마우스 배럴 피질의 일주기 시냅스 가소성 분석을 위한 시각화 기술로서의 투과 전자 현미경

Summary

제시된 프로토콜은 주로 시냅스 수와 수지상 척추 형태에 초점을 맞춰 마우스 배럴 피질의 일주기 변화를 정량화하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)의 사용을 설명합니다.

Abstract

일주기 시냅스 가소성을 조사하려면 다양한 조명 조건(빛/암흑 주기, LD 12:12 및 일정한 어둠, DD)에서 마우스를 수용하고, 달리는 바퀴에 대한 접근을 제공하고, 24시간 이내에 4개의 정의된 시점에서 생쥐를 희생해야 합니다. 그런 다음 뇌는 투과 전자 현미경(TEM)을 위해 적절하게 고정됩니다. 정확한 체성 조직을 갖춘 배럴 피질은 이러한 분석을 위한 이상적인 모델을 제공합니다. 필요한 뇌 영역을 얻기 위해 진동극도로 뇌를 접선 방향으로 절단한 다음 배럴 피질을 포함하는 절편을 선택하여 Polybed 수지에 매립합니다. 선택한 배럴을 포함하는 준비된 블록에서 연속적인 초박형 섹션이 절단됩니다. 흥분성 및 억제성의 시냅스 밀도는 입체학적 해부 방법을 사용하여 전자 현미경 사진에서 분석됩니다. 또한 TEM 이미지는 수지상 가시의 3D 재구성에 사용됩니다. 수지상 가시 모양의 변화는 낮 동안 뉴런의 리모델링을 나타냅니다. 흥분성 시냅스의 수는 생쥐의 수면(낮) 동안 최고조에 달하는 반면, 억제성 시냅스는 활동 단계(한밤중)에 최고조에 달합니다.

Introduction

일주기 리듬은 유기체의 거의 모든 과정에서 일주기 시계에 의해 생성됩니다. 동물과 인간에서 그들은 행동뿐만 아니라 분자, 세포 및 전체 유기체 수준에서 검출되었습니다. 유기체의 일주기 시스템은 주요 일주기 시계(심박 조율기)와 말초 시계로 구성됩니다. 모든 일주기 시계는 단백질에 의해 제어되는 시계 유전자의 주기적 발현을 통해 일주기 진동을 생성합니다. 시계의 분자 메커니즘은 ~1일(24시간보다 길거나 짧은)의 주기 리듬을 생성하지만, 낮/밤 조건에서는 내인성 리듬의 주기가 24시간으로 동기화됩니다. 무척추동물과 척추동물의 신경계 생리학에서 많은 일주기 리듬이 감지되었습니다. 그러나 일부 연구에서는 시냅스 및 신경 가소성, 즉 시냅스와 수상돌기의 수와 구조의 변화에도 존재한다는 것을 보여주었습니다 1,2,3,4.

마우스 체감각 피질은 잘 정의된 조직과 동물 운동 활동과의 직접적인 연관성으로 인해 하루 종일 시냅스 가소성을 연구하기 위한 훌륭한 장소를 제공합니다 5,6,7,8,9. 체감각 피질의 IV층에는 염색되지 않은 뇌에서도 매우 눈에 띄는 뚜렷한 신경 구조(배럴)가 있습니다^10,11. 이들의 배열은 동물의 주둥이에 있는 수염의 형태와 조직을 반영하여 감각 자극을 정확하게 매핑할 수 있습니다. 큰 통은 5개의 규칙적인 줄로 구성되어 있으며 각 줄에는 4개에서 7개의 통이 들어 있습니다. 큰 수염에 해당하는 통의 줄은 A부터 E까지 대문자로 표시되어 있으며 눈 주둥이를 따라 눈 부분에서 아래로 배열된 수염을 나타냅니다. 각 배럴은 두 가지 주요 영역으로 구성됩니다: 움푹 들어간 부분, 신경 필로 채워진 중앙 부분, 성상 세포의 몸체가 지배하는 측면이라고 불리는 벽입니다. 배럴은 격막이라고 하는 세포 밀도가 낮은 영역에 의해 서로 분리되어 있습니다. 각 배럴은 동물의 주둥이의 반대쪽에 위치한 특정 수염으로부터 자극을 받습니다(^10,12).

규칙적인 행으로 배열된 특정 배럴로의 분할을 통해 선택된 영역^(10,13)을 빠르고 쉽게 식별할 수 있습니다. 일주기 변화 분석을 위해 행 B에서 배럴을 선택하는 것은 활동 의존적 가소성 14,15,16,17에 대한 연구를 기반으로 합니다. 행 B는 잘 정의된 체성 경계가 특징이며 4개의 뚜렷한 대형 배럴만 포함되어 있어 샘플에서 위치를 단순화합니다. 중앙 위치로 인해 행 B 뉴런 활동은 환경 탐색 및 운동 활동과 같은 자연적인 마우스 행동과 상관관계가 있습니다. 수지상 가시와 샤프트의 시냅스를 계산하려면 세포체가 희박한 배럴의 중앙 부분을 선택하는 것이 중요합니다 12,15,18.

