Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

요약

이 프로토콜은 광학 투명화(optical clearing)와 면역 라벨링(immunolabeling)을 결합하여 전체 마운트 망막 오가노이드의 전체 볼륨 컨포칼 이미징을 제공합니다. 3D 구조를 보존하여 주요 신경 경로를 자세히 시각화할 수 있으며, 망막 성숙, 공간 조직, 질병 모델링 및 개인 맞춤형 의학에서의 잠재적 응용에 대한 연구를 개선합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기세포에서 유래한 망막 오가노이드는 인간의 망막을 모방한 복잡한 3D 구조로, 망막 발달, 질병 메커니즘 및 잠재적 치료 전략을 연구하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 또한, 환자에서 유래했기 때문에 맞춤형 의학을 위한 도구로서 큰 가능성을 가지고 있어 점점 인기를 얻고 있습니다. 기존의 2D 세포 배양과 달리 망막 오가노이드는 망막의 기본 3D 구조를 보존하여 보다 사실적인 표현을 가능하게 하고 생리학적으로 더 관련성 있는 연구를 가능하게 합니다. 그러나 구조적 복잡성, 높은 세포 밀도 및 다양한 구성은 특성화에 상당한 어려움을 제시합니다.

이러한 문제를 해결하고 3D 컨텍스트를 유지하면서 망막 오가노이드 성숙에 대한 이해를 높이기 위해 광학 투명화 방법과 면역 라벨링을 결합하여 컨포칼 현미경으로 전체 마운트 오가노이드의 전체 구조를 시각화했습니다. 이를 위해 low-aperture 및 high-numerical-aperture objectives와 호환되는 clearing method를 사용하여 전체 볼륨 이미징을 용이하게 하고 세포 해상도로 특정 관심 영역을 캡처했습니다. 이 접근 방식을 사용하여 우리는 시각적 정보 전달을 담당하는 세 가지 주요 뉴런 경로, 즉 원뿔 및 간상 광수용체, 양극성 및 신경절 세포의 형태와 분포를 3D로 확인했습니다. 우리의 연구 결과는 오가노이드 내 망막 세포의 공간적 조직을 다루기 위한 시각화 기술에 대해 더 많은 것을 밝혀주었습니다.

서론

망막 오가노이드

망막 오가노이드는 인간의 망막을 모방한 복잡한 3D 구조로, 망막 발달, 질병 메커니즘 및 잠재적 치료 전략을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다¹. 그들은 망막의 자연스러운 3D 구조를 유지하고, 전사체 충실도와 기능적 능력을 보여주며, 광전달과 시냅스 연결성을 재현합니다². 또한, 이들은 in vivo development ^3,4를 밀접하게 모방하여 편평한 세포 배양에 비해 보다 사실적인 표현을 가능하게 합니다. 이전 연구에서 Isla-Magrané 등은 개발 중인 인간 눈의 세포 특징을 모델링하기 위해 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 유래한 다안구 오가노이드를 얻기 위한 2단계 프로토콜을 확립했습니다 ^5,6. 태아 조직의 부족으로 인해 인간의 눈 발달 연구는 해부학 연구로 제한되었습니다.

이 프로토콜로 얻은 망막 오가노이드는 적절한 층을 보였으며 광수용체, 양극성 세포, 신경절 세포, 무축삭 및 수평 세포, 거대아교세포와 같은 모든 주요 망막 세포 아형과 함께 주요 형태학적 특징과 올바른 공간 조직 및 연결을 포함했습니다. 오가노이드 모델은 잠재적인 솔루션이지만 상당한 변동성을 보여 일관된 결과를 얻기가 어렵습니다. 따라서 보다 신뢰할 수 있는 인간 모델에 다양한 첨단 기술을 채택해야 할 긴급한 필요성이 있습니다. 현재까지 이러한 오가노이드는 복잡한 세포 구성, 밀도 및 크기로 인해 빛 투과를 방해하여 더 깊은 층에서 광학 이미징 성능이 저하되어 포괄적인 분석이 제한되기 때문에 조직학적 절편만을 사용해서만 연구되었습니다.

전체 마운트 이미징

고정된 조직의 절편 및 염색을 포함하는 기존의 조직학적 기술은 특정 영역에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있지만 전체 오가노이드 내의 전체 구조 및 공간 관계를 포착하지 못합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 전체 마운트 이미징은 망막 오가노이드를 연구하기 위한 유용한 도구로 부상하고 있습니다. 전체 마운트 이미징을 통해 전체 오가노이드를 온전한 3D 형태로 시각화할 수 있어 세포 유형 및 세포 외 기질 구성 요소의 공간 분포를 보존할 수 있습니다. 이 접근 방식은 오가노이드 내부 및 오가노이드 사이의 세포 구성을 조사하는 데 특히 유용하며, 오가노이드의 발달 과정과 기능 조직에 대한 보다 완전한 이해를 제공합니다. 그러나 세포 밀도와 압축으로 인해 망막 오가노이드는 불투명합니다(그림 1, 명확하지 않음). 샘플의 고유한 불투명도는 광 산란을 유발하여 현미경 검사를 사용하여 내부 구조를 자세히 시각화하는 데 방해가 됩니다. 여기에서 광학 클리어링 기술이 강력한 도구로 부상합니다.

광학 클리어링 기법

광학 투명화(optical clearing)는 조직의 굴절률(RI) 구배를 투명화제의 구배와 일치하도록 균질화하고 광흡수 물질을 제거하여 두꺼운 생물학적 샘플을 투명하게 만드는 물리화학적 처리를 말합니다⁷. 이러한 방법은 빛의 산란을 크게 줄이고 투명도를 높입니다. 이러한 변형을 통해 망막 오가노이드 전체를 볼 수 있으며, 전체 마운트 이미징 기술을 통해 복잡한 세포 조직과 형태를 종합적으로 분석할 수 있습니다. 실제로, 이는 샘플에 높은 RI 물질을 함침시키고 지질과 색소를 제거함으로써 달성됩니다.

다양한 측면(예: 투명도, 현미경 기술, 표본 및 형광 분자와의 호환성, 타당성, 지속 시간)이 다른 다양한 투명화 방법을 사용할 수 있지만 가장 일반적인 프로토콜⁸로 두드러지는 것은 없습니다. 그들은 4가지 주요 그룹으로 분류됩니다: (1) 단순 침수, (2) 유기 용매 기반의 소수성, (3) 과수화 기반, (4) 조직 형질전환 또는 하이드로겔 임베딩 기반, Avilov et^{al 7}에 의해 잘 요약된 바와 같이. 모든 분석법에는 RI 매칭을 위한 단계가 포함되며, 일반적으로 조직의 평균 RI와 일치하는 용액에 샘플을 담그는 것입니다. 소수성 분석법에서는 시료를 증가하는 유기 용매 농도(예: 메탄올 또는 프로판올)에 담그면 지질과 물을 제거할 수 있습니다.

