나 NGS의 광범위한 사용은 인프라 및 비용의 요구에 의해 제한되며, 특히 단판 시스템⁽¹⁰)의 경우 더욱 그렇다.

Deeplex 분석은 세 가지 권장 분석 중 가장 포괄적입니다. 이 분석은 원래 13가지 항결핵제에 대한 내성과 관련된 18개 영역에서 다중 PCR을 수행하도록 설계되었습니다. 그러나 WHO는 10가지 항결핵제에 대해 충분한 민감도와 특이성을 나타냈습니다. 이 연구는 긴 판독 시퀀싱 플랫폼인 ONT MK1B MinION과 함께 사용하도록 최적화했습니다. 이 플랫폼의 휴대 가능하고 재사용 가능한 플로우 셀 시스템은 샘플당 인프라와 잠재적으로 시퀀싱 비용을 모두 줄여줍니다 ^4,22,23. 다른 긴 판독 호환 분석법이 개발되었지만 DST 범위가 제한된 경향이 있으며 일반적으로 좁은 범위의 내성 유전자만을 표적으로 합니다. 대조적으로, 이 분석은 광범위한 표적 범위를 제공하므로 분산형 DST^24,25에 대한 보다 포괄적인 진단 도구가 됩니다. 분석에 의해 증폭된 게놈 표적 및 해당 약물 연관성의 자세한 목록이 표 1에 제공되며, 분석의 진단 기능을 강조합니다²⁵.

DNA 추출 전에 샘플은 필요한 안전 예방 조치^25,26,27에 따라 생물안전 레벨 3(BSL-3) 조건에서 오염을 제거하고 비활성화해야 합니다. 내부 증폭 및 외부 대조군은 각 실행에 통합되어야 하며, 오염은 음성 대조군 및 일상적인 실험실 평가를 통해 추적되어야 합니다²⁵. 판독 깊이, 적용 범위 폭 및 증폭 성공을 포함한 중요한 품질 지표는 시퀀싱 후 평가되어야 합니다. 표적 시퀀싱의 경우, WHO는 각 앰플리콘에 대해 최소 100배의 판독 깊이와 ≥5%²⁸에 존재하는 경미한 변이를 검출할 수 있도록 모든 표적 약물 내성 영역을 적절하게 커버할 것을 권장합니다. 세계보건기구(WHO)는 품질 보증 시스템이 확립되고 모든 표적 지역이 충분히 커버된다고 가정할 때 1차 및 2차 약물에 대한 내성을 식별하기 위한 이러한 표적 시퀀싱 방법을 승인합니다²⁸.

Protocol

이 연구는 2021년 10월 20일 스텔렌보스 대학교(N21/09/093)의 인간 연구 윤리 위원회(HREC)로부터 윤리적 승인을 받은 TS ELiOT 프로젝트의 일환으로 수행되었습니다. 또한 정부 시설 사용에 대한 Western Cape Health Research의 승인을 받았습니다. 샘플은 SU HREC 승인 번호 N09/11/296에 따라 NHLS Green Point 및 Stellenbosch University와의 공동 노력을 통해 수집되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 샘플 준비