공초점 현미경 이미징과 결합된 면역조직화학은 생쥐에서 시냅스 가소성의 주요 메커니즘을 명확히 하는 데 중요한 역할을 한 기술입니다. 공초점 현미경을 사용하면 배경 형광이 감소하고 세포 구조 선명도가 향상된 고해상도 이미지를 제공하지만 광표백이 발생하고 복잡한 샘플 준비가 필요하므로 생물학적 조직의 상태가 바뀔 수 있습니다. 형광 마커에 대한 의존도는 중복으로 인해 동시에 연구할 수 있는 단백질 유형을 제한할 수 있습니다. 공초점 면역형광 현미경은 항체를 사용하여 고정된 조직 절편에서 표적 항원을 검출함으로써 특정 단백질, 발현 수준 및 시냅스 활동과 관련된 국소화를 표지하는 수단을 제공합니다. 이 방법은 신경 전달에 관여하는 다양한 단백질을 연구할 수 있는 특이성과 유연성을 제공하지만, 관련된 고정 단계로 인해 동적 과정에 대한 실시간 데이터를 제공할 수 없다는 점에서 제한됩니다. 항체 결합의 불일치는 또한 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있다 19,20,21.

광학 현미경과 함께 면역형광 방법 대신 전자 현미경을 사용하면 국소화 선택과 신경 구조 구별 모두에서 훨씬 더 높은 해상도와 더 높은 정밀도를 얻을 수 있습니다. 연속 투과 전자 현미경(TEM) 절편은 초미세구조 수준에서 시냅스 구조를 시각화하는 데 도움이 되며 시냅스 형성 또는 제거를 연구하는 데 사용된다는 장점이 있습니다. TEM을 통해 연구자들은 시냅스의 물리적 특성과 시냅스의 가소성이라고 하는 밀도 및 구조의 변화를 분석할 수 있습니다. 샘플 준비 및 이미징은 노동 집약적이지만 TEM은 학습, 기억 형성 및 감각 정보 처리 중, 그리고 하루, 연도 및 동물 연령 동안 발생하는 변화에 대한 보다 자세한 이해를 제공합니다.

우리의 방법은 일련의 TEM 이미지를 기반으로 한 입체학적 해부 방법과 결합된 최소 4개의 시점 기반 접근 방식을 사용하여 시냅스 밀도 및 형태의 일주기 역학을 조사하는 것을 목표로 합니다. 입체 해부 방법은 소수의 초박형 직렬 섹션 22,23,24,25,26 만 사용하는 경우에도 시냅스 수의 신뢰할 수 있는 추정을 허용합니다. 배럴 피질의 잘 정의된 체성 조직은 연구 위치의 정확한 해부학적 선택을 보장하는 반면, 일련의 TEM은 시냅스 유형(흥분성 및 억제성)과 그 위치(수지상 척추 및 샤프트)의 구별을 허용합니다. 이 방법은 주간 및 일주기 신경가소성을 조사하는 연구자에게 귀중한 도구를 제공하여 환경 및 내부 요인이 시냅스 역학에 어떤 영향을 미치는지 탐구할 수 있게 해줍니다. 우리 방법의 개별 구성 요소는 반드시 일주기 관련 변화에 국한되지 않는 훨씬 더 광범위한 연구에서 신경가소성 변화를 분석하는 데 적용할 수 있게 합니다.

Protocol

동물과 관련된 모든 실험 절차는 해당 기관 윤리 위원회의 승인을 받았으며 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 의회 및 이사회의 지침 2010/63/EU 및 국가 규정에 따라 수행되었습니다. 동물의 고통을 최소화하고 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 뇌 조직의 준비