제시된 프로토콜은 컨포칼 현미경으로 망막 오가노이드의 전체 마운트 3D 시각화를 용이하게 하기 위해 광학 투명화와 면역 라벨링을 통합하는 최적화된 방법으로, 구조적 무결성을 유지하면서 전체 볼륨 이미징을 가능하게 합니다. 이 접근 방식을 통해 오가노이드 내의 주요 망막 세포 유형을 식별할 수 있으며, 연구자들은 생리학적으로 관련된 맥락에서 망막 오가노이드 성숙 및 공간 조직을 조사할 수 있는 강력한 도구를 얻을 수 있습니다.

프로토콜

1. 맞춤형 형광 2차 항체의 제조

참고: 이 접근법은 상용 형광 항체 사용에 대한 대안으로 사용됩니다(형광 2차 항체 준비의 이점에 대한 논의 참조). 또한, 이 프로토콜은 직접 면역형광을 수행해야 하고 형광 1차 항체가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 형광단을 1차 항체에 접합하는 데 사용할 수 있습니다. 라벨링 반응에서 형광단의 양을 조정하여 형광단 대 항체 비율을 제어하면 더 밝은 접합 항체가 생성됩니다. 그러나 맞춤형 2차 항체는 안정성이 떨어지고 생성된 접합체의 농도는 상용 형광 항체의 농도보다 10배 낮습니다. 이 프로토콜은 Bálint et al⁹에 의해 설명된 연구에서 채택되었습니다.

1. 1mg의 형광단을 무수 DMSO에 용해시키고 튜브당 최종 0.02mg의 형광단을 위해 튜브에 분취합니다. 1시간 30분 동안 작동하는 속도 진공 농축기를 사용하여 모든 DMSO를 제거합니다. 부분 표본은 -20ºC에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오. Alexa Fluor 405의 경우 초순수 H₂O가 부분 표본 제조에 적합한 용매입니다.
2. 라벨링 반응을 수행하기 위해 형광단 분취액 1개를 1-10μL의 DMSO(또는 Alexa Fluor 405의 경우 초순수 H_2O)에 용해시킵니다.
   참고: DMSO의 정확한 양은 이전 대조군 접합 테스트를 통해 결정되었습니다. 이러한 검사는 형광단의 새로운 배치를 사용해야 하는 경우(또는 이전 형광단 배치가 소진된 경우) 또는 접합에서 새로운 형광단을 처음 사용할 때 수행됩니다. control conjugation test는 conjugate에서 최적의 fluorophore-to-antibody ratio를 결정하기 위해 다양한 양의 fluorophore로 라벨링 반응을 수행하는 것을 포함합니다. 우리의 경우 최적 비율은 일반적으로 3μL에서 5μL 사이입니다.
3. 빛으로부터 보호되는 흔들 플랫폼에서 실온(RT)에서 50μL의 2차 IgG(또는 1차), 6μL의 1M NaHCO₃ 및 1-5μL의 형광단을 40분 동안 배양합니다.
4. 반응이 진행되는 동안 뚜껑을 제거하고 완충액이 통과하도록 하여 정제 크기 배제 컬럼을 준비합니다. 컬럼을 통해 3 x 2-3mL의 PBS를 실행하여 컬럼(각 라벨링 반응에 대해 하나씩)을 평형화합니다. 배양이 끝나기 전에 마지막 평형 단계가 완료된 경우, 뚜껑이 마르지 않도록 뚜껑을 다시 끼우고 라벨링 반응이 끝날 때까지 기다립니다.
   참고: 정화 크기 제외 컬럼은 중력에 의해 작동합니다. 컬럼이 어느 순간에도 마르지 않는지 확인하십시오., 또는 정제 반응이 제대로 작동하지 않을 것입니다.
5. 반응이 완료되면(단계 1.3) 라벨링 반응에 PBS 140μL를 추가하여 부피를 약 200μL로 만들고 와류로 만듭니다. 이 용액을 컬럼 중앙에 추가하고, 샘플이 컬럼에 들어가도록 한 다음, 마지막 한 방울이 용리된 후 550μL의 PBS를 첨가하여 밀어 넣습니다. 액체가 더 이상 떨어지지 않으면 PBS 300μL를 첨가하여 용리하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.
6. 280nm에서 샘플의 흡광도와 사용된 형광단의 흡광도를 측정하여 항체 농도 및 표지 비율을 계산합니다. Beer-Lambert 법칙을 적용하여 다음과 같이 농도(몰 농도)를 측정합니다.
   
   여기서 A는 흡광도, ε는 몰 흡광 계수, CF₂₈₀ 은 280nm에서 특정 형광단이 갖는 흡광도를 측정 한 것으로, 이는 보정 계수로 작용합니다. 그러면 항체의 농도는 다음과 같습니다.
   
   그리고 라벨링 비율은 다음과 같습니다.
   
7. 표지된 항체를 빛으로부터 보호되는 4ºC에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

2. 면역형광 라벨링

1. 4% 파라포름알데히드(PFA)로 오가노이드를 실온에서 45분 동안 고정합니다.
   참고: 선택 사항: 항원의 면역 활성을 향상시키기 위해 항원 회수 용액(2.2 및 2.3단계)으로 오가노이드를 배양합니다.
2. 초순수 H₂O에 0.117 mg의 구연산나트륨 삼염기성 이수화물을 혼합하여 40 mL의 항원 회수 용액을 준비하고 pH 9로 조정합니다.
3. 항원 회수 용액으로 오가노이드를 60°C에서 1시간 동안 약한 흔들림(30rpm)으로 배양합니다.
4. PBST(1% Triton X-100이 함유된 PBS)로 오가노이드를 투과화하고 RT에서 4시간 동안 가벼운 진탕을 가합니다.
5. 오가노이드를 차단 용액(0.1% Triton X-100이 함유된 2% 소 혈청 알부민(BSA))으로 RT에서 하룻밤(또는 1일 이상) 차단합니다.
   참고: 1차 및 2차 항체 농도는 특정 항체에 따라 다릅니다. 전체 마운트 샘플의 면역 형광을 위해 당사는 단면 샘플과 비교하여 더 높은 농도를 사용합니다. 당사는 10μg/mL로 1차 항체를 배양하며, 이는 대부분의 경우 재고의 1:100에 해당합니다(표 1). 당사는 맞춤형 2차 항체를 20-50 μg/mL로 배양합니다.
6. 세척액(0.1% BSA와 0.1% Triton X-100)에 희석한 1차 항체를 4°C에서 2일 동안 가벼운 쉐이킹으로 오가노이드를 배양합니다.
7. 오가노이드를 세척액으로 3 x 15분 동안 세척하고 RT에서 가볍게 흔듭니다.
8. 세척액에 희석한 2차 항체를 4°C에서 2일 동안 가볍게 흔들어 오가노이드를 배양합니다.
9. 오가노이드를 세척액으로 3 x 15분 동안 세척하고 RT에서 가볍게 흔듭니다.
   참고: 면역 표지 후 선택한 형광 염료를 배양할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 액틴 필라멘트 네트워크를 시각화하기 위해 DAPI(1:1,000) 및 DRAQ5(1:500) 또는 팔로이딘(1:100)과 같은 형광 핵 마커를 사용합니다.
10. 세척액에 희석한 형광 염료를 RT에서 1시간 동안 가볍게 흔들어 오가노이드를 배양합니다.
11. 오가노이드를 세척액으로 3 x 15분 동안 세척하고 RT에서 가볍게 흔듭니다.

