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방법 논문

광합성 미생물 및 바이러스의 환경 샘플링: 현장에서 실험실까지

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

2025년 7월 3일

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 시아노파지(및 그 숙주)를 분리하기 위해 해양 및 담수 생태계의 유쾌한 영역에서 샘플링하는 방법과 단일 유전자형을 풍부하게 하고 바이러스-숙주 상호 작용 역학을 특성화하는 사후 샘플링 프로세스에 대해 설명합니다.

초록

광합성 미생물 및 그 바이러스에 대한 환경 샘플링은 현대 해양 및 담수 생물 다양성과 생태계 역학뿐만 아니라 기후 변화 관련 요인(예: 온도 상승 및 산성화)이 종 및 군집 구성의 진화 궤적에 미치는 영향을 이해하는 데 중요한 역할을 합니다. 불행히도 바이러스권의 다양성은 단일 범용 샘플링 및 실험 워크플로우를 지원하지 않습니다. 실제로 각 바이러스 시스템에는 고유한 기능이 있으며, 이를 위해서는 연구 목표를 달성하기 위해 바이러스학의 표준 프로토콜을 수정해야 합니다. 바이러스 발견 및 특성화에는 표적 시스템에 특이적인 접근 방식이 필요하지만, 모든 바이러스에 대한 연구 목표는 비슷합니다. 호스트 범위를 결정하십시오. 생산적인 감염을 확인하십시오. 바이러스, 숙주 및 바이러스-숙주 역학을 특성화합니다. 바이러스 숙주 시스템에 대한 강력한 설명은 형태학, 생리학, 생화학 및 오믹스 프로파일을 설명하는 것만으로 구성됩니다. 감염의 다양성, 온도, pH, 숙주 스위치, 유도 진화와 같은 요인을 변경하거나 바이러스-숙주 시스템 반응을 관찰하기 위한 약물 적용과 같은 요인을 변경하여 시스템을 조작하여 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 우리 실험실은 생명의 영역(고세균, 박테리아 및 진핵류)에 걸친 바이러스를 연구합니다. 이 보고서에서는 시아노박테리아의 박테리오파지(즉, 시아노파지)를 분리하는 데 중점을 두고 담수 및 해양 환경의 유광 구역에서 광합성 미생물을 샘플링하는 방법을 자세히 설명합니다. 시아노박테리아(Cyanobacteria)는 이러한 수생 생태계에서 1차 생산과 영양 순환에 중요한 핵심 종입니다. 설명된 워크플로우는 다양한 깊이에서 물을 샘플링하는 것부터 액체 및 고체 배지 배양, 고급 분자/유전 방법 및 분석 접근 방식을 사용하여 바이러스 숙주 시스템 기능을 특성화하는 것까지 확장됩니다. 설명된 방법은 생명 영역 전반에 걸쳐 바이러스 숙주 시스템에서 박테리오파지 및 바이러스 발견에 적용할 수 있습니다.

서론

시아노파지와 그 숙주의 감염 역학 및 진화적 관계를 특성화하는 것은 해양 및 담수 생태계의 현재와 미래 상태를 이해하는 데 중요합니다. 첨단 고처리량 염기서열분석 기술과 최신 분석 방법을 통해 시아노파지(및 숙주) 게놈의 신속한 염기서열분석을 통해 바이러스-숙주 관계를 연구할 수 있습니다 1,2. 그러나 워크플로우는 바이러스와 그 숙주를 격리하고 식별하기 위한 환경 샘플링으로 시작합니다 3,4,5. 바이러스권의 다양성으로 인해 모든 바이러스와 박테리오파지를 샘플링하고 특성화할 수 있는 단일 프로토콜은 없습니다. 실제로 각 바이러스 숙주 시스템에는 고유한 특성이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 기본 목표는 탐구 중인 바이러스 시스템에 관계없이 유사합니다: 바이러스 격리; 호스트 범위를 결정하십시오. 하나 이상의 숙주에서 생산적인 감염을 보여줍니다. 질적 및 정량적 접근 방식을 사용하여 바이러스, 숙주 및 바이러스-숙주 감염 역학을 특성화합니다. 바이러스 시스템에 대한 고급 이해는 시스템을 교란하여 검사할 수 있습니다. 감염의 다중성(Multiplicity of Infection)6, 온도, pH, 숙주 균주 또는 시스템이 어떻게 반응하는지 결정하기 위한 약물 적용과 같은 매개변수의 변화는 바이러스-숙주 역학의 특성에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다. 지시 진화(directed evolution)와 같은 보다 발전된 조작은 시스템의 잠재적인 진화 궤적과 공진화 종말점이 더 큰 미생물 군집과 생태계에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 추가 정보를 제공할 수 있습니다.

이 연구에서는 해양, 담수 및 기타 수생 생태계에서 영양 순환 및 1차 생산에 중요한 역할을 하는 시아노박테리아 및 미세조류와 같은 광합성 미생물의 환경 샘플링을 위한 모델(그러나 쉽게 적용할 수 있는) 프로토콜을 제시합니다 7,8,9,10,11 . 워크플로우는 해양 및 담수 환경의 유쾌한 지역과 이러한 생태계의 핵심 동인인 바이러스 및 박테리오파지로부터 숙주를 격리하는 데 초점을 맞춥니다12. 바이러스와 박테리오파지는 모두 진핵생물과 원핵생물 개체군 구조에 영향을 미치며 생태계 다양성과 생산성에 큰 영향을 미칩니다13. 따라서 여기서의 목표는 연구를 위한 숙주 및 바이러스의 농축을 용이하게 하는 샘플링 프로토콜 및 사후 샘플링 워크플로우를 제공하는 것입니다: 단일 바이러스/단일 숙주, 다중 바이러스/단일 숙주, 단일 바이러스/다중 숙주 및 다중 바이러스/다중 숙주 역학; -바이러스-숙주 감염 역학의 기저에 있는 오믹스 기질; 그리고 연구 중인 바이러스-숙주 시스템과 바이러스와 숙주가 추출된 더 큰 생태계에 영향을 미치는 잠재적인 공진화 궤적 및 진화적 종말점.