1. 열 비활성화
   1. MGIT 배양액을 80°C에서 1시간 동안 배양하여 BSL-3 조건에서 완전한 열 비활성화를 달성합니다.
   2. InstaGene 방법²⁹를 사용하여 DNA 추출을 진행합니다.
2. DNA 추출
   1. 5mL의 열 비활성화 MGIT 배양액을 15mL 튜브에 넣습니다.
   2. 실온(RT)에서 30분 동안 4000 x g 에서 원심분리합니다.
   3. 침전물을 남기고 피펫팅하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다.
   4. 200μL의 킬레이트화 기반 DNA 추출 시약을 침전물에 첨가하고 56°C에서 15분 동안 배양합니다.
   5. 용액을 2mL 스크류 캡 튜브에 옮기고 각각에 직경 2mm의 유리 비드 3개를 추가합니다.
   6. 10초 동안 소용돌이치게 하여 세포를 퍼뜨리고 튜브를 100°C의 건식 배조 인큐베이터에 8분 동안 넣습니다.
   7. 다음 설정으로 비드 비팅 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다: 4.0m/s에서 20초의 3사이클.
   8. RT에서 12,000 x g 으로 15분 동안 원심분리하고 침전물과 파편을 피하면서 130μL의 상청액(DNA 함유 액체)을 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
   9. 플릭 또는 볼텍스로 비드를 재현탁하고 추출된 DNA가 들어 있는 1.5mL 튜브에 156μL의 비드를 추가합니다.
   10. 천천히 위아래로 10회 피펫팅하여 혼합하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
   11. 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓아 DNA 결합 비드를 분리합니다.
       알림: 투명한 상청액이 자석을 향하는 튜브 측면의 어두운 자기 비드의 조밀한 펠릿 위에 나타나야 하며, 이는 상청액 제거 준비가 되었음을 나타냅니다.
   12. 구슬을 방해하지 않고 상청액을 피펫팅합니다.
   13. 랙에 있는 동안 새로 준비된 80% 에탄올 100μL를 비드 펠릿에 넣고 30초 동안 그대로 둔 다음 에탄올을 제거합니다. 세척 단계를 반복합니다.
   14. 비드 펠릿을 RT에서 5분 동안 자연 건조시킵니다. 다음 단계로 진행하기 전에 비드 펠릿이 무광택으로 보이고 눈에 보이는 액체가 남아 있지 않은지 확인하십시오.
   15. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다.
   16. 25μL의 뉴클레아제 프리 워터(NFW)를 건조된 비드에 직접 첨가하고 위아래로 10회 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다.
   17. RT에서 5분 동안 배양합니다.
   18. 튜브를 마그네틱 랙에 5분 더 되돌립니다.
   19. 용출된 DNA(상청액)를 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
   20. 고감도 형광 기반 dsDNA 정량 시약을 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
       참고: DNA는 -20°C 냉동고에 보관하거나 PCR을 진행할 수 있습니다.
3. 증폭(PCR)
   1. 제조업체의 지침에 따라 다중 PCR 및 PCR 후 세척²⁵.
   2. 고감도 형광 기반 dsDNA 정량 시약을 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
4. 전기영동
   1. 완전히 녹을 때까지 마이크로파 가열을 통해 아가로스 분말을 1x TAE 완충액에 용해시켜 2% 아가로스 겔을 준비합니다.
   2. 녹인 아가로스에 5μL의 무독성 형광 DNA 겔 염색제를 넣고 완전히 혼합합니다.
   3. 젤 혼합물을 빗이 장착된 젤 주조 트레이에 부어 우물을 형성합니다.
   4. RT에서 겔이 응고되도록 합니다.
   5. 응고되면 빗을 제거하고 1x TAE 완충액으로 채워진 전기영동 탱크에 겔 트레이를 놓습니다.
   6. 5μL의 로딩 완충액과 혼합된 5μL의 kb DNA 사다리를 첫 번째 웰에 로드합니다.
   7. 각 PCR 산물에 대해 5μL의 산물과 5μL의 로딩 버퍼를 혼합하고 개별 웰에 로드합니다.
   8. 젤을 100V에서 1시간 동안 실행합니다.
   9. 투과조명이 있는 겔 문서화 시스템을 사용하여 DNA 밴드를 시각화합니다.