3. FluoClear BABB를 사용한 광학 클리어링

참고: 1-프로판올은 특히 장기간 노출될 경우 플라스틱 용기를 손상시킬 수 있습니다. 안전을 위해 유리 용기를 사용하십시오.

1. 탈수 단계
   1. 주어진 백분율 (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %)에서 초순수 H₂O에 1- 프로판올 용액을 준비 한 다음 트리메틸 아민으로 pH 9.5로 조정하십시오.
      주의: 트리에틸아민은 흡입하면 독성이 있습니다. 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 용액은 적절하게 보관하면 재사용할 수 있습니다(잘 밀봉된 용기). 사용하기 전에 pH를 조정하십시오.
   2. 1-프로판올 용액(15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%)의 기울기가 증가하면서 30°C에서 각각 2시간 동안 가벼운 진탕으로 샘플을 배양합니다.
   3. 100% 1-프로판올로 샘플을 30°C에서 가벼운 쉐이킹과 함께 밤새 배양합니다.
2. 청산 단계
   주의 : BABB는 많은 플라스틱을 용해시키거나 크게 손상시키는 능력으로 알려진 강력한 용매 혼합물입니다. 안전을 위해 호환되는 뚜껑이 있는 유리 용기를 사용하고 흄 후드 내부에서 작업하십시오.
   1. 벤질 알코올(BA)과 벤질 벤조에이트(BB)를 1:2 비율로 혼합하여 BABB를 준비합니다.
   2. RT에서 BABB에 시료를 하룻밤 동안 담급니다.
   3. 이미징하기 전에 BABB를 새로 고칩니다.
      참고: ~1mm 직경의 오가노이드의 경우, BABB는 수십 분 안에 뚜렷한 세clearing 효과를 유도합니다. 샘플의 크기와 특성에 따라 투명화 정도가 다를 수 있으며 투명화 용액에 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있습니다. 클리어링 프로토콜을 개선하기 위해 BABB 침지 전후에 이미지를 획득하는 것이 좋습니다.
   4. BABB 투명화된 시료를 BABB 용액으로 4°C에서 장기간 보관합니다. 형광을 보존하기 위해 빛으로부터 보호하십시오.

4. 전체 마운트 이미지 획득

1. 유리 피펫을 사용하여 오가노이드를 BABB 한 방울과 함께 유리 바닥의 페트리 접시에 놓습니다. 샘플이 커버 글라스 표면과 접촉하는지 확인하십시오.
   주의 : s가 들어 있는 BABB 한 방울이ample의 플라스틱 가장자리에 닿지 않거나 플라스틱이 녹아 샘플과 이미징의 품질이 손상됩니다.
2. 저배율 및 고배율 대물렌즈가 장착된 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 Z 스택 이미지를 획득하여 세포 세부 정보가 포함된 샘플의 완전한 3D 통찰력을 얻을 수 있습니다.
   참고: 이 연구를 위해 각각 3.5μm 및 1μm의 단계 크기를 가진 10x NA(NA) 0.4 공기 대물렌즈와 63x NA 1.4 대물렌즈가 사용되었습니다.

5. 이미지 처리

1. 투명화 용액과 침지 매체 사이의 굴절률(RI) 불일치를 고려하여 Z-stack 획득의 단계 크기를 재보정합니다.
   1. 다음과 같이 재보정된 스텝 크기를 계산합니다.
      
      3.5μm 스텝 크기의 공기 대물렌즈로 이미징한 BABB에 내장된 샘플의 경우 다음과 같습니다.
      
   2. ImageJ를 사용하여 복셀 깊이 를 변경합니다( 이미지 | 속성...) 다시 계산된 단계 크기의 경우.
2. Z 스택의 이미지 프로젝션을 만듭니다.
   1. ImageJ를 사용하여 Z-스택을 심층적으로 검사합니다( 이미지 클릭 | 스택 | 직교 뷰). 망막 오가노이드의 XY, XZ 및 YZ 보기가 나타납니다.
   2. 원하는 관심 영역을 저장합니다(File(파일) | 다른 이름으로 저장...).
3. 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 Z 스택의 3D 렌더링 애니메이션을 만듭니다( 재료 표 참조).
   1. 확인란을 활성화하여 시각화할 채널을 선택합니다.
   2. Z-planes를 조정하여 샘플의 내부를 시각화합니다(확인란에서 Clipping 활성화).
   3. 동영상 편집기를 사용하여 애니메이션을 녹화합니다(확인란에서 동영상 편집기 활성화). 드래그 앤 드롭하고 마우스를 사용하여 직접 확대 및 축소할 수 있습니다. 추가를 클릭하여 애니메이션에 다른 클립을 포함합니다. Z-평면을 조정하는 경우 Clip planes 옵션을 활성화합니다( Settings... | 평면 클립(Clip planes ) 상자 선택).