구체적으로, 환경 샘플링, 샘플의 현장 전처리(즉, 실험실에 도달하기 전), 박테리오파지(및 바이러스) 분리를 위한 후처리, 허용 숙주 식별을 위한 미생물의 혼합 종 배양 농축, 추정 숙주의 단일 군체 분리 개발, 진실성 확인을 위한 워크플로우를 설명합니다 바이러스-숙주 관계(즉, 생산적 감염) 및 기본 감염 특성(예: 독성)을 특성화합니다. 감염 분석은 상대 독성(VR)14 및 숙주 복원력(RR)15을 계산할 수 있을 뿐만 아니라 관찰된 생리학(즉, 바이러스-숙주 상호 작용 역학)의 기초가 되는 오믹스 기질을 조사하기 위해 주요 시점에서 배양 샘플을 추출하는 단계도 포함합니다. 마지막으로, 잠재적인 위험, 문제 해결 및 솔루션뿐만 아니라 특정 분류군을 대상으로 하도록 선택 단계를 수정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 워크플로우는 시아노파지-시아노박테리아, 파이코드나바이러스-미세조류 및 호열성 푸셀로바이러스-고세균 시스템16,17에 적용할 수 있으며, 박테리아, 진핵 및 고세균의 세 가지 생명 영역 모두에서 바이러스를 특성화하는 데 유용성을 입증합니다.

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프로토콜

1. 환경 샘플링

참고: 이 프로토콜은 남부 캘리포니아 해안의 해안선에서 5마일 이내의 행복 지대에서 광합성 미생물에 대한 해양 샘플링을 설명합니다. 그러나 이 프로토콜은 호수, 얼어붙은 호수 또는 지열 온천에서 샘플링하도록 조정되었습니다(그림 1).