2. ONT 라이브러리 준비

1. 최종 준비
   1. 농도를 기준으로 각 앰플리콘 샘플의 100ng를 계산하고 필요한 부피를 깨끗한 PCR 튜브로 옮깁니다.
   2. 주어진 샘플에서 앰플리콘의 총 질량(ng)을 계산하려면 품질 관리(QC) 후 샘플의 농도(ng/μL)에 남은 부피(μL)를 곱합니다.
      참고: 예를 들어, 샘플의 농도가 2ng/μL이고 QC 후 남은 부피가 1μL인 경우 총 앰플리콘 질량은 다음과 같습니다.
      총 질량 = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      시퀀싱을 위해 10ng의 앰플리콘을 준비하려면 희석 공식을 사용하십시오.
      씨₁V₁ = 씨₂V₂
      여기서: C₁ = 45 ng, V₁ = 알 수 없음, C₂ = 10 ng, V₂ = 1 μL, V₁ = (C₂ × V₂) / C₁ = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      따라서 초기 앰플리콘 샘플의 μL를 사용하여 시퀀싱을 위해 10ng의 DNA를 얻어야 합니다.
   3. NFW를 사용하여 각 샘플의 총 부피를 12.5μL로 조정합니다.
   4. 샘플을 위아래로 10회 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 잠시 회전시킵니다.
   5. 각 샘플에 1.75 μL의 말단 수리 및 A-테일링 반응 완충액과 0.75 μL의 말단 수리 및 A-테일링 효소 혼합물을 첨가합니다.
   6. 위아래로 10회 피펫팅하여 완전히 혼합하고 잠시 아래로 회전시킵니다.
   7. 튜브를 열순환기에서 25°C에서 30분 동안 배양한 다음 65°C에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 이 단계에서 사용자가 프로세스를 중단하기로 결정한 경우 말단 준비된 DNA의 정제를 위해 비드를 활용하는 것이 좋습니다. 정제된 DNA는 최대 7일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 기본 바코드 결찰
   1. 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제 및 크기 선택을 위한 마그네틱 비드, 상자성 DNA 클린업 비드, EDTA 및 네이티브 바코드(NB01-96)를 해동 및 준비한 다음 얼음 위에 놓습니다.
   2. 새 PCR 튜브에 뉴클레아제가 없는 물 2.75 μL, 말단 준비 DNA 1 μL, 1.25 μL 네이티브 바코드(NB01-96) 및 DNA 결찰 효소 혼합물 5 μL를 순서대로 추가합니다.
   3. 부드럽게 10회 피펫팅하여 각 반응을 혼합하고 미세 원심분리기를 사용하여 잠시 회전시킨 다음 RT에서 20분 동안 배양합니다.
   4. 각 웰에 1μL의 EDTA를 첨가하고 피펫팅으로 완전히 혼합한 다음 잠시 회전시킵니다.
   5. 풀 바코드 샘플을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   6. 소용돌이를 통해 DNA 클린업 비드를 재현탁하고 풀링된 총 샘플 부피의 0.7배를 추가합니다(예: 총 부피가 253μL인 23개 샘플의 경우 177.1μL 비드 추가).
   7. 피펫팅으로 용액을 혼합하고 HulaMixer에서 RT에서 10분 동안 배양합니다.
   8. 1600μL 순수 에탄올과 400μL NFW를 혼합하여 80% 에탄올 2mL를 준비합니다.
   9. 용출액이 투명하고 무색이 될 때까지 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다.
   10. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 버립니다.
   11. 펠릿을 방해하지 않고 새로 준비된 80% 에탄올 700μL로 비드를 세척한 다음 에탄올을 제거하고 버립니다.
   12. 에탄올 세척 단계를 반복합니다.
   13. 튜브를 잠시 원심분리하고 마그네틱 랙으로 돌아가 잔류 에탄올을 제거합니다.
   14. 비드를 30초 동안 자연 건조시킵니다.
   15. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 비드를 35μL의 뉴클레아제가 없는 물에 부드럽게 튕겨 재현탁한 다음 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   16. 용출액이 투명하고 무색이 될 때까지 튜브를 마그네틱 랙으로 되돌립니다.
   17. 후속 단계를 위해 용출액 35μL를 깨끗한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
       참고: 라이브러리는 이 단계에서 밤새 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 어댑터 결찰 및 정리
   1. 제조업체의 지침에 따라 신속 DNA 결찰 시약 키트를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
   2. 파이펫팅으로 NA(Native Adapter)와 Quick Ligase를 혼합한 다음 얼음 위에 놓습니다.
   3. RT, 와류, 원심분리기에서 용출 완충액(EB)을 해동하고 얼음 위에 놓습니다.
   4. RT, 소용돌이, 원심분리기에서 SFB(Short Fragment Buffer)를 해동하고 얼음 위에 놓습니다.