결과

그림 1: 세 가지 세척 방법 비교. 왼쪽: (A) 투명하지 않은 샘플과 (B-D) 투명화된 샘플의 명시야 이미지. 오른쪽: 10x 공기 대물렌즈(RI = 1.00)가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 획득한 핵 마커 DRAQ5(노란색)로 염색된 90개의 DIV 망막 오가노이드의 xz 및 yz 직교 보기가 있는 Z-스택. (A) 투명하지 않은 망막 오가노이드(N = 3). PFA 고정 망막 오가노이드는 3D 시각화에 충분히 투명하지 않습니다. (B) 과당/글리세롤 제거 오가노이드(N = 3). (C) ECi 투명 오가노이드(N = 3). (D) FluoClear BABB 투명 오가노이드(N = 3). 스케일 바 = 100μm. 약어: BF = 명시야; CLSM = 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경; RI = 굴절률; PFA = 파라포름알데히드; ECi = 에틸 신나메이트; BABB = 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트; DIV = 시험관 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

신경망막 오가노이드의 면역형광 연구를 위한 광학 투명화 방법 비교

여기에서는 망막 오가노이드를 투명하게 만드는 FluoClear BABB의 효능을 입증하기 위한 세 가지 투명화 방법의 결과를 제시합니다. 그림 1에서는 과당/글리세롤(그림 1B), ECi(그림 1C) 및 FluoClear BABB(그림 1D)로 세척된 망막 오가노이드를 관찰할 수 있습니다. 테스트된 투명화 방법은 모두 면역형광 염색과 호환되고 내인성 단백질(예: GCaMP에 존재하는 GFP)의 형광을 ^{보존하는 것으로 입증되었기} 때문에 선택되었습니다.

과당/글리세롤¹²는 탈수가 필요 없는 무독성의 간단한 침지 세척 프로토콜로, 다른 방법에 비해 처리 시간을 크게 단축합니다. 기도, 신장, 간, 인간 유방암 등 다양한 조직에서 유래한 오가노이드를 투명화하는 데 효과적인 것으로 보고되었습니다¹².

ECi(Ethyl Cinnamate)¹¹는 FDA가 승인한 화장품용 식품 향료 및 첨가제^13,14이며, 무해한 것으로 간주되며, 포유류 조직에 대한 우수한 세척 시약으로 입증되었습니다. 빠른 제거 능력과 조직 왜곡 최소화로 유명합니다. 소수성 투명화 방법으로 분류되지만 BABB 기반 용매에 비해 무독성이며 형광 단백질의 형광을 더 오래(최대 14일 동안) 보존합니다. 대부분의 청산 프로토콜에서 흔히 볼 수 있듯이 ECi에는 사전 탈수 단계가 필요합니다. 최적의 결과를 위해 이 단계는 알코올 농도가 점진적으로 증가하는 용액에 샘플을 담그면 달성됩니다. ECi는 유해하지 않기 때문에 샘플이 세척되면 안전하게 조작하여 플라스틱 용기에 보관할 수 있습니다. 그러나 탈수 단계는 흄 후드 아래에서 조작하고 유리 용기에 보관해야 하는 유기 용매인 1-프로판올을 사용하여 수행됩니다.

FluoClear BABB¹⁰ 은 굴절률 정합 용액으로 벤질 알코올/벤질 벤조에이트(BABB)를 기반으로 하는 소수성 프로토콜의 변형 형태입니다. 독성이 강하고 부식성이 강한 것으로 알려져 있으므로 주의해서 다루어야 합니다. FluoClear BABB는 이전 버전보다 GFP 및 RFP를 더 잘 보존하고 탈수제로 1-프로판올 또는 tert-부탄올을 사용할 수 있는 개선된 버전으로 설명되었습니다.

세 가지 투명화 방법의 성능을 평가하기 위해 10x NA0.4 공기 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경으로 Z-평면을 이미지화하여 2.5 x 2.5 x 2.56mm의 넓은 시야(FoV)를 제공하여 망막 오가노이드의 전체 부피를 캡처했습니다. 우리는 모든 망막 뉴런(신경절 세포, 양극성 세포 및 광수용체)을 포함하는 성숙의 중간 단계(90일 체외 (DIV))에서 망막 오가노이드를 사용하여 세포 밀도와 압축을 달성하여 불투명하게 만들었습니다. 소개에서 설명한 바와 같이, 광학적 투명화는 RI가 이미징할 물체 전체에서 일치할 때 달성됩니다. 따라서 이미징에 사용되는 침지 매체는 달성된 투명도에 큰 영향을 미칩니다. 표 2 에는 침지 매체의 RI와 테스트된 세정 용액이 자세히 나와 있습니다.

	용액	굴절률
침수 매체	공기	1
	물	1.33
	글리세롤	1.45
	기름	1.51
클리어링 솔루션	과당/글리세롤	1.468
	에시	1.558
	플루오클리어 BABB	1.56

표 2: 광학 현미경 검사에 가장 많이 사용되는 침지 매체의 굴절률(RI)과 망막 오가노이드를 투명화하기 위해 테스트된 광학 투명화 방법론. 약어: RI = 굴절률.

결과 컨포칼 이미지(그림 1, 오른쪽 패널)를 비교하면 과당/글리세롤 처리는 투명도 개선이 가장 적어 망막층의 시각화를 제한하고 오가노이드 코어의 시각화를 방해했습니다. ECi는 더 나은 투명도를 달성하여 망막층을 시각화할 수 있었지만, 샘플 내부에서 형광 검출을 방해하는 광 산란으로 인해 망막 오가노이드 코어의 시각화는 여전히 제한적이었습니다. FluoClear BABB는 투명도를 가장 크게 개선하여 유사한 형광 강도로 더 높은 해상도로 망막 오가노이드의 코어와 피질을 모두 명확하게 시각화할 수 있었습니다.

ECi 및 FluoClear BABB 프로토콜 모두 투명화된 각 망막 오가노이드의 해당 명시야 이미지에서 볼 수 있듯이 눈에 띄는 시료 수축을 유도했다는 점을 언급할 가치가 있습니다(그림 1, 왼쪽 패널). 시료 수축은 수분을 제거하는 이전 탈수 단계로 인한 것이며, 이것이 바로 과당/글리세롤 프로토콜이 시료를 수축시키지 않는 이유입니다. 그러나 이러한 축소는 더 깊은 탐구를 위한 독특한 기회를 제공합니다. 오가노이드의 전체 크기를 압축하고 내부 거리를 과소평가할 수 있지만 컴팩트함도 증가합니다. 모든 방향에서 비교적 균일한 이 등방성 밀도를 통해 더 짧은 working distance(WD)로 인해 가장 바깥쪽 세포층만 이미지화할 수 있는 우수한 분해능(더 큰 NA로 인해)을 가진 고배율 대물렌즈를 활용할 수 있습니다. 예를 들어, 10x NA 0.4 공기 대물렌즈는 2.53mm의 WD를 제공하는 반면, 훨씬 더 나은 해상도를 가진 63x NA 1.4 오일 대물렌즈는 WD가 0.14mm에 불과합니다. BABB 투명하고 더 컴팩트한 오가노이드를 활용함으로써 이러한 한계를 효과적으로 극복하고 오가노이드 내부에 위치한 신경절 세포층과 같은 더 깊은 구조의 고해상도 이미징을 달성할 수 있습니다(그림 2).