  1. 남부 캘리포니아 해안선을 따라 연안에서 환경 샘플링
    참고: 이중 150hp 선외 모터가 장착된 6m, deep-V, 센터 콘솔 선박(즉, 보트)에 연구 장비(재료 표)가 적재되었습니다. 유포 존 샘플링을 위해 3개의 사이트가 선택되었습니다: (a) 사이트 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; (b) 사이트 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; (c) 사이트 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. 각 현장에서 정오에 20L의 물 샘플을 각 현장의 3개 깊이(< 3m(표면 샘플), 6m 및 14m)에서 추출했습니다.
    1. 이송 펌프 어셈블리: 각 샘플 사이트에 도달하면 보트 앵커를 배치하고 내비게이션 시스템의 GPS 좌표를 기록합니다. 샘플링 시스템을 조립합니다.
      1. 간단히 말해서 2.54cm ID flex-plus 파란색 PVC 튜브(50피트)의 한쪽 끝을 2.54cm 흡입 스트레이너에 장착하여 큰 파편이 펌프 시스템에 유입되는 것을 방지합니다. 덕트 테이프로 스트레이너-튜브 접합부를 고정합니다. 튜브의 반대쪽 끝을 1hp 스테인리스 스틸 이송 펌프의 흡기 매니폴드에 맞춥니다.
      2. 10cm ID 붕괴 방지 고무 플렉스 호스의 2.54피트 섹션을 펌프 배출구에 연결합니다. 이송 펌프 전기 코드를 가스 구동 3800W 인버터 발전기에 꽂습니다. 조립이 완료되면 이송 펌프를 프라이밍하고 펌프 시스템이 작동하는지 테스트합니다(그림 1, 맨 윗줄).
    2. 전사 튜브 가중: 길이 25m, 지름 1.25cm의 나일론 해양 로프의 한쪽 끝을 14kg 버섯 앵커의 구멍에 고정합니다. 덕트 테이프를 사용하여 흡입 스트레이너를 앵커 위로 약 3m 위로 설정하고 흡입 스트레이너를 파란색 PVC 튜브에 3m마다 고정하여 스트레이너가 모래에 들어가거나 수중 바위에 부딪히는 것을 방지합니다. 앵커를 사용하여 트랜스퍼 튜브(파란색 PVC 튜브)를 담그고 보트와 튜브 사이에 큰 각도를 만들어 부정확한 샘플 깊이를 제공하는 강한 저류를 방지합니다. 앵커/로프 및 튜브 어셈블리를 깊이까지 내립니다.
    3. 해수 추출 samples: 스트레이너가 있는 튜브 팁이 원하는 깊이에 도달하면 발전기와 펌프의 전원을 켭니다. 펌프를 다시 프라이밍하거나 이송 튜브를 흔들어 깊은 곳에서 펌핑을 시작할 수 있도록 합니다. 깊은 곳에서 일정한 물의 흐름이 옮겨지면 원하는 깊이의 물이 펌프를 통해 흐르도록 1-2개의 튜브 부피를 바다로 다시 배출합니다. 20L 물통에 물 샘플을 수집합니다(그림 1, 윗줄, 맨 오른쪽).
    4. 현장 스테이션으로의 샘플 운송: 물 샘플과 운송 중 헤드스페이스 사이의 가스 교환(예: O2/CO2)을 허용하기 위해 20L 물통을 약 18L로 채웁니다. 물 용기를 캡핑하기 전에 원수 샘플의 온도, pH 및 염도를 기록합니다. 그런 다음 서브 데크 저장소의 얼음 침대에 물병을 덮고 가벼운 시트로 덮어 햇빛과 고온에 과도하게 노출되지 않도록 합니다.
  2. 물 샘플의 현장 전처리
    참고: 육상 시설(예: 호텔 객실/회의실/현장 스테이션)에 도착하면 물 샘플 내의 미생물 함량을 보호하고 입자 크기에 따라 해수 샘플의 다른 분획을 분리하기 위해 일련의 전처리 단계를 수행했습니다.
    1. 여과 시스템 어셈블리: 1m 길이의 9.525mm ID 투명 비닐 튜브의 한쪽 끝을 휴대용 공기 다이어프램 진공 펌프의 진공 포트에 있는 호스 미늘 입구에 고정합니다. 동일한 호스의 반대쪽 끝을 1.0L, 0.45μm 필터 진공 컵 어셈블리에 고정합니다. 0.45μm 및 0.22μm 필터 컵 어셈블리를 모두 순서대로 사용하여 아래 설명된 대로 해수 샘플의 서로 다른 분획을 분리합니다.
    2. 시스템의 누출 또는 결함/찢어진 필터를 테스트하려면 0.45μm 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터 컵을 통해 0.25L의 해수를 여과합니다. 누출되지 않는 시스템은 해수 샘플이 완전히 여과되면 필터와 격자 사이의 흡입력을 보여줍니다.
    3. 0.45μm PES 멤브레인 필터 컵 어셈블리를 통한 여과: 광합성 미생물(예: 미세조류 및 시아노박테리아)을 분리하기 위해 2개의 1L 필터 컵(또는 4개의 500mL 필터 컵)을 사용하여 0.45μm PES 멤브레인 필터 컵을 통해 2L의 해수 샘플을 여과하는 것이 목표입니다. 모든 여과액 병에 필터 크기, 시료 채취 깊이, 날짜 및 샘플링 사이트 지정자를 적절하게 라벨을 부착합니다. 마지막으로 0.45μm 여과액이 들어있는 병의 뚜껑을 조이고 과도한 햇빛을 방지하기 위해 반투명 천이나 슬리브로 덮습니다.
      알림: 필터 컵의 필터가 건조되지 않도록 하십시오. 항상 필터에 얇은 액체 층을 유지하십시오. 필터는 생물학적 파편(예: 세포)을 축적합니다. 필터가 이물질로 막히면 컵 어셈블리의 나사를 조심스럽게 풀고 사용한 필터 컵을 따로 보관하되 막힌 컵을 버리지 마십시오. 새 0.45μm 필터를 부착하고 계속합니다.
    4. 0.22μm PES 멤브레인 필터 컵 어셈블리를 통한 여과: 대형 진핵 바이러스를 분리하려면 이전 단계(1.2.3단계)의 0.45μm 여과액 1L를 사용하고 0.22μm 필터 컵을 통해 여과합니다. 초여과액 병에 필터 크기, 시료를 채취한 깊이, 날짜 및 시료 채취 장소 지정자를 적절하게 라벨링합니다. 마지막으로 0.22μm 초여과액이 들어있는 병을 조이고 덮습니다 (0.45μm 여과액을 여과하여 함).
      알림: 필터 컵의 필터가 건조되지 않도록 하십시오. 항상 필터에 얇은 액체 층을 유지하십시오. 필터는 생물학적 샘플을 포함하는 생물학적 파편을 축적합니다. 필터가 막히면 컵 어셈블리의 나사를 풀고 사용한 필터 컵을 따로 보관하십시오. 막힌 컵을 버리지 마십시오. 새 0.22μm 필터를 부착하고 계속합니다.
    5. 0.45μm 필터에서 바이오매스 농축: 2개의 멸균 50mL 코니컬 폴리프로필렌 원심분리 튜브 각각에 여과액 48mL(0.22μm 여과)를 붓습니다. 멸균 메스를 사용하여 컵 어셈블리 내에서 소모된 0.45μm 필터의 가장 바깥쪽 가장자리를 따라 균일하게 절단합니다. 멸균 집게를 사용하여 바이오매스가 풍부하고 촉촉한 필터를 제거합니다. 반으로 자릅니다. 여과지의 절반을 하나의 50mL 원뿔형 튜브에 밀어 넣습니다. 필터 멤브레인의 두 번째 절반과 두 번째 튜브로 반복합니다. 튜브 캡을 조이고 투명 필름으로 고정합니다. 튜브에 라벨을 붙입니다.
    6. 0.22μm 필터에서 대형 바이러스 바이오매스 농축: 두 개의 멸균 15mL 코니컬 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 각각에 14mL의 초여과액을 붓습니다. 멸균 메스를 사용하여 컵 어셈블리 내에서 사용된 0.22μm 필터의 바깥쪽 테두리를 따라 자릅니다. 멸균 집게를 사용하여 바이오매스가 풍부하고 촉촉한 필터를 제거합니다. 반으로 자릅니다. 여과지의 절반을 말아서 15mL 원뿔형 튜브 중 하나에 삽입합니다. 필터 멤브레인의 두 번째 절반과 두 번째 15mL 코니컬 튜브에 대해 반복합니다. 튜브 캡을 조이고 투명 필름(예: 파라필름)으로 고정합니다. 각 튜브에 필터 크기(즉, 0.22μm), 부위, 깊이 및 날짜를 표시합니다.
    7. 실험실로 다시 배송하기 위해 나머지 0.45μm 여과액과 나머지 0.22μm 여과액을 보관하십시오. 각 수심 및 샘플링 사이트에 대해 이 전체 여과 프로세스(1.2.2-1.2.6단계)를 반복합니다.
      참고: Ultrafiltrate는 실험실에서 매체 베이스(천연 미네랄 및 기타 영양소 포함)로 사용됩니다.
      원시 샘플 현미경 검사(선택 사항): 0.45μm 필터가 들어 있는 50mL 코니컬 튜브 1개를 잡고 부드럽게 흔듭니다. 플라스틱 스포이드(또는 피펫터)를 사용하여 50mL 원뿔형 튜브에서 30-50mL의 바닷물을 채취하고 샘플과 커버 슬립이 포함된 유리 현미경 슬라이드를 준비합니다. 필드 현미경과 컴퓨터를 사용하여 현미경 슬라이드 내용을 보고 관찰된 미생물의 특성을 검출하고 기록합니다(그림 2D).