1. 밝은/어두운 상태(LD 12:12) 및 일정한 어둠(DD) 조건 모두에서 24시간 주기 동안 6시간마다 4개의 서로 다른 시점에서 마우스를 희생합니다(그림 1). LD 12:12 조건에서 ZT0은 밝은 단계의 시작에 해당하고 ZT12는 암흑 단계의 시작에 해당하는 ZT(Zeitgeber Time)를 참조하십시오. 일정한 어둠 속에서는 CT0은 주관적인 하루의 시작을 나타내고 CT12는 주관적인 밤의 시작을 나타내는 일주기 시간(CT)을 참조하십시오.
   참고: 시점은 ZT0/CT0(하루의 시작, 주관적인 날), ZT6/CT6(한낮, 주관적인 낮), ZT12/CT12(밤의 시작, 주관적인 밤) 및 ZT18/CT18(한밤중, 주관적인 밤).
2. 0.1M 인산염 완충액(pH 7.4)에 2.5% 글루타르알데히드와 2% 파라포름알데히드로 마우스 뇌를 관류하고 고정시킵니다.
3. 두개골에서 각 뇌를 제거하고 고정액(0.1M 인산염 완충액, pH 7.4에 2.5% 글루타르알데히드 및 2% 파라포름알데히드)에 4°C에서 24시간 동안 그대로 둡니다.
4. 절편을 위해 뇌를 준비하려면 소뇌를 잘라내고 뇌를 두 개의 반구로 나눕니다(그림 2A,B).
5. 하나의 반구(오른쪽 또는 왼쪽)를 선택하고 섹션이 배럴 피질에 접선 방향으로 절단되도록 방향을 지정합니다. 선택한 반구를 비브라톰 척에 장착하고 단단히 붙입니다(그림 2C).
6. 60μm 두께(진동극 절편 속도: 7.10 및 주파수: 5.00)로 절편을 절단한 다음(그림 2D) 절편을 0.1M 인산염 완충액과 고정액(1:5 비율)의 혼합물로 옮깁니다.
7. 4배 배율의 광학 현미경으로 절편을 검사하고 다음 단계를 위해 가시적인 배럴 필드 피질이 있는 절편만 수집합니다(그림 2E). 오목한 슬라이드를 사용하여 섹션이 지속적으로 액체 상태에 유지되도록 합니다.

2. 뇌 고정 및 절편

1. 붓을 사용하여 티슈를 작은 유리 페트리 접시에 부드럽게 옮깁니다. 다음으로, 0.1M 카코딜레이트 완충액(BC, pH 7.4)에서 뇌 절편을 3 x 5분 동안 헹구습니다.
2. 1.5% 페리시안화칼륨과 함께 0.1M BC의 1% 사산화오스뮴(OsO4)에 절편을 고정하고 +4°C에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
   알림: OsO₄ 는 불안정하고 시간이 지남에 따라 활성이 감소하므로 사용하기 직전에 OsO4 용액을 준비하십시오.
3. 실온에서 1시간 동안 0.1M BC 용액에 1% OsO4의 포스트 픽스 절편.
   알림: OsO4는 매우 독성이 있으므로 보호 장갑을 착용하고 환기가 잘 작동하는 흄 후드 아래에서 이 모든 단계를 수행하십시오.
   폐기물은 뚜껑이 꽉 막힌 별도의 병에 보관해야 합니다. 제품이 배수구에 들어가지 않도록 하십시오.
4. 고정 후 절편을 증류수로 2 x 5분 동안 헹굽니다.
5. 다음 단계에서, 1% 우라닐 아세테이트를 함유한 70% 에탄올 용액에서 뇌 절편을 40분 동안 배양합니다. 혼합 후 필터(25mm)가 있는 주사기를 사용하여 용액 2mL를 티슈와 함께 각 페트리 접시에 천천히 붓습니다.
6. 알코올의 상승 농도로 조직을 탈수합니다: 70%, 80% 및 90% 에탄올을 각각 5분 동안 및 100% 에탄올, 각각 3 x 5분.
   참고: 조직을 +4°C에서 밤새 70% 에탄올에 방치할 수 있습니다.
7. 프로필렌 옥사이드에서 조직을 2 x 10분 세척합니다.
   알림: 프로필렌 옥사이드는 부식성이 강한 화학 물질입니다. 보호 장갑을 착용하고 연기 후드 아래에서 작업하는 동안 주의해서 사용하십시오. 이 단계에서는 유리 용기(유리 페트리 접시)를 사용하는 것이 중요합니다.
   프로필렌 옥사이드는 매우 가연성 액체 및 증기입니다. 폐기물은 별도의 밀폐된 유리 용기에 보관해야 합니다. 제품이 배수구에 들어가지 않도록 하십시오. 폭발의 위험이 있습니다.
8. 프로필렌 옥사이드를 폴리베드 수지와 프로필렌 옥사이드의 혼합물(1:1 비율)으로 대체합니다. 절편이 있는 각 페트리 접시에 최소 2mL의 용액을 붓고 뚜껑을 덮고 40분 동안 배양합니다.
9. 마지막으로 Polybed 수지와 프로필렌 옥사이드(3:1 비율)의 혼합물에 뇌 절편을 삽입합니다. 페트리 접시당 최소 2mL의 혼합물을 사용하고 뚜껑을 덮고 1.5시간 동안 그대로 둡니다.
   알림: 조직이 완전히 잠겼는지 확인하고 액체 위에 떠 있지 않은지 확인하십시오.
10. Aclar 필름을 유리 슬라이드 크기와 일치하는 조각으로 자릅니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 Aclar 필름에 소량의 수지를 바르고 붓으로 페트리 접시의 뇌 절편을 레진으로 옮깁니다. 두 개의 Aclar 필름 사이에 각 섹션을 매립하고 65°C 오븐에서 48시간 동안 배양하여 중합합니다.