그림 2: 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이미지화한 FluoClear BABB로 투명화된 망막 오가노이드(200 DIV)의 3D 재구성. 현미경에는 (A) 10x NA 0.4 공기 대물물과 (B) 63x NA 1.5 오일 대물렌즈가 장착되었습니다. 투명화 및 이미징을 통해 전체 오가노이드를 시각화할 수 있으며, 동시에 일부 관심 영역을 세밀하게 이미지화할 수 있습니다. DRAQ5(핵), 옵신 B+GR(원추세포체) 및 TUJ1(뉴런). 약어: DIV = 시험관 일수; BABB = 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트; NA = 개구수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결론적으로, 투명화를 위해 선택한 FluoClear BABB는 고해상도와 신호 대 잡음비로 전체 망막 오가노이드를 탁월하게 시각화할 수 있기 때문입니다. 중요한 것은 BABB에 의한 수축으로 오가노이드를 등방성으로 압축한다는 것입니다. 이러한 컴팩트함 덕분에 더 깊은 구조를 자세히 탐사하기 위해 고배율 목표를 활용할 수 있었습니다. 마지막으로, BABB와 오일 이멀젼 대물렌즈의 호환성은 광 산란을 최소화하고 배율에 걸쳐 고품질 이미징을 보장했습니다.

Identification and spatiotemporal distribution of retinal cells within the organoids over maturation(성숙에 따른 오가노이드 내 망막 세포의 식별 및 시공간 분포)

여기에 자세히 설명된 방법론에 따라, 표 1에 자세히 설명된 특정 항체로 면역 표지된 오가노이드에 대한 전체 마운트 이미징을 사용하여 초기 발달 단계(40 DIV)에서 더 성숙한 단계(최대 250 DIV)에 이르기까지 다양한 성숙 지점에서 오가노이드로부터 신경망막이 어떻게 형성되는지 연구하여 잘 정의된 3D 구조를 보여주었습니다. 이 접근 방식을 통해 이 섹션에서 설명한 다양한 망막 구성 요소의 형성과 조직을 시각화할 수 있었습니다.

항체	특이성	대상	레티나에서의 위치	[ ]최종(희석)	호스트	#RRDI
안티 GFP	일반품질보증(GFP)	일반품질보증(GFP)	GCaMP6s 양성 세포	10 μg/mL (1:1,000)	채널	AB_300798
채널10	복내측 시상하부 호메오박스 2 (Vsx2)	전사 인자	신경아세포와 양극성 세포	10 μg/mL (1:2)	미시시피	AB_10842442
옵신 B	옵신 블루	블루콘의 바깥쪽 세그먼트	블루콘	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_177457
옵신 RG	옵신 그린과 레드	녹색 원뿔과 빨간색 원뿔의 바깥 쪽 부분	녹색 원뿔과 빨간색 원뿔	10 μg/mL (1:100)	채널	AB_11213279
레코브	리커버린	칼슘 결합 단백질	광수용체	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_2253622
RHO(RET-P1)	로돕신	막대의 외부 세그먼트	막대	63 μg/mL (1:100)	미시시피	AB_260838
투지1	뉴런 특이적 클래스 III 베타-튜불린	Beta-III 튜불린 동형	뉴런	50 μg/mL (1:200)	미시시피	AB_2315514

표 1: 다양한 성숙 단계의 망막 오가노이드에서 테스트 된 1차 항체.약어 : 치킨 = Ch; 마우스 = ms; 토끼 = Rb.

서로 다른 마커를 사용한 면역 표지를 통해 이 층상 구조를 준수하는 세포를 식별할 수 있었습니다. TUJ1은 뉴런 특이적 클래스 III 베타 튜불린(표 1)으로, 일반적으로 풍부하기 때문에 망막 신경절 세포(RGC)¹⁵ 를 표지하기 위해 절편 샘플에 사용됩니다. TUJ1은 모든 망막 뉴런¹⁶ 과 신경 분화의 초기 단계¹⁷ 에 존재합니다. TUJ1 발현은 오가노이드의 피질에서 모든 성숙 단계에서 발견되어 층내 망막 세포의 조직을 추적할 수 있었습니다. 그림 3에서 개발 초기 단계(40 DIV)에서 TUJ1이 얇고 균일한 단일 레이어로 균일하게 분포되어 있음을 관찰할 수 있습니다. 90 DIV부터는 오가노이드의 정점 영역이 정점 영역에 축적되는 더 많은 세포로 채워지기 때문에 더 조밀하고 조밀해집니다. 170 DIV에서 망막 오가노이드는 별개의 정점 층을 가진 3D 층화 망막 구조를 획득했습니다. 200 DIV에서 우리는 오가노이드 내부 더 깊은 곳에서 발견되는 훨씬 적은 수의 긴 돌기를 확장하는 다른 세포체가 있음을 볼 수 있습니다. 마지막으로, 250 DIV에서, (1) 성숙한 광수용체에 의해 순응된 외부 핵층(ONL), (2) 주로 양극성 세포로 채워지는 내부 핵층(INL), (3) 그림 3 (오른쪽 하단)에서 볼 수 있듯이 망막 세포에 의해 형성된 신경절 세포층(GCL)에 해당하는 3개의 핵층의 구조가 분명합니다.

그림 3: 층-층화된 구조에서 망막 오가노이드 성숙에 따른 뉴런 조직. TUJ1로 염색된 FluoClear BABB 투명 망막 오가노이드의 컨포칼 이미지의 Z-스택 프로젝션. 40 DIV에서는 형성된 층 구조가 없습니다. 170 DIV에서 신경망막은 층으로 층화됩니다. 망막 핵층은 ONL, INL 및 GCL(노란색 화살촉)으로 표시됩니다. 눈금 막대 = 25μm(왼쪽) 및 10μm(오른쪽). 약어: BABB = 벤질 알코올/벤질 벤조에이트; DIV = 시험관 일수; ONL = 외부 핵층, INL = 내부 핵층; GCL = 신경절 세포층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 방법론을 사용하면 축삭 다발의 조립을 보고할 수도 있습니다. 확대된 영역(그림 4)에서 볼 수 있듯이, 우리는 오가노이드의 내핵에서 주변부로 뻗어 있는 섬유 다발이 멀리 떨어진 영역(최대 1mm)을 향해 돌출되어 있는 것을 관찰했습니다. 흥미롭게도, 이러한 섬유의 형성은 여러 성숙 단계에 걸쳐 발생했습니다. 오가노이드가 성장함에 따라 섬유가 두꺼워지고 더 복잡해지며 더 많은 세포 돌기를 수집합니다(그림 4 [250 DIV] 및 보충 비디오 S1). 망막 신경절 세포는 망막 발달 과정에서 분화하는 첫 번째 세포이며, 따라서 매우 초기 발달 단계부터 돌기를 배열할 수 있습니다. 망막 신경절 세포는 오가노이드 내에서 최종 위치를 확립하기 전에도 신경돌기 확장을 시작할 수 있습니다. 본 연구의 결과는 망막과 뇌 오가노이드의 공동 배양에서 시신경과 유사한 구조의 형성을 보여주는 이전 보고서¹⁸ 과 일치한다.