2. 바이러스/박테리오파지를 농축하고 숙주를 풍부하게 하기 위한 시료 처리

참고: 이 프로토콜은 샘플이 현장 현장에서 실험실에 도착한 후 필요한 첫 번째 처리 단계를 설명합니다. 비행기 운송과 도로 운송 수단의 경우 다른 고려 사항이 필요할 수 있습니다. 온도, pH, 염도, 빛에 대한 노출 또는 노출 부족, 용존 가스(예: CO2 및 O2) 농도, 환경 추출과 실험실 처리 사이의 시간의 급격한 변화에 따라 환경 시료 생존율이 감소합니다.

  1. 스핀 농축 및 저장 바이러스 및 박테리오파지
    참고: 샘플이 실험실에 도착하면 도착 후 8시간 이내에 처리하면 샘플 사이트 추출과 실험실 도착 사이의 시간 경과로 인해 생존 가능한 미생물의 손실을 최소화할 수 있습니다. 아래 제공된 단계는 장기 보관 및 사용을 위해 농축된 박테리오파지(또는 바이러스) 현탁액(즉, 작업 재고)의 부분 표본을 제공합니다.
    1. 농축 초여과액: 현장별 각 샘플링 깊이에 대해 나머지 ~800mL의 초여과액을 실험실로 배송합니다. 3K NMWL 15 mL 원심 스핀 필터와 6000 x g 에서 10-20분 동안 원심분리를 사용하여 50-100 mL의 초여과액을 1.0-1.5 mL까지 농축합니다. 앞서 설명한 바와 같이 TEM 이미징을 위한 그리드를 준비합니다16 생성된 농축된 초여과액에 바이러스 유사 입자(VLP)가 있는지 여부를 평가합니다. VLP가 검출되면 농축액을 100mL 부분 표본으로 나눕니다. 4 °C(또는 장기 보관의 경우 -20 °C)에서 보관하십시오.
    2. 0.22μm 필터의 입자 응집: 멸균 메스를 사용하여 0.22μm 필터의 파편을 필터가 운반된 50mL 튜브 내의 초여과액으로 부드럽게 긁어냅니다. 10K NMWL 스핀 농축기 컵 어셈블리를 사용하여 50-200mL의 현탁액을 ~3mL의 샘플 잔류물 부피까지 농축합니다. 앞서 설명한 바와 같이 TEM 이미징을 위한 그리드를 준비합니다16 0.22μm 필터의 표면에 포착되었을 수 있는 0.45μm 여과액의 VLP가 있는지 확인합니다. VLP가 검출되면 농축액을 100mL 분취액으로 나누어 4°C(또는 장기 보관의 경우 -20°C)에서 보관합니다.
  2. 0.45μm 필터의 스핀 농축 및 농축 잔류물.
    참고: 미생물의 혼합 배양액에는 위에서 분리된 바이러스 및 박테리오파지의 숙주가 포함될 수 있습니다(단계 2.1.1 및 2.1.2). 혼합 배양의 스핀 농도 및 농축은 추정 숙주의 순수 배양을 개발할 수 있는 작업 재고를 제공합니다(3단계 참조).
    1. 혼합 현탁액 농축: 현장별 각 샘플링 깊이에 대해 세포 파편이 포함된 0.45μm 필터와 함께 ~100mL의 초여과액을 실험실로 반송합니다. 멸균 메스를 사용하여 0.45μm 필터의 파편을 운반된 50mL 튜브의 초여과액으로 긁어냅니다. 2000 x g 에서 10분 동안 시료를 원심분리, 4°C에서 바이오매스를 펠릿화합니다. 펠렛을 5mL의 1:8 희석된 BG-11 배지18 에 피펫으로 부드럽게 분쇄하여 재현탁합니다.
    2. 0.45μm 필터의 농축 잔류물: 50mL의 BG-11 배지(3개 플라스크)와 시료 부위의 초여과액(40mL) 및 BG-11(10mL)의 혼합물을 포함하는 250mL 당황한 삼각 플라스크에 6개의 병렬 배양을 준비합니다. 각 플라스크에 농축액 0.5mL를 접종합니다(2.2.1단계 기준). 광도가 20-40mmol photons/m2/s로 설정된 25°C에서 최소 7-10일 동안 광생물반응기에서 가벼운 진탕으로 배양합니다.19 성장이 견고하면(예: OD730nm = 0.8) 2000 x g, 10분, 4°C에서 펠릿으로 원심분리합니다. 펠릿을 10mL의 1:8 희석 BG-11 배지에 피펫으로 부드럽게 분쇄하여 재현탁합니다. -80 °C 보관을 위해 스크류 캡 극저온 튜브에 0.5 mL 세포 현탁액 10-20개 부분 표본을 준비합니다.

3. 미생물 숙주의 단일 유전자형 순수 배양 개발

참고: 이 프로토콜은 수집된 환경 샘플에서 처리된 혼합 배양물에서 바이러스 및 박테리오파지에 대한 추정 미생물 숙주를 분리하고 정제하는 절차를 설명합니다. 여러 숙주 표현형을 분리 및 정제할 수 있으므로 저장된 물 샘플에 존재하는 바이러스 및 박테리오파지에 대한 허용 숙주를 검출할 확률을 높일 수 있습니다(단계 2.1.1-2.1.2).