3. 배럴 피질 이미징 및 절편

1. 광학 현미경으로 2배 대물렌즈 배율로 뇌 절편을 촬영합니다(그림 2F).
2. 모든 이미지를 수집하여 그래픽 소프트웨어로 가져옵니다.
   1. 이미지를 열려면 파일 |Shift |열려 있습니다. 이미지는 별도의 창에서 열립니다.
   2. 피질(가장 작은 조각)에서 이미지 쌓기를 시작하고 모든 섹션이 올바르게 정렬될 때까지 계속합니다.
   3. 레이어 1 |각 이미지에 레이어를 복제합니다. 대화 상자에서 이미지 번호를 이름으로 입력하고 대상 파일로 이미지 하나를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 모든 이미지에 대해 이 단계를 반복하여 동일한 대상 파일로 복제합니다.
   4. 이미지를 정렬하여 배럴 필드를 재구성하여 적절한 해부학적 순서를 보장합니다. 이동 도구를 사용하여 각 레이어를 수동으로 배치한 다음 편집 |변환 | 필요한 경우 회전 또는 대칭 이동 도구를 사용하여 방향을 조정합니다. 선형을 미세 조정하려면 편집 | 변환 | 해부학적 구조와 독립적으로 일치하도록 이미지의 모서리를 왜곡하고 이동합니다. 정렬을 더 쉽게 하려면 레이어 패널에서 맨 위 레이어의 혼합 모드를 오버레이로 설정합니다.
   5. 배럴 윤곽 및 혈관과 같은 해부학적 랜드마크를 비교하여 올바른 위치를 확인하십시오. 스택을 저장하려면 파일 |다른 이름으로 저장하고, 파일 이름을 지정하고, 형식(PSD 또는 TIFF)을 선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
3. 배럴 필드가 포함된 여러 섹션을 순차적으로 검토하여 각 섹션에서 보이는 배럴을 식별합니다.
4. 추가 공통 레이어에 보이는 각 배럴의 윤곽을 수동으로 그려 전체 배럴 필드의 재구성을 보장합니다. 추가 레이어를 만들려면 레이어 |신제품 |레이어, 레이어 이름을 지정한 다음 확인을 클릭합니다. 도구 모음에서 브러시 도구를 선택하고 새 레이어에서 보이는 각 배럴을 수동으로 그립니다.
   1. 정밀도를 높이려면 확대/축소 를 사용하고 필요에 따라 브러시 크기를 조정하세요. 이미지를 확대 및 축소하려면 확대/축소 도구를 사용하거나 Ctrl + "+" / Ctrl + "-"를 누릅니다. 브러시 크기를 변경하려면 브러시 도구가 활성화된 상태에서 캔버스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 크기 슬라이더를 이동합니다.
5. 이 재구성을 기반으로 선택한 배럴을 식별합니다.
6. 배럴 필드의 패턴(5줄, 각각 4-7개의 배럴이 있음)과 배럴 필드 내 위치를 나타내는 혈관 배열을 기반으로 광학 현미경으로 선택한 배럴을 찾습니다.
7. 배럴 피질이 보이는 각 섹션에서 실체 현미경으로 선택한 배럴을 식별하고 면도날을 사용하여 인접한 배럴과 함께 잘라냅니다.
8. 섹션에서 작은 조각을 제거하고 수지 블록에 붙인 다음 건조시키십시오. 나중에 조직 주변의 여분의 수지를 다듬습니다.
   알림: 티슈 조각을 레진 표면에 평평하게 놓으십시오.
9. 울트라마이크로톰과 다이아몬드 나이프를 사용하여 초박형 연속 절편(3-6개 절편, 두께 65nm)을 절단하고(그림 3A), formvar 코팅된 단일 슬롯 니켈 그리드(2 x 0.75mm)에 수집합니다.
10. 건조되면 샘플을 2% 우라닐 아세테이트로 3분 동안 조영하고 0.03% 구연산납으로 1.5분 동안 조영합니다.
    알림: 대조적으로 그리드를 몇 번 세척하고 각 단계 후에 완전히 건조시키는 것이 중요합니다. 아세테이트 우라닐 및 구연산납 필터가 있는 주사기를 사용하십시오.
11. 분석에 필요한 면적과 부피에 따라 TEM(4K 또는 8K 배율에서 80kV 가속 전압)에서 선택한 배럴의 움푹 들어간 곳(예: B2)에서 연속 이미지를 촬영합니다.
    참고: 일반적으로 동물당 최소 100μm3의 총 부피를 분석합니다.