그림 4: 다양한 성숙 단계에서 신경 세포 돌기의 조립. 섬유는 망막 오가노이드의 내면에서 주변부로 뻗어 있습니다. 이러한 섬유의 형성은 40 DIV에서 연구된 가장 오래된 성숙 지점(250 DIV)에 이르기까지 여러 성숙 단계에서 발생했습니다. 눈금자 = 25μm(맨 윗줄) 및 100μm(맨 아래 줄). 약어: DIV = 체외 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

망막 오가노이드의 정점 부위에서 일부 광수용체는 희미한 조명 조건에서 단색 시력을 감지하기 위해 바깥쪽 세그먼트에 로돕신을 포함하는 막대로 성숙하는 반면, 다른 수용체는 파란색, 녹색 및 빨간색 옵신을 발현하고 밝은 빛 조건에서 색상 및 높은 시력을 담당하는 원뿔로 성숙합니다. 그림 5 (상단)는 파란색 및/또는 녹색/빨간색 옵신을 발현하는 망막 오가노이드 내 원뿔 광수용체의 집단을 보여줍니다(OPSIN B 및 GR, 표 1). 이 세포는 핵을 제외한 세포체 전체에 분포된 다양한 옵신과 함께 길쭉한 형태를 나타냅니다. 특히 이러한 세포의 바깥쪽 끝이 더 밝게 나타나 디스크를 포함하는 광수용체의 바깥쪽 부분과 유사할 수 있습니다. 형광 검출을 위한 단일 채널을 사용하여 청색 및 녹색/적색 원뿔을 모두 시각화하기 위해 청색 옵신(OPSIN B, 토끼) 및 녹색/적색 옵신(OPSIN GR, 닭)에 대한 2차 항체를 동일한 형광단으로 태그하여 채널 사용을 최적화하고 이미징 프로세스를 간소화하는 동시에 스펙트럼 중복을 방지했습니다. 그림 5 (아래)에 있는 광수용체 세포의 하위 집합은 로돕신(rho, 표 1 및 보충 비디오 S2)을 발현하여 간상체로서의 정체성을 명백하게 나타냅니다. 이러한 간상 세포는 앞서 설명한 길쭉한 형태를 공유하며, 핵은 중앙에 위치하고, 옵신이 풍부한 세포체는 오가노이드의 주변부를 향합니다.

그림 5: 발달 후기 단계의 망막 오가노이드. 위: 성숙한 원뿔, 아래: 막대. TUJ1(뉴런), DRAQ5(핵), opsin-B+GR(원뿔) 및 RHO(간상체)로 염색된 FluoClear BABB 투명 망막 오가노이드의 컨포칼 이미지의 Z-투영. 참고용으로 회로도가 표시됩니다. 눈금 막대 = 100μm(왼쪽) 및 10μm(오른쪽). 약어: DIV = 시험관 일수; BABB = 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

양극성 세포와 이들의 시공간 분포는 250 DIV의 성숙 기간 동안 Chx10 발현(Vsx2라고도 함)을 추적하여 확인되었습니다(그림 6). Chx10(표 1)은 발달 중인 망막에서 전구 세포 증식 및 양극성 세포 결정에 중요한 전사 인자입니다^19,20. 호메오박스 유전자로서 신경아세포의 발달 초기 단계에서 발현되며, 성숙한 망막에서는 양극성 세포에서만 독점적으로 발견됩니다. 그림 6은 발달 중인 오가노이드 내에서 Chx10 양성 세포의 분포를 보여줍니다. 처음에는 수많은 Chx10 양성 세포가 신경망막 주변부에서 중심을 향해 뻗어 있는 것이 관찰됩니다. 오가노이드가 성숙함에 따라 이러한 세포는 덜 풍부해지고 양극성 세포가 있는 INL로 재배치됩니다.

그림 6: 성숙 250 DIV에 대한 Chx10 발현. DRAQ5(핵) 및 Chx10(신경아세포 및 성숙한 양극성 세포)으로 염색된 FluoClear BABB 투명 망막 오가노이드의 Z-프로젝션 컨포칼 이미지. 눈금 막대 = 100μm. 약어: DIV = 시험관 일수; BABB = 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마지막으로, GCaMP 칼슘 마커의 내인성 GFP가 이 방법론으로 세정한 후에도 보존됨을 입증합니다. 그림 7에서는 Ad5-CMV-GCaMP6에 감염되고 anti-GFP로 면역 표지된 70개의 DIV 망막 오가노이드의 신경망막을 관찰할 수 있습니다(표 1).

그림 7: FluoClear BABB 투명화 분석법에서 보존된 내인성 GCaMP. 항-GFP(GCaMP 발현 세포), Chx10(신경아세포 및 초기 양극성 세포) 및 DRAQ5(핵)로 면역 표지된 Ad5-CMV-GCaMP6에 감염된 70 DIV 망막 오가노이드. 눈금 막대 = 100μm(왼쪽) 및 25μm(오른쪽). 약어: BABB = 벤질 알코올/벤질 벤조에이트; DIV = 시험관 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S1: 뉴런 돌기의 집합체를 나타내는 망막 오가노이드의 3D 재구성. 자주색으로 표시된 TUJ1(뉴런)과 노란색으로 표시된 DRAQ5(핵)로 염색된 250 DIV에서 FluoClear BABB 투명 망막 오가노이드의 컨포칼 이미지의 Z-투영. 약어: BABB = 벤질 알코올/벤질 벤조에이트; DIV = 시험관 일수. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S2: 발달 후기 단계에서 망막 오가노이드 표면에 정렬된 간상체의 3D 재구성(200 DIV). 녹색으로 표시된 RECOV(광수용체)와 보라색으로 표시되는 RHO(막대)로 염색된 200DIV에서 FluoClear BABB 투명 망막 오가노이드의 컨포칼 이미지의 Z-투영. 약어: DIV = 시험관 일수; BABB = 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 성숙 단계에서 망막 오가노이드를 형성하는 세포의 시공간 분포에 대한 연구를 용이하게 하며, 미래의 맞춤형 의학의 맥락에서 이러한 모델을 이해하는 데 중요한 측면인 자연스러운 3D 아키텍처를 보존합니다. 이는 별개의 층과 개별 세포 유형 수준에서 망막 구조에 대한 상세한 보기를 제공하여 글로벌 3D 컨텍스트를 보존하면서 세포 내 구조를 시각화할 수 있습니다.