  1. 줄무늬 플레이트 및 단일 콜로니 분리물 선택
    참고: 환경 샘플링 중에 포획된 바이러스 또는 박테리오파지의 민감하고 허용적인 숙주를 분리할 확률을 높이고 바이러스 및 박테리오파지의 숙주 범위를 조사하기 위해 혼합 배양에서 다중 단일 유전자형 순수 배양이 개발됩니다.
    1. 아래 설명된 대로 단일 콜로니 분리물(SCI)을 개발합니다.
      1. BG-11 한천 플레이트준비 20. 얼음 위에서 해동하고, -80 ° C에서 보관 된 혼합 현탁액의 분취액 1 개를 (2.2.2 단계에서). 멸균 루프를 사용하여 표준 기술20을 사용하여 BG-11 한천 플레이트에 세포 농축액을 줄무늬로 만듭니다. 25 ° C에서 20-40 mmol photon / m2 / s의 광도에서 광도로 ~ 10 일 동안 광생물 반응기에서 줄무늬 플레이트를 배양하거나 플레이트에 콜로니가 나타날 때까지 배양합니다.
      2. 5mL의 BG-11 배지 및/또는 샘플 부위와 BG-11의 초여과액 혼합물 5mL를 사용하여 20mL 배양 튜브에서 ~10개의 종자 배양을 준비합니다. 멸균 이쑤시개로 플레이트에서 SCI를 선택하고 각 튜브에 이쑤시개를 하나씩 떨어뜨려 각 튜브를 개별적으로 접종합니다. 광도가 20-40mmol photon/m 2/s로 설정되고 광도가 20-40mmol photon/m2/s로 설정되고 성장이 감지될 때까지(예: OD730nm = 0.4-0.8) 광생물반응기에서 최소 10-15일 동안 광생물반응기에서 가벼운 진탕으로 배양합니다.
        참고: 첫 번째 줄무늬 플레이트에 여러 콜로니 표현형(예: 형태, 투명도, 색상)이 있는 경우 다양한 콜로니 표현형에서 접종할 개별 콜로니를 선택합니다.
    2. 작업 어종의 순수 배양 개발: 긍정적인 종자 배양 성장이 감지되면 플레이트에 단일 콜로니 표현형만 나타날 때까지 줄무늬 절차를 반복합니다(그림 3B 및 그림 4B). 위에서 설명한 대로 250mL 배플 플라스크(그림 3C 및 그림 4C)에서 종자 배양을 50mL 배양으로 업스케일링합니다(단계 2.2.2). -80 °C 보관을 위해 0.5 mL의 SCI 세포 현탁액 및 피펫 0.5 mL의 분취액을 1.0 mL 스크류캡 크라이오튜브에 ~20개 준비합니다.
      참고: 시아노박테리아의 순수 배양을 개발하려면 배양 오염을 줄이기 위해 항생제 또는 항진균제(예: 이미페넴, 시클로헥시미드)가 필요할 수 있습니다21. 도금 절차는 시아노박테리아 또는 미세조류의 분리를 목표로 할 수 있는 피벗 포인트입니다. 배양 중 광 매개변수는 광도 또는 온-오프 주기 측면에서 달라질 수 있습니다.
  2. 단일 유전자형 특성화 및 작업 재고 저장
    참고: 개별 추정 숙주 유전자형의 분리 및 농축을 확인하기 위해 순수 배양은 형태학적, 유전적으로 특성화됩니다.
    1. 형태학적 특성화: 액체 배양 및 고체 매체 플레이트 작업의 주기로 인해 단일 세포 표현형이 생성되면 광학 현미경(그림 2A-C)과 투과 전자 현미경(TEM) 및/또는 주사 전자 현미경(SEM; 그림 3A 및 그림 4A). 광학 현미경 (예 : 60x-100x 배율)에서 녹색, 연한 갈색 또는 투명한 단세포, 집락, 필라멘트, 나선, 분지 또는 삼체 세포 조직이 관찰 될 수 있습니다. 이것은 가능한 분류 학적 할당을 나타냅니다.
    2. 유전적 특성화: 추정되는 순수 배양물에서 DNA를 추출한 후 부분 게놈 염기서열분석을 통해 단일 미생물 유전자형의 분리를 검증합니다. 시아노박테리아에서 16S rRNA 유전자는 종종 표적입니다(그림 5A)22. 16S 계통발생학적 분석은 분류학적 분류를 식별할 수 있다22. 미세조류에서 18S rRNA는 종종23을 표적으로 합니다. 관심 있는 분리물 또는 새로운 분리물의 경우 전체 게놈 염기서열분석을 추구할 수 있습니다.

4. single-genotype virus/bacteriophage suspensions 개발

참고: 이 프로토콜은 환경 샘플에서 여러 단일 유전자형 바이러스 및 박테리오파지 현탁액을 분리 및 정제하는 절차를 설명합니다.