4. 이미지 분석

참고: TEM 이미지 스택을 만들고 정렬하는 것은 무료 소프트웨어(예: 김프)와 상용 소프트웨어(예: Photoshop)를 모두 사용하여 동일한 방식으로 수행할 수 있습니다. 재구성 역시 상용 소프트웨어(예: 3D Studio Max)와 Blender와 같은 완전 무료 프로그램을 사용하여 동일한 방식으로 수행할 수 있습니다.

1. 시냅스의 밀도를 추정하려면 그래픽 소프트웨어에 최소 3개의 TEM 이미지를 쌓습니다(그림 6). 직렬 이미지 수가 많을수록 계산의 정확도가 높아집니다.
   1. 이미지를 열려면 파일 |Shift |열려있다; 이미지는 별도의 창에서 열립니다.
   2. 각 이미지에 대해 레이어 1 |레이어 복제. 대화 상자에서 이미지 번호를 이름으로 입력하고 하나의 이미지를 대상으로 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 모든 이미지에 대해 동일한 단계를 반복하고 동일한 대상에 복제합니다.
   3. 스택을 저장하려면 파일 |다른 이름으로 저장, 파일 이름을 지정하고 형식(PSD 또는 TIFF)을 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
2. TEM 이미지를 정렬하려면 맨 위 이미지 레이어를 선택하고 레이어 패널에서 혼합 모드를 오버레이로 설정합니다. 편집 |변환 |회전 또는 뒤집기 도구를 사용하여 이미지 방향을 조정합니다. 이동 도구를 사용하여 구조물을 정렬합니다.
   1. 보다 정확한 조정을 위해 편집 |변환 | 왜곡 하여 이미지의 모서리를 독립적으로 이동합니다. 정밀도를 높이려면 Ctrl 키를 누른 상태에서 개별 모서리 점을 드래그합니다. 연속적인 TEM 이미지 사이에 미토콘드리아와 축삭 수초의 크기와 모양의 변화를 사용하여 이미지의 올바른 순서를 확인합니다.
3. 시냅스 계산을 위해 해부 방법을 사용하십시오.
   1. 레이어 |신제품 |레이어 |알겠습니다. 새 레이어가 투명한지 확인합니다(배경 채우기 없음).
   2. 분석 영역을 정의하려면 레이어 |신제품 |레이어 |확인; 그런 다음 직사각형 도구를 선택하고 레이어 |레이어 스타일 |획, 획 색상, 두께(크기) 및 위치(내부 권장)를 설정하고 확인을 클릭하고 사각형을 그립니다. 채우기: 0%를 선택합니다. 직사각형의 인접한 두 개의 선택된 가장자리(예: 오른쪽과 하단 또는 상단와 왼쪽)를 교차하지 않는 TEM 이미지에 존재하는 모든 시냅스를 표시합니다.
   3. 주석에 대한 새 레이어를 추가하여 레이어 |신제품 |레이어 |알겠습니다. 브러시 도구를 사용하여 새 레이어에 시냅스를 표시합니다. 정확한 마킹을 위해 확대/축소 도구와 손 도구를 사용하십시오.
   4. 흥분성 시냅스를 표시하기 위해 한 가지 색상을 선택하고 억제성 시냅스를 표시하기 위해 다른 색상을 선택하십시오. 색상을 변경하려면 도구 모음에서 전경색 상자를 클릭하고 색상 선택기 창에서 색상을 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
4. TEM 이미지에 큰 구조(예: 수초 신경 섬유, 큰 수상돌기 또는 세포체의 일부)가 포함된 경우 여러 사각형이 있는 그리드를 사용합니다. 이를 통해 대형 구조물이 완전히 차지하는 모든 사각형을 제외할 수 있습니다.
   1. 레이어 |신제품 |레이어 |알겠습니다. 보기 |쇼 |Grid를 클릭하고 View |스냅 대상 |그리드.
   2. 편집 |기본 설정 |안내선, 그리드 및 슬라이스. 선 도구를 선택하고 모드를 모양 또는 픽셀로 설정하고 선 가중치(예: 1px)를 설정한 다음 전체 이미지 영역을 덮도록 보이는 격자를 따라 수직선과 수평선을 그립니다.
5. 각 이미지 스택에 대한 "상단" 및 "하단" 섹션을 정의합니다. 마지막 이미지에는 없지만 이전 이미지에는 있는 시냅스만 계산합니다. 이를 통해 시냅스의 수를 과대평가하지 않고도 시냅스를 정확하게 식별할 수 있습니다.
6. 이미지의 눈금을 사용하여 샘플의 부피(TEM 이미지 스택)를 계산합니다. 시냅스가 계산되는 영역을 측정하고 스택의 TEM 이미지 수와 초박형 절편의 두께를 곱합니다.
7. 시냅스 수를 부피로 나누어 단위 부피당 시냅스 밀도를 결정합니다.
8. 수지상 척추가 포함된 모든 TEM 이미지(일반적으로 10-12개의 연속 전자 현미경 사진)를 사용하여 수지상 척추와 그것이 형성하는 시냅스를 재구성합니다.