전체 마운트 이미징의 대안은 기존 섹션(파라핀 또는 동결 보존)에서 이미징을 수행하기 위해 샘플을 후처리하는 것입니다. 절편은 단백질 및 구조의 국소화에 대한 귀중한 정보를 제공하지만 이 데이터는 단일 평면으로 제한되어 공간 세포 연결에 대한 이해를 제한합니다. 결과적으로, 원뿔과 간상체의 비율 또는 특정 영역에서 축삭 다발의 형성과 같은 특징이 정확하게 표현되지 않을 수 있으며, 이로 인해 3차원에서의 해석이 복잡해질 수 있습니다. 망막 오가노이드는 매우 이질적이며, 서로 다른 영역이 잠재적으로 다른 세포 유형을 포함하거나 다양한 정도의 복잡성 및 분화를 보일 수 있습니다. Whole-mount imaging은 샘플 전체를 대표하지 않을 수 있는 section의 하위 집합 선택에 의존하지 않고 전 세계적으로 이질성 gradient를 분석할 수 있기 때문에 이 문제를 해결합니다.

광시트 형광 현미경(LSFM)21,22,23은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 대안으로 사용될 수 있습니다. LSFM에서 표본은 몇 미크론 두께의 얇은 광판으로 조명되며, 조명된 광학 섹션에서 생성된 모든 형광은 카메라를 사용하여 감지됩니다. LSFM은 광표백 및 광독성 효과를 최소화하면서 대량(최대 센티미터 규모의 샘플)을 빠르게 시각화하기 위한 매우 효율적인 전략을 나타내는 광시야 기반 검출 기술입니다. 그러나 오가노이드는 곡면을 통과하는 빛이 입사각에 따라 다르게 굴절되기 때문에 상당한 구면 수차를 나타낼 수 있습니다. 이러한 실험에서 이러한 왜곡은 초점을 상실하여 더 깊은 구조의 해상도를 흐리게 하고 손상시켰습니다. 망막 오가노이드(직경 약 1mm)를 이미징하기 위해 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경이 가장 효과적인 접근 방식임이 입증되었습니다.

이 프로토콜은 당사의 실험 요구 사항에 맞게 조정됩니다. 광학적으로 투명화된 망막 오가노이드의 전체 마운트 이미징을 시도하는 연구자를 위한 시작 가이드로 사용할 수 있으며, 차이점이 있는 경우 조정해야 합니다. 이 섹션에서는 방법론의 중요한 단계, 수정 사항 및 제한 사항에 대해 자세히 설명합니다.

중요한 단계는 청산 프로토콜에 대한 결정입니다. 많은 기준을 고려해야 합니다. 먼저 샘플의 유형을 고려합니다. 뼈를 청소하는 것은 뇌 조직을 청소하는 것과 같지 않으며, 망막 오가노이드를 청소하는 것과 위 오가노이드를 청소하는 것은 각각 고유한 접근 방식이 필요하기 때문에 다릅니다. 다른 유형의 투명화된 오가노이드를 시각화하려면 문헌을 검토하여 관심 샘플에 특별히 최적화된 프로토콜을 식별하는 것이 중요합니다. 과당/글리세롤은 빠르고 독성이 없는 세척 방법으로, 다양한 조직(인간의 기도, 결장, 신장, 간, 유방 종양 오가노이드, 마우스 유선, 오가노이드)에서 유래한 오가노이드를 투명하게 만드는 데 유용한 것으로 입증되었지만¹² 인간 망막 오가노이드를 투명하게 만드는 데는 적합하지 않았습니다. 우리가 아는 한, 과당/글리세롤이 신경 조직/오가노이드에 적용되었다고 보고한 연구는 없습니다. 따라서 우리는 이 투명화 방법이 신경 조직을 정화하는 데 적합하지 않다는 결론을 내렸습니다. 이러한 비호환성의 근본적인 이유를 밝히기 위해 추가 조사가 필요합니다.

고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 이미징 전략과 광학 구성 요소의 선택에 직접적인 영향을 미치기 때문에 필요한 FoV입니다. 큰 FoV는 일반적으로 저배율 대물렌즈로 달성되며, 이는 종종 침지 매체(예: 공기, RI = 1.00) 없이 사용하도록 설계되었습니다. 이러한 대물렌즈는 BABB 투명 샘플(RI = 1.56)을 이미징할 때 더 큰 RI 불일치를 경험하여 후처리 중에 수정해야 하는 깊이 초점의 변화로 이어집니다. 대조적으로, 오일 이멀젼 대물렌즈(RI = 1.51)는 BABB(RI = 1.56)와 같은 투명화 용액과 RI 불일치가 적기 때문에 재보정이 필요하지 않습니다.

단순 침지 방법은 일반적으로 높은 투명도를 달성하지 못하며 전체 마운트 샘플의 고품질 이미지를 획득하는 데 적합하지 않습니다. 조직 투명화 프로토콜은 샘플의 팽창 또는 수축을 통해 효과적인 해상도에 영향을 미칩니다. 실험의 목표에 따라 붓기나 수축이 도움이 될 수 있습니다. 샘플을 확장하는 프로토콜은 이전에 동일한 세부 사항을 표시할 수 없었던 동일한 광학 시스템에서 미세한 세부 사항의 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 그렇지 않으면 샘플 챔버에 맞지 않거나 객관적인 작동 거리에 맞게 조정되지 않는 큰 샘플을 시각화하기 위해 수축을 원할 수 있습니다. 그러나 수축으로 인해 샘플이 압축되고 내부 거리가 왜곡될 수 있기 때문에 이 기술은 치수 평가나 세포 간 거리의 정확한 측정에 적합하지 않습니다.