  1. VLP 농축액의 희석 및 TEM
    참고: TEM 및 플레이트 기반 플라크 분석법 24을 사용하여 VLP가 숙주 세포를 감염시키는 진정한 박테리오파지(또는 바이러스)임을 확인할 수 있습니다.
    1. 여과액의 투과 전자 현미경(0.45 μm 및 0.22 μm): 원수 샘플의 0.45 μm 및 0.22 μm 여과 농축액(2.1 단계 참조)을 사용하여 TEM 그리드16 및 이미지를 준비하여 바이러스 입자 이질성(즉, 형태형의 다양성)을 검사합니다. 30%-50% 농도를 달성하기 위해 후속 단계를 완료하기 전에 높은 농도(예: 90%)를 가진 그리드를 생성하는 샘플을 희석합니다. 수동 입자 계수 또는 이미징 소프트웨어의 사용은 그리드에서 세포 포화도를 추정하는 데 사용될 수 있습니다.
      참고: 그리드의 높은 밀도는 선택될 수 있는 개별 플라크가 출현하는 대신 단단한 미디어 플레이트에서 호스트 잔디를 청소하는 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 플라크 분석 전에 샘플을 희석하면 시간을 절약할 수 있습니다. 대안적으로, VLP 농축액의 연속 희석액을 사용하여 숙주-바이러스 상호작용에 대해 여러 숙주 잔디 판을 테스트할 수 있습니다.
    2. 숙주 잔디에서 박테리오파지(또는 바이러스) 활동 감지: BG-11 한천 플레이트에서 작업 재고에서 시아노박테리아(또는 미세조류)의 추정 숙주 잔디를 성장시킵니다(단계 3.1.2). 4.5mL의 배지에 0.5mL의 VLP 현탁액을 잔디밭에 피펫팅하고(그림 6A, 왼쪽) 잔디밭 전체 표면이 현탁액으로 코팅될 때까지 부드럽게 소용돌이칩니다. 25 ° C에서 20-40 mmol photons/m2/s의 광도에서 3-10일 동안 광생물반응기에서 또는 플레이트에 플라크가 보일 때까지 배양합니다(그림 6A, 오른쪽).
  2. 플라크를 긁어내고 단일 유전자형 바이러스 또는 박테리오파지 현탁액 발병
    참고: 개별 플라크 표현형을 스크랩하고 숙주의 액체 배양액에서 박테리오파지를 전파함으로써 진정한 숙주-박테리오파지(또는 숙주-바이러스) 상호 작용이 확인되어 감염 분석을 위한 박테리오파지(또는 바이러스) 작업 원료를 개발할 수 있습니다. 박테리오파지(또는 바이러스)의 작업 원료는 정의된 감염 다중성(MOI)에서 감염 분석을 진행하기 위해 여러 방법(예: qPCR, 플라크 분석) 중 하나로 적정해야 합니다.
    1. 하나의 박테리오파지(또는 바이러스) 유전자형 분리 및 증식: 플레이트에서 개별 플라크가 보이면(VLP 농축액의 적절한 희석으로 인해) 멸균 루프를 사용하여 단일 플라크를 긁어냅니다. 숙주의 10mL 종자 배양에서 루프를 소용돌이칩니다(그림 6B, 왼쪽). 광생물반응기에서 광도가 20-40mmol photon/m2/s로 설정된 광도에서 3-10일 동안 3-10일 동안 광생물반응기에서 가벼운 진탕(예: 70-120rpm)으로 배양하거나 OD730nm 가 떨어지거나 세포 파편이 튜브 바닥에서 감지될 때까지 배양합니다(그림 6B, 오른쪽)25.
      참고: 숙주 잔디밭에 플라크가 형성되지만 액체 배양에서 감염 징후가 없는 경우, 플라크는 박테리오파지(또는 바이러스)가 아닌 박테리오신26 에 의해 형성되었을 수 있습니다. TEM은 박테리오파지(또는 바이러스) 감염에 의한 세포 사멸을 표시하여 플레이트 분석을 지원할 수 있습니다.
    2. 박테리오파지(또는 바이러스) 작업 원료에 대한 역가 정량화: 박테리오파지(또는 바이러스) 분리는 위에서 설명한 여과 및 스핀 농축 방법을 사용하여 달성됩니다. 연속 희석 플라크 분석을 통한 박테리오파지(또는 바이러스) 현탁액에 대한 역가를 정량화합니다27. 또는 DNA 추출 및 전체 바이러스 게놈 염기서열분석 및 계통발생학(그림 5B)을 수행하여 박테리오파지의 qPCR 기반 적정을 수행하기 위한 프라이머를 개발하고 후속 감염 분석을 위한 작업 재고를 설정합니다.
      참고: 단일 박테리오파지(또는 바이러스) 유전자형의 증식은 역가 또는 작업 원료 부피가 실험적 요구에 비해 너무 낮은 경우 50mL 또는 100mL 배양으로 확대될 수 있습니다. 바이러스 숙주 시스템의 특성(예: 높은 독성 또는 낮은 독성), 감염 분석을 위해 계획된 감염의 다양성(MOI), 박테리오파지(또는 바이러스)의 작업 재고를 개발할 때 프로젝트를 위해 얼마나 많은 감염 분석을 완료할 것인지를 고려합니다. 바이러스 재고를 해동하고 다시 동결하는 것은 바람직하지 않습니다. 각 실험에 대해 동일한 역가에서 동일한 제제의 복제물에서 하나의 전체 바이러스 스톡을 해동하고 사용합니다. 전기 분무 이온화/질량 분석법(ESI/MS)28을 포함하여 설명된 방법을 보완할 수 있는 다른 역가 기법이 있습니다.

5. 감염 분석

참고: 이 프로토콜은 숙주-파지(또는 숙주-바이러스) 감염 분석을 설명하는 데 사용되며, 고체 배지에서 독성, 숙주 범위 및 감염 표현형(복제 전략의 지표)을 질적으로 특성화합니다. 액체 배양에서 성장 역학, 바이러스 독성14 및 숙주 복원력15 를 정량적으로 평가합니다.