   1. 그래픽 소프트웨어에서 이미지 스택을 엽니다. 자르기 도구를 선택하고 스택에 수지상 척추가 포함된 영역을 표시한 다음 Enter 키를 누릅니다. 선택한 영역은 보이는 모든 레이어에서 잘립니다. 한 번에 하나만 표시하고 레이어 패널의 눈 아이콘을 사용하여 다른 레이어를 숨깁니다.
   2. 파일 |다른 이름으로 저장하고, 파일 이름을 지정하고, 형식(JPG 권장)을 선택한 다음, 확인을 클릭합니다. 스택의 각 레이어에 대해 반복합니다.
      참고: 이미지를 3D 재구성 소프트웨어로 전송하기 전에 먼저 재구성 중인 요소를 색상으로 표시하는 것이 가장 좋습니다.
   3. 레이어 | 신제품 |레이어 | 알겠습니다.
   4. 레이어 패널에서 레이어 불투명도를 30-50%로 설정합니다.
   5. 브러시 도구를 선택하고 각 구조(예: 수지상 척추, 시냅스)에 대해 다른 색상을 선택한 다음 요소를 표시합니다. 원본 이미지를 보존하려면 새 레이어에서만 작업합니다. 완료되면 주석 레이어를 이미지와 병합하고 맨 위 레이어를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 아래로 병합합니다. 수지상 척추의 단면을 포함하는 각 TEM 이미지에 대해 이 단계를 반복합니다.
9. 수지상 척추의 가시적인 단면이 있는 TEM 이미지를 3D 재구성 소프트웨어로 전송합니다. 기본 큐브 개체를 삭제하려면 개체를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 삭제합니다. 이미지를 업로드하기 전에 뷰포트 퍼스를 정렬하려면 탐색 기즈모에서 Z 를 클릭하거나 숫자 키패드 7 을 누릅니다. 이미지를 업로드하려면 추가 |이미지 |참조, 첫 번째 이미지를 선택하고 두 번 클릭하여 확인합니다. 각 이미지에 대해 반복하여 뷰포트 원근이 전체적으로 일관되게 유지되도록 합니다.1
   참고: 뷰를 회전하려면 마우스 가운데 버튼을 누른 상태에서 마우스를 움직이거나 탐색 기즈모를 사용합니다. 보기를 이동하려면 Shift + 마우스 가운데 버튼을 누른 상태에서 마우스를 이동하거나 보기 이동을 사용합니다.
10. 초박형 절편의 두께를 고려하여 적절한 거리에서 TEM 이미지를 배열합니다(그림 4A). Z축을 따라 마지막 TEM 이미지를 배치하려면 이미지를 클릭하고 개체 속성 (오른쪽 사이드바)을 클릭한 다음 위치 Z에 값을 입력합니다. 이제 이미지가 첫 번째 이미지와 마지막 이미지 사이에 배포될 수 있습니다. 배포하려면 모든 이미지를 선택하고 N 을 눌러 N-패널을 연 다음 편집 탭(N-패널에서)을 클릭합니다 . Z 거리.
    참고: 조정하기 전에 뷰포트 원근을 정렬하고 탐색 기즈모에서 Z를 클릭하거나 숫자 키패드 7을 누릅니다.
    이미지를 배포하려면 배포 도구를 활성화해야 합니다. 활성화하려면 편집 | 기본 설정 | 확장 프로그램을 다운로드하고 "배포"를 검색한 다음 설치를 클릭합니다. 활성화되면 배포 도구는 세션 간에 활성 상태로 유지되며 동일한 버전의 프로그램을 사용하는 한 다시 활성화할 필요가 없습니다.
11. TEM 이미지당 단일 곡선을 사용하여 각 이미지에서 수지상 척추의 모양을 수동으로 윤곽을 그립니다(그림 4B,C).
    1. 첫 번째 TEM 이미지만 표시되는지 확인하십시오. 장면 컬렉션에서 눈 아이콘을 사용하여 다른 모든 오브젝트를 숨깁니다. 윤곽선에 대한 기본 곡선을 작성하려면 추가 |곡선 |원. BézierCircle 개체를 이동하고 G를 누른 채 마우스를 이동한 다음 클릭하여 변경 사항을 적용 합니다.
    2. 수지상 척추 프로파일의 크기를 일치시키려면 객체의 크기를 조정하고 S를 누른 상태에서 마우스를 움직인 다음 클릭합니다. BézierCircle 객체를 선택한 상태에서 모델링 탭으로 들어갑니다. 뷰포트 투시를 다시 정렬하고 탐색 기즈모에서 Z 를 클릭하거나 숫자 키패드 7 을 누릅니다.
    3. 곡선의 모양을 조정하려면 제어점을 선택하고 G를 누른 상태에서 마우스를 움직인 다음 클릭합니다.
    4. 핸들의 방향과 강도를 조정하려면 핸들 점을 선택하고 G 를 눌러 이동하거나 S 를 눌러 크기를 조정한 다음 클릭하여 확인합니다. 각 점에 대해 반복합니다.