   5. 1.5mL 저결합 미세 원심분리기 튜브에 풀링된 바코드 샘플 30μL, 네이티브 어댑터(NA) 5μL, 급속 결찰 반응 완충액 10μL, 속효성 T4 DNA 리가아제 5μL를 혼합합니다.
   6. 부드럽게 피펫을 사용하여 혼합하고 잠시 원심분리한 다음 RT에서 20분 동안 배양합니다.
   7. 소용돌이를 통해 DNA 클린업 비드를 재현탁하고 반응에 20μL(0.4x)의 비드를 추가합니다.
   8. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 HulaMixer에서 RT에서 10분 동안 배양합니다.
   9. 마그네틱 랙에 비드를 펠릿화하고 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.
   10. 125μL의 Short Fragment Buffer(SFB)를 첨가하여 비드를 세척하고, 플릭으로 재현탁하고, 잠시 원심분리한 후 마그네틱 랙으로 되돌립니다.
   11. 구슬을 펠릿화하고 상청액을 흡인합니다. 세탁 단계를 한 번 반복합니다.
   12. 잠시 원심분리하고 튜브를 마그네틱 랙으로 되돌린 다음 잔류 상청액을 흡인합니다.
   13. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 15μL의 용출 완충액(EB)에 비드를 재현탁합니다.
   14. DNA를 용리하기 위해 잠시 원심분리하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   15. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용출액이 투명하고 무색이 될 때까지 비드를 펠릿화한 다음 용출액 15μL를 깨끗한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 흡인합니다.
   16. 용출액 1μL를 정량화합니다.
   17. 라이브러리를 20 fmol로 희석하고(NEB 계산기를 사용하여 계산) R10.4.1 플로우 셀에서 시퀀싱을 위해 준비된 20 fmol 라이브러리 중 12 μL를 사용합니다.
       참고: 라이브러리는 이제 -20°C에서 보관할 수 있어 반복적으로 사용할 수 있습니다.
4. 나노기공 시퀀싱 플로우 셀의 프라이밍 및 로딩
   1. 시퀀싱 버퍼(SB), 라이브러리 비드(LIB), 플로우 셀 테더(FCT) 및 플로우 셀 플러시(FCF)를 RT에서 해동하고 와류로 혼합한 다음 스핀다운합니다.
   2. 소 혈청 알부민 5μL(BSA, 50mg/mL), 플로우 셀 테더(FCT) 30μL, 플로우 셀 플러시(FCF) 1170μL를 결합하고 반전 및 피펫팅으로 용액을 혼합하여 플로우 셀 프라이밍 믹스를 준비합니다.
   3. 플로우 셀의 프라이밍 포트를 열고 ~20μL의 버퍼를 흡인하여 기포를 제거한 다음 기포를 도입하지 않고 프라이밍 믹스 800μL를 프라이밍 포트에 로드하고 5분 동안 기다립니다.
   4. 37.5 μL의 시퀀싱 완충액(SB), 25.5 μL의 라이브러리 비드(LIB) 또는 라이브러리 용액(LIS) 및 12 μL의 20 fmol DNA 라이브러리를 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브에 혼합하여 라이브러리를 준비하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다.
   5. 플로우 셀 샘플 포트 캡을 부드럽게 들어 올리고, 기포를 유입하지 않고 프라이밍 믹스 200μL를 프라이밍 포트에 로드하고, 로딩할 라이브러리를 준비하여 플로우 셀을 다시 프라이밍합니다.
   6. 준비된 라이브러리를 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 75μL의 라이브러리를 시퀀싱 플로우 셀 샘플 포트에 적가하여 다음 방울을 추가하기 전에 각 방울이 포트로 흐르도록 합니다.
   7. 플로우 셀 샘플 포트 캡을 닫고 마개가 플로우 셀 샘플 포트에 들어가는지 확인한 다음 프라이밍 포트를 닫습니다.
   8. 휴대용 시퀀싱 장치를 컴퓨터(무정전 전원 공급 장치 포함)에 연결하고 시퀀싱 장치 제어 및 분석 소프트웨어를 사용하여 시퀀싱을 시작합니다.
5. 소프트웨어 매개변수
   참고: ONT에서 개발한 이 소프트웨어 응용 프로그램은 시퀀싱 실행의 포괄적인 관리 및 세부 보고서 생성에 활용됩니다.
   1. 시퀀싱 프로세스를 시작하려면 시작 옵션을 선택한 다음 시퀀싱 시작을 선택합니다.
      참고: 그러면 파일 저장을 위한 폴더를 지정하고 시퀀싱 실행의 이름(예: "sequencing_run_1")을 제공하라는 메시지가 표시됩니다. 그런 다음 설정 계속 을 클릭하여 library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96과 같은 적절한 키트 이름을 선택하고 원하는 실행 시간(예: 20시간(최대 실행 시간은 72시간))을 사용자 지정합니다.
   2. 그런 다음 원시 출력 읽기의 경우 POD5, basecalled 출력의 경우 FASTQ와 같은 옵션 중에서 선택하여 출력 파일 형식을 선택합니다. 그런 다음 FAST-Basecalling 모델을 선택합니다.
   3. 일부 기본 설정에는 1.5시간마다 빈번한 기공 스캔, 최소 판독 길이 200bp, 최소 품질 점수 8이 포함됩니다. 마지막으로 설정을 검토하고 읽기 과정을 시작하세요.