  1. 고체 배지에서 상대적 박테리오파지(또는 바이러스) 독성 및 숙주 범위 측정
    참고: spot-on-lawn 분석, single-plate serial dilution plaque 분석 및 숙주 내성 플레이트 분석을 포함한 모든 고체 매체 분석은 바이러스 독성, 숙주 범위 및 복제 전략과 같은 박테리오파지 숙주 감염 매개변수에 대한 정성적 데이터를 제공합니다. 액체 배양 성장 분석을 통해 바이러스-숙주 역학에 대한 보다 정량적인 측정과 모델링을 수행할 수 있습니다.
    1. Spot-on-lawn assay: 숙주 범위를 결정하려면 환경 샘플 또는 다른 실험실 또는 배양 컬렉션에서 얻은 균주에서 분리된 여러 추정 숙주의 잔디밭을 준비합니다. 잔디밭에서는 피펫으로 잔디밭에 2μL의 박테리오파지(또는 바이러스) 현탁액을 찾아냅니다. 동일한 플레이트의 별도 영역에서 동일한 부피의 Triton X-100 및 나노 퓨어(18MW) 물을 각각 양극 및 음성 대조군으로 발견합니다16. 박테리오파지의 숙주 범위를 평가하기 위해 여러 숙주에서 주어진 박테리오파지(또는 바이러스)로 여러 잔디밭 현장 분석을 수행합니다16. 플라크 표현형은 박테리오파지(또는 바이러스) 복제 전략에 대한 통찰력을 제공합니다. 경계가 날카롭고 한천까지 맑은 플라크는 용해 복제를 나타내는 반면, 확산 테두리 또는 후광이 있는 플라크는 비용해성 복제를 나타낼 수 있습니다16,17.
      참고: 또는 단일 플레이트 연속 희석 플라크 분석은 플라크 크기와 박테리오파지 역가 사이에 선형 관계가 있는지 여부를 나타냅니다. 접시 뒷면에 있는 마커를 사용하여 접시를 격자 또는 파이 섹션으로 분할합니다. 그런 다음 동일한 부피(즉, 2mL)를 사용하되 박테리오파지 현탁액을 희석하여(예: 1:1, 1:4, 1:16, 1:64) 단일 호스트 플레이트에서 spot-on-lawn 분석을 수행합니다.
    2. 숙주 저항성 분석: 박테리오파지 제품군이 주어진 숙주에서 감염을 일으킬 수 있는지 여부를 확인하려면 위에서 설명한 대로 접시에 숙주 잔디를 준비합니다. 접시 뒷면에 있는 마커를 사용하여 접시를 격자 또는 파이 섹션으로 나눕니다. 그런 다음 Triton X-100과 나노순수를 대조군으로 사용하여 각 박테리오파지(또는 바이러스) 현탁액 2mL를 그리드(또는 파이)의 한 섹션에 배치합니다. 모든 박테리오파지(또는 바이러스) 현탁액이 동일한 역가에서 추가되는 경우, 숙주에서 박테리오파지 균주(또는 바이러스) 간의 상대적 독성을 정성적으로 평가합니다(즉, 더 큰 플라크 = 더 독성이 높은 바이러스).
  2. 액체 배양 감염 분석에서 독성, 복원력 및 성장 정량화
    참고: 초기 정성적 결과는 특정 박테리오파지-숙주 쌍을 표적으로 하고 바이러스-숙주 상호 작용 역학에 대한 보다 정량적인 분석을 수행하기 위한 기초를 제공합니다. 액체 배양에서는 감염된 숙주 성장 곡선이 생성되어 감염되지 않은(대조군) 숙주 성장과 비교됩니다.
    1. 아래 설명된 대로 액체 배양 단일 바이러스/단일 숙주 감염 분석을 수행합니다.
      1. 고체 매체 플레이트 분석(단계 5.1)에 의해 감수성 및 허용으로 입증된 미생물(예: 시아노박테리아)의 병렬 액체 배양(~6-12)을 1.0 L(배양 320mL), 500mL(배양 160mL) 또는 250mL(배양 80mL) - 앞서 설명한 바와 같이 배플 배양 플라스크17. 사전 정의된 시점(일반적으로 0.5 또는 1 숙주 배가 시간)에서 사용 가능한 작업 재고 역가를 사용하여 사전 선택된 감염 다중성(MOI)을 생성하는 데 필요한 적절한 부피를 사용하여 등가 세포 밀도(예: OD730nm = 0.08)로 병렬 배양의 하위 집합을 박테리오파지 현탁액으로 3회 접종합니다.
      2. 다른 병렬 배양물(역시 3중)을 접종하지 않은(즉, 감염되지 않은) 대조군으로 둡니다. 선택적으로, 선별된 박테리오파지-숙주 쌍 간의 비교를 위해 다른 박테리오파지(또는 바이러스) 균주로 세 번째 병렬 배양 세트를 접종합니다. 광도를 20-40mmol photons/m2/s로 설정하고 25°C에서 3-10일 동안 광생물반응기에서 배양물을 성장시킵니다.
      3. 박테리오파지 감염 및 비감염(대조군) 배양물에서 일정한 시간 간격(예: 8시간)으로 OD730nm 판독값을 취하여 숙주 성장 곡선을 생성합니다(그림 7A). 감염되지 않은 대조군 배양(그림 7C) 및 숙주 세포 배양에서 생산적인 감염(그림 7D)에 대한 TEM 검증을 사용합니다. 세포병성 효과(cytopathic effect)29,30는 대부분의 감염된 세포에서 쉽게 관찰할 수 있는 반면, 감염되지 않은 세포는 형태학적 변형이나 스트레스의 징후를 보이지 않습니다.
    2. 액체 배양 감염 분석을 위한 기본 분석: 단일 바이러스/단일 숙주(SVSH) 액체 배양 감염 분석에서 최대 비성장률(최대 μ)31, 상대 박테리오파지(또는 바이러스) 독성14 및 상대 숙주 복원력15와 같은 몇 가지 기준선 지표를 도출할 수 있으며, 박테리오파지 숙주 또는 바이러스-숙주 역학에 대한 보다 정량적인 설명을 제공합니다(그림 7B). 보고 가능한 표준 지표에는 감염되지 않은 숙주 대조군 및/또는 동일한 숙주에 있는 별도의 박테리오파지와 비교한 성장률(종종 최대 비성장률 또는 μ최대로 보고됨) 및 상대 독성(VR)14이 포함됩니다. 시스템 운반 능력(N점근선) 및 호스트 상대 복원력(R, R)15과 같은 다른 메트릭도 보고될 수 있습니다.