    5. 새 제어점을 추가하려면 두 개의 기존 제어점을 선택하고 Shift 키를 누른 상태에서 각 점을 클릭한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 세분화를 선택합니다. 곡선이 수지상 척추 프로파일의 경계에 충분히 해당하면 레이아웃 탭으로 들어가 BézierCircle 객체 와 복제 객체를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 마우스를 움직이지 않고 클릭합니다. 재구성에 사용되는 TEM 이미지와 동일한 수의 BézierCircle 사본을 생성합니다. 4.10단계와 같이 분배 도구를 사용하여 정렬된 TEM 이미지와 정렬합니다.
    6. 모델링 탭에서 각 BézierCircle 곡선을 조정하여 각 이미지의 수지상 척추 프로파일과 일치시킵니다. 현재 편집된 BézierCircle 객체와 해당 TEM 이미지만 한 번에 표시되는지 확인하십시오.
       참고: 특정 단계에 필요한 모든 마우스 오른쪽 버튼 클릭 작업은 장면 경계 내에서 수행되어야 합니다. 연속 곡선은 연속적인 수지상 척추 섹션의 경계에 해당해야 하며 동일한 수의 제어점을 포함해야 합니다.
12. 3D 재구성 기능을 사용하여 인접한 선을 연결하여 연속적인 표면을 형성하고 최종 3D 모양을 만듭니다(그림 4D).
    1. BézierCircle 개체만 표시되는지 확인합니다. 장면 컬렉션에서 사이드바의 눈 아이콘을 사용하여 다른 모든 개체를 숨깁니다.
    2. 수지상 척추 객체를 생성하려면 레이아웃 탭으로 이동하여 모든 BézierCircle 객체를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 결합을 클릭합니다. 결합된 오브젝트를 메시로 변환하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 다음으로 변환 |메쉬.
    3. 결합된 객체의 가장자리를 연결하려면 모델링 탭으로 들어가 2 를 눌러 가장자리 선택 모드 |선택 |모두 |오른쪽 클릭 |브리지 에지 루프.
    4. 객체 상단의 간격을 채우려면 객체 옆을 클릭하여 모두 선택 취소하고 Alt 키를 누른 채 상단 선반의 한 가장자리 섹션을 클릭한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 가장자리 돌출을 선택하고 Z축에서 위쪽으로 드래그한 다음 S 키를 누른 상태에서 마우스를 움직여 새 가장자리 루프를 축소한 다음 클릭하여 변경 사항을 적용합니다. 새 모서리 루프가 선택된 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 모서리에서 새 면을 선택합니다. 같은 방법으로 하단 틈을 채웁니다.
    5. 객체를 매끄럽게 하려면 레이아웃 탭으로 들어가 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 음영 매끄럽게를 선택합니다. 모양을 더욱 매끄럽게 하려면 수정자 (오른쪽 사이드바) |수정자 추가 |생성 |세분화 표면. 뷰포트(Viewport ) 및 렌더(Render) 레벨을 모두 동일한 값으로 설정합니다( 권장 1).
13. 시냅스 재건을 위해 4.11-4.12단계를 반복합니다(그림 4E,F).
14. 각 구조에 색상을 할당하고 렌더링 기능을 사용하여 최종 이미지를 준비합니다(그림 4G,H). 뷰포트 셰이딩(Viewport Shading) 메뉴로 이동하여 렌더링됨(Rendered) 을 선택하여 머티리얼 변경 사항을 미리 봅니다. 색상을 지정할 개체를 선택하고 재료(오른쪽 사이드바) |새로운 |adjust 기본 색상.
    1. 재질 모양을 미세 조정하려면 필요에 따라 거칠기 또는 금속 슬라이더를 조정합니다. 이 방법을 사용하여 각 구조에 고유한 색상을 할당합니다.
    2. 장면 조명을 조정하려면 Light 오브젝트를 클릭하고 G를 누른 상태에서 마우스를 움직여 위치를 변경합니다. 빛의 강도를 변경하려면 데이터 (오른쪽 사이드바)로 이동하여 전력 값을 조정합니다.
    3. 카메라를 배치하려면 최종 이미지에 나타나야 하는 대로 재구성된 척추를 향하도록 뷰포트의 방향을 조정하고 Ctrl + Alt + 숫자 키패드 0을 누릅니다. 보이는 카메라 프레임을 선택하고 G를 누른 상태에서 필요한 경우 마우스를 움직여 위치를 변경합니다.
    4. 렌더링을 준비하려면 출력(오른쪽 사이드바)으로 이동하여 원하는 이미지와 일치하도록 해상도 X 및 Y 값을 변경합니다. 이미지 품질을 향상시키려면 렌더링(오른쪽 사이드바) |렌더링, 샘플 값을 120에서 250 사이로 조정합니다. 투명한 배경의 경우 렌더링 |영화 |투명을 선택합니다. 이미지를 렌더링하려면 F12 키를 누르거나 렌더링(상단 메뉴) |이미지 렌더링.