3. 시퀀싱 후 분석

1. 시스템 요구 사항
   참고: ONT-TB-NF 파이프라인을 사용하여 환경을 설정하고 결 핵균 앰플리콘 시퀀싱 데이터를 분석하기 위한 가이드입니다. 이 지침은 Windows(WSL을 통해 ) 및 macOS 사용자 모두에게 적용됩니다.
   1. 다음을 사용하십시오. - 운영 체제: Windows 10/11(WSL2 포함) 또는 macOS; 메모리: 최소 8GB RAM(16GB 권장); 저장 공간: 최소 50GB의 여유 디스크 공간; 인터넷: 패키지 및 데이터 다운로드에 필요합니다. 권한: 소프트웨어를 설치하고 환경을 관리할 수 있는 기능.
2. Windows 사용자(WSL2 사용) 환경 설정을 확인합니다. WSL2를 사용하도록 설정합니다.
   1. PowerShell을 관리자 권한으로 열고 wsl - install을 실행합니다.
   2. 메시지가 표시되면 컴퓨터를 다시 시작합니다.
3. Ubuntu 설치
   1. 다시 시작한 후 Microsoft Store를 실행하고 Ubuntu를 검색한 다음 원하는 버전(예: Ubuntu 22.04 LTS)을 설치합니다.
   2. 시작 메뉴에서 Ubuntu를 시작합니다.
   3. 메시지가 표시되면 새 UNIX 사용자 이름과 암호를 만듭니다.
   4. 패키지 목록 업데이트: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
4. macOS 사용자
   1. Homebrew 설치(아직 설치되지 않은 경우): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
   2. 필수 패키지 설치: brew install git wget
5. Conda 또는 Mamba 설치
   1. Miniconda 다운로드 페이지를 방문하여 운영 체제에 맞는 설치 프로그램을 다운로드하십시오.
   2. Miniconda를 설치하려면 설치 프로그램을 실행하고 화면의 지시를 따르십시오. 설치가 완료되면 터미널을 다시 시작하십시오.
   3. Conda 채널 구성:
      conda config --add channels 기본값
      conda config --add channels bioconda
      conda config --채널 추가 conda-forge
   4. 맘바포지(맘바) 설치
      Linux의 경우:
      위젯
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      macOS의 경우:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
   5. Mambaforge 설치: bash Mambaforge-*.sh
   6. 프롬프트에 따라 설치를 완료하고 터미널을 다시 시작하여 Mamba를 활성화합니다.
6. ONT-TB-NF 파이프라인 설정
   1. 새 Conda 환경 만들기: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
   2. 또는 Mamba를 사용하십시오: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
   3. 환경 활성화: conda activate ont_tb_env
   4. Nextflow 설치: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
   5. ONT-TB-NF 리포지토리 복제: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
   6. 필요한 Docker 이미지 가져오기(Docker를 사용하는 경우)
      도커 풀 hkubal/clair3:v0.1-r12
      도커 풀 quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
7. 파이프라인 실행
   1. 다음 명령을 사용하여 각 샘플의 Basecalled FASTQ 파일을 독립적으로 연결합니다.
      고양이 *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow 실행 run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /경로/대상/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /경로/대상/amplicon_regions.bed \
      스레드 16 \
      output_dir /절대/경로/대상/output_directory
8. 출력 파일 및 해석
   1. 성공적으로 실행되면 파이프라인이 지정된 출력 디렉터리에 다음 출력을 생성하는지 확인합니다.
      1. 정렬된 읽기: *.bam 파일.
      2. 변형 호출: SNP 및 인델이 포함된 *.vcf 파일입니다.
      3. 요약 보고서: 약물 내성 돌연변이 및 기타 관련 메트릭을 요약한 *.csv 또는 *.tsv 파일입니다.
      4. 품질 관리 보고서: MultiQC와 같은 도구에서 생성된 *.htmL 파일.
      5. 로그: 파이프라인 실행에 대한 자세한 로그입니다.
      6. 중간 파일: work/ 디렉토리에 저장됩니다(성공적으로 실행한 후 삭제할 수 있음).
         참고: 권한 오류가 발생하는 경우 파일을 읽고 쓰고 스크립트를 실행하는 데 필요한 권한이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 환경 문제와 관련하여 파이프라인을 실행하기 전에 적절한 Conda 환경이 활성화되어 있는지 확인하십시오. Docker 프로필을 사용하는 경우 Docker가 설치되어 있고 작동하는지 확인해야 합니다. 또한 실행 중 메모리 또는 스토리지 제한을 피하기 위해 시스템 리소스를 꼼꼼하게 모니터링해야 합니다. 이러한 방법론에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