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결과

휴대용 가솔린 동력 발전기, 물 전달 펌프 및 붕괴 방지 튜브를 사용하면 선택한 깊이에서 바다, 호수, 얼어붙은 호수 및 기타 수생 환경(예: 석호)에서 물 샘플을 추출하는 효과적인 방법으로 사용할 수 있습니다(그림 1, 상단 3줄). pH < 4와 90°C 이상의 온도를 특징으로 할 수 있는 지열 온천, 수영장 및 진흙 냄비의 고온 산성수에는 대체 장비가 필요합니다. 250mL 병 또는 50mL 원뿔형 튜브를 담을 수 있는 고정 장치가 있는 긴 대나무 막대 또는 텔레스코핑 알루미늄 수영장 세척 막대를 사용하여 이러한 극한 환경에서 물 샘플을 추출할 수 있습니다(그림 1, 맨 아래 줄). 모든 경우에 온도, pH, 염도 및 GPS 좌표를 포함하여 물 샘플에 대한 기준 데이터가 기록됩니다. (그림 1, 맨 아래...

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토론

바이러스권은 방대하고 다양하기 때문에 다양한 바이러스 시스템을 연구하기 위해 다양한 실험적 접근 방식이 필요합니다. 여기에는 다양한 환경에서 바이러스와 숙주를 분리하기 위한 다양한 전략과 다양한 처리 방법이 포함되어 원시 샘플에서 숙주와 바이러스의 순수한 배양을 생산할 수 있습니다. 이러한 순수 배양액은 고체 배지와 액체 배양 모두에서 SVSH 감염 분석에 사용할 수 있으므로 바이러스 숙주 역학의 시스템 특징 및 정량적 분석을 달성할 수 있습니다. 이 보고서에서는 바다, 호수, 얼음으로 덮인 호수 아래의 물 및 기타 수생 환경(예: 지열 수영장 및 온천)에서 샘플링할 수 있는 표준적이지만 수정 가능한 워크플로를 설명합니다. 워크플로우에는 실험실로 다시 배송하기 전에 현장에서 샘플을 사전 처리하는 방법에 대한 세부 정보가 포함되어 있으며, 이는 생존 가능한 미생물총(microbiota)이 보다 자세한 분석을 위해 실험실로 다시 돌아갈 수 있도록 하는 데 중요합니다. 다양...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립과학재단(NSF) OISE 보조금 번호 1856091(PI-Ceballos) 및 NSF DBI 보조금 번호 2119968(PI-Ceballos)의 일부 자금 지원을 받았습니다. 저자는 환경 샘플링을 위한 비디오 촬영과 현장 지원을 각각 제공한 King Mongkut's University of Technology Thonburi(태국)의 Chinnapong Wangnai 박사와 Chakrit Tachaapaikoon 박사의 공헌을 인정합니다. 저자는 또한 코스타리카 국립 공원에서 표본 추출 허가를 확보하고 지열 수영장에서 표본 채취를 지원하는 데 도움을 준 코스타리카 과나카스테 대학의 호르헤 아르만도 레이바 사나브리아 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 남부 캘리포니아 해안과 미네소타 북부의 호수에서 각각 샘플링을 도운 Enrique Marroquin, Jr.(University of California Merced)와 Alexia Maceda(University of Maine, Orono, ME, USA)에게 감사를 표합니다. 저자는 φSBL14-SWII 데이터 세트에 대한 감염 매개변수를 계산한 Ms. Socheata Hour의 기술 지원에 감사와 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 hp 스테인레스 스틸 이송 펌프 Utilitech, 샬럿, 노스캐롤라이나, 미국해당 사항 없음
1.5ml 튜브www.eppendorf.com30123611
10K NMWL 센트리콘 플러스 70 스핀 농축기 www.sigmaaldrich.comUFC701008
250mL 배플 삼각 플라스크 www.sigmaaldrich.comCLS4450250
3800와트 인버터 발전기 WEN Products, 미국 일리노이주 웨스트 던디웬 56380i
3K NMWL 아미콘 15mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
500mL 배플 삼각 플라스크 www.sigmaaldrich.comCLS4450500
5갤런 물병 www.homedepot.com해당 사항 없음
길이 80피트, 0.5" 직경, 나일론&NBSP;https://facomex.mx/producto/combo/해당 사항 없음
26피트 딥 V 센터 콘솔 Sailfish 2660, 2개의 Yamaha 150hp 선외기 https://yamahaoutboards.com/해당 사항 없음
암모늄 아세테이트(CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
붕산(H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
염화칼슘 이수화물(CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
원심분리기 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
구연산(C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
질산코발트(II) 육수화물 [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
붕괴 방지 고무 플렉스 호스 swanhose.comCELTF58050
황산구리(II) 오수화물(CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
코닝 50mL 원심분리기 튜브 www.sigmaaldrich.comCLS430291
인산이칼륨(K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
디소듐 에틸렌디아민테트라아세트산(Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume 및 분광 광도계 및 플로로미터www.denovix.com해당 사항 없음
덕트 테이프 www.homedepot.com해당 사항 없음
Eppendorf 튜브www.sigmaaldrich.comEP022364120
에탄올www.sigmaaldrich.com64175
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
구연산철 암모늄(C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
플렉스 플러스 블루 PVC 튜브 www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - 쌓을 수 있는 인큐베이터 셰이커www.eppendorf.com2231001081
LVEM5 탁상용 전자 Microscope_Transmission 전자 현미경(TEM)delongamerica.com해당 사항 없음
황산마그네슘 칠수화물(MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
염화망간(II) 사수화물(MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
버섯 앵커 블랙 비닐 코팅/30 lbswww.homedepot.com해당 사항 없음
페트리 접시, 폴리스티렌www.sigmaaldrich.comP5481
0.22 mm의 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터 컵www.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
0.45mm의 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터 컵www.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
칼륨 에틸 크산토겐산(C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
탄산나트륨(Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
도데실 황산나트륨 [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
몰리브덴산나트륨 이수화물(Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
질산나트륨(NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰 아시(TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
트리톤 X-100 www.sigmaaldrich.comT8787
트리즈마 염산염(Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
진공/압력 펌프 콜-파머; 미국 일리노이주 버논 힐스EW-79204-00
비닐 튜브 www.homedepot.com해당 사항 없음
황산아연 칠수화물(ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

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