고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 형광 단백질과의 호환성입니다. 대부분의 유기 용매 기반 프로토콜은 RI 매칭 솔루션을 내장하는 동안 고온을 필요로 하는 형광 단백질을 소멸시키거나 형광 단백질을 분해합니다. 다행히도 대부분의 방법은 면역 표지 기술과 호환됩니다. 그러나, 각 에피토프의 호환성은 실험적으로 확인되어야 한다.

또한 조직을 통한 큰 IgG 분자의 침투가 차단되어 염색 효율이 감소하고 표적 구조가 샘플 표면에 대한 시각화를 제한할 수 있습니다. 전체 마운트 검체를 항체로 염색하는 데는 샘플의 크기와 특성에 따라 며칠(또는 몇 주)이 걸릴 수 있으며, 이로 인해 프로토콜의 지속 시간이 크게 늘어날 수 있습니다.

마지막으로, 광학 기기와의 호환성은 필수입니다. 대부분의 유기 용매 기반 방법(ECi 제외)은 부식성이 매우 강하며 상용 시료 챔버 및 침지 대물렌즈와 화학적으로 호환되지 않습니다. 또한 일부 제거 솔루션에는 사용 가능한 목표(일반적으로 물)에 필요한 범위와 일치하지 않는 RI가 있습니다.

프로토콜에는 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. FluoClear BABB는 소수성 정화 방법으로서 이전의 탈수 단계가 필요합니다. pH는 GFP와 같은 내인성 단백질의 형광을 보존하는 데 중요한 역할을 합니다. 그런 다음 알코올 용액의 pH가 적절하게 조정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 탈수는 완전한 청소의 핵심입니다. 최적의 결과는 알코올 용액의 기울기가 증가하는 샘플을 배양하여 얻을 수 있습니다.

샘플의 크기는 항체가 특정 표적에 도달할 수 있도록 하는 데 중요한 역할을 합니다. 항체가 균질하게 침투하지 못하고 검체 외부에 잔류할 수 있습니다. 이 경우 다른 유형의 세제(Tween-20 또는 Saponin)로 전환하여 세제와 항체의 농도 및 배양 시간을 늘리는 것이 좋습니다. 이러한 조정이 충분하지 않은 경우 대체 전략으로 항체 투과성을 개선할 수 있습니다. 큰 표본(센티미터 규모)의 전체 마운트 면역 라벨링의 경우, 연구자들은 SDS가 더 깊은 항체 침투를 촉진할 수 있음을 발견했습니다²⁴. SDS는 항체의 3차 구조의 부분적 손실을 유도하여 단백질을 효과적으로 선형화하고 조직 깊숙이 침투할 수 있도록 합니다. 그런 다음 SDS를 세척하면 항체의 항원 결합 특성이 복원되어 두꺼운 조직을 보다 균일하게 염색할 수 있고 샘플 표면에서 일반적으로 관찰되는 더 강한 표지의 기울기를 줄일 수 있습니다.

자체 형광 2차 항체를 준비하면 면역 표지 설계에 더 큰 유연성을 제공하여 특정 형광단-2차 항체 조합을 선택할 수 있고 동일한 샘플에 사용할 수 있는 색상 수를 늘릴 수 있기 때문에 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 형광단 대 항체 비율을 조정할 수 있으므로 일반적으로 더 밝습니다. 그러나 몇 가지 측면을 고려해야 합니다. 맞춤형으로 만들어진 2차 항체는 일반적으로 시판되는 항체보다 안정성이 떨어지므로 신선하게 사용해야 합니다. 대부분은 4°C에서 3-6개월 동안 리간드 친화도를 유지하지만, 일부 조합은 더 빨리 저하될 수 있으므로 안정성을 실험적으로 결정해야 합니다. 더욱이, 일부 항체-형광단 쌍은 항원결정기에 대한 항체의 친화도를 변경하여 부분적 또는 완전한 비특이적 표지를 초래할 수 있습니다. 신뢰성을 보장하려면 먼저 배양 중인 세포와 같은 대조군을 사용하여 맞춤형 2차 항체를 테스트한 후 실험 표본에 적용하는 것이 좋습니다.

이 최적화된 프로토콜은 광학 투명화와 면역 라벨링을 통합하여 전체 마운트 망막 오가노이드의 공초점 이미징을 용이하게 합니다. 이는 구조적 무결성을 보존하고 오가노이드 내에서 주요 망막 세포 유형을 식별할 수 있도록 합니다. 따라서 이 프로토콜은 연구자들에게 망막 오가노이드 성숙 및 공간 조직을 조사할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x NA0.40 DRY 대물렌즈	라이카	HC PL APO CS2	-
63x NA1.40 오일 대물렌즈	라이카	HC PL APO CS2	-
항-GFP 항체	아브캠	AB13970	-
벤질 알코올(BA)	시그마 알드리치	13162	-
벤질 벤조에이트(BB)	시그마 알드리치	W213802	-
바닥 유리 페트리 접시	매텍	P35G-1.5-14-C	-
소 혈청 알부민(BSA)	시그마 알드리치	A7030	-
Chx10 항체	스타 크루즈 바이오텍	SC-365519	-
Cytiva Illustra Nap-5 겔 여과 컬럼, Sephadex G-25	시그마 알드리치	17-0853-02	-
DAPI	시그마 알드리치	디9542	-
DMSO	시그마 알드리치	D8418	-
드라큐5	써모피셔	62251	-
염료(카르복실산, 숙신이미딜 에스테르)	Invitrogen 또는 Abberior	-	-
ImageJ/피지	NIH	v1.50i	-
도립 공초점 레이저 스캐닝 현미경	라이카 마이크로시스템	TCS SP8 STED 3X-FALCON	-
LAS X 3D 처리 소프트웨어	라이카 마이크로시스템	-	-
mQ H2O	-	-	Synergy 정수 시스템의 초순수
NaHCO3	아크로스 오가닉스	424270010	-
표지되지 않은 2차 IgG	잭슨 면역 연구	-	-
옵신 블루 항체	밀리포어	AB5407	-
옵신 RG 항체	밀리포어	AB5745	-
파라포름알데히드(PFA) 4%	써모 사이언티픽	J199943-K2	-
PBS 솔루션	깁코	18912-014	-
팔로이딘 라벨링 프로브	써모피셔	-	-
인산염 완충 식염수(PBS)	깁코	10010023	-
RECOV 항체	밀리포어	AB5585-I	-
RHO(RET-P1) 항체	시그마 알드리치	O4886	-
구연산나트륨 삼염기성 이수화물	시그마 알드리치	C8532	-
트리톤 X-100	시그마 알드리치	T8787	-
TUJ1 항체	코밴스	MMS-435P	-