Results

선택한 DNA 추출 방법은 다른 신속한 기술에 비해 효율성과 우수한 수율을 고려하여 선택되었습니다. 고품질 게놈 DNA(gDNA)를 지속적으로 생산했으며, 비드 기반 정제 단계를 통합하여 처리 시간을 최소화하는 동시에 샘플당 비용을 절감하는 데 도움이 되었습니다. 이는 형광 측정법을 유일한 DNA 정량 도구로 사용하여 분광 광도계 측정과 같은 추가 품질 관리 평가의 필요성을 제거함으로써 달성되었습니다. PCR 후 농도는 짧은 판독 및 장기 판독 플랫폼 모두에서 시퀀싱에 최적인 것으로 밝혀졌습니다(표 2). 앰플리콘 무결성은 아가로스 겔 전기영동 을 통한 단편 분석을 통해 추가로 확인되었습니다(그림 2). 그러나, 분리주 89 및 136은 표 2 및 그림 2에...

Discussion

긴 판독 시퀀싱 플랫폼은 이 연구에서 주목할만한 이점, 특히 일관되게 높은 적용 범위로 신속한 시퀀싱을 달성하는 능력을 보여주었습니다. 성공적으로 시퀀싱된 모든 분리주에서 99.9%의 커버리지 폭이 달성되었으며, 이는 내성 관련 게놈 영역이 거의 완전하게 표현되었음을 나타냅니다. 모든 표적 유전자의 평균 커버리지 깊이는 4462X였으며, eis 유전자는 22,242.08X로 가장 높은 깊이를 보였고 rrs 유전자는 99.46X로 가장 낮았습니다. 이 값은 신뢰할 수 있는 약물 내성 예측을 위한 충분한 데이터를 생성하는 플랫폼의 능력을 반영합니다⁴.

DNA 추출에서 결과 생성까지의 워크플로는 중단을 제외하고 36시간 이내에 완료되었으며 짧은 판독 시퀀싱의 처리 시간과 호환되었습니다 ^4,23

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL & 1.5 mL 또는 2 mL 로-결합 튜브	에펜도르프	EP0030108051-250EA
1kb 래더	써모피셔 사이언티브	SM0311
2 mL 스크류 캡 튜브	사이언티픽 스페셜티즈 주식회사	P2TUB056C-0001.5ST
2mm 멸균 유리 구슬	시그마-올드리치	Z273627-1EA
AMPure XP 비드	벡먼 콜터	A63881
디플렉스 Myc-TB	제노스크린	20090205
전기영동실	써모피셔 사이언티브	A25977
에틸 알코올, 순수	시그마-올드리치	E7023-500ML
패스트프렙 호모제나이저	MP 생의학	116005500
필터 피펫 팁 (10 & micro; L)	바이오-스마트 사이언티브	FT-10-R
필터 피펫 팁(1000 & micro; L)	바이오-스마트 사이언티브	FT-1000-R
필터 피펫 팁 (20 & micro; L)	바이오-스마트 사이언티브	FT-20-R
필터 피펫 팁(200 & micro; L)	바이오-스마트 사이언티브	FT-200-R
Flow-cell	옥스퍼드 나노포어 테크놀로지	플로-민114
가열 블록	에펜도르프	5382000031
인스타진 매트릭스	바이오-래드	BBRD7326030
마그네틱 레일과 nbsp;	서모 피셔 사이언티픽	12321D
마이크로 원심분리기	에펜도르프와 nbsp;	5406000046
앞잡이	옥스퍼드 나노포어 테크놀로지	MK1B
네이티브 바코드 키트 V14	옥스퍼드 나노포어 테크놀로지	SQK-NBD114.24
NEB 블런트/TA 리가세 마스터 믹스	NEB	M0367
NEBNext 신속 연결 모듈	NEB	E6056
NEBNext 울트라 II 엔드 수리/dA-테일링 모듈	NEB	E7546
뉴클레아제 없는 물 (NFW)	써모피셔 사이언티브	AM9937
피펫 (P10, P20, P200 및 P1000)	에펜도르프	EP3123000918-1EA
큐빗 분석관	써모피셔 사이언티브	Q32856
Qubit dsDNA HS 분석 키트	써모피셔 사이언티브	Q33231
큐비트 형광도계	써모피셔 사이언티브	Q33226
SYBR 안전 DNA 젤 균주	써모피셔 사이언티브	S33102
울트라퓨어 아가로스	써모피셔 사이언티브	17852
범용 후드 III 트랜스빌리미네이터 (분자 이미저 젤 닥 XR 시스템)	바이오-래드	170-8170
보텍스 믹서	라섹	WMBB0L0E0216