Results

일주기 시냅스 변화 분석에 우리의 방법을 적절하게 적용하려면 동물 활동의 각 단계(6시간마다)에 대해 2개의 지점을 포함하여 동일한 간격으로 최소 4개의 시점을 선택하는 것부터 시작해야 합니다. 이 지정된 시점에서 동물은 희생되고 뇌는 수집됩니다. 이 접근법을 사용하면 시냅스 가소성의 일일 또는 일주기 패턴을 식별하고 이를 동물의 운동 활동 변화와 연결할 수 있습니다(그림 1). 두 개의 시점만 사용하면 활동 단계 간의 시냅스 밀도 차이를 분석할 수 있지만 시냅스 변화의 실제 패턴을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 일주기 효과를 감지하기 위한 검정력 분석은 시점당 5마리의 동물 그룹 크기가 0.9를 초과하는 통계적 검정력을 달성하기에 충분하다는 것을 나타냈습니다. 이 표본 크기는 통계적 견고성과 동물 사용에 관한 윤리적 고려 사항의 균형을 맞추는 데 최적의 것으로 간주되었습니다.

마우스 체감각 피질의 구조는 연구 위치의 ...

Discussion

여기에서는 시냅스의 일주기 가소성과 생쥐의 배럴 피질에서 수지상 가시의 재건을 연구하는 데 사용되는 방법론을 제시했습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 일주기 가소성 연구에는 최소 4개의 시점이 포함되어야 합니다. 우리의 연구에 따르면 두 시점의 데이터(하나는 휴식 단계(낮)와 다른 하나는 활동 단계(밤)))가 LD 12:12 조건에서 동물의 활동 단계 간의 일일 차이에 대한 정보를 제공한다는 것을 보여주었습니다. 총 시냅스 밀도(흥분성 및 억제성 모두)는 활동(운동 활동) 단계에 비해 휴식 단계(수면) 동안 21% 더 높았습니다. 또한, 흥분성 시냅스의 수는 활동 단계에 비해 휴식 단계에서 약 40% 증가한 반면, 억제성 시냅스는 활동 단계⁵에서 26% 더 풍부했습니다.

분석을 4개의 시점으로 확장하면 시냅스 가소성의 일일 패턴을 식별할 수 있었습니다. 총 시냅스 밀...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아클라 필름	한천 과학	AGL4458
블렌더 소프트웨어			버전: v. 2.91.2
카코딜산, 나트륨염 삼수화물	폴리사이언스	01131-100
오목 슬라이드	멘젤	9.161 151
다이아몬드 나이프	규조토	15-미국	칼 각도: 울트라 45°
디지털 카메라	니콘	DXM 1200 에프
디-나트륨 인산수소 12수화물	포치	799280115
수지 매립	폴리사이언스	08792-1	루프트 제형
에탄올	폴 아우라	PA-11-0004
김프 소프트웨어			버전: v 3.0.4
구연산납	타브	L018
광학 현미경	니콘	옵티포트
사산화오스뮴	폴리사이언스	0223C-10	결정질 (99.95%)
화필
포토샵 소프트웨어			버전: CS5
페리시안화 칼륨	시그말드리치	P8131
프로필렌 옥사이드	시그말드리치	82320	퓨리스. p.a., ≥ 99.5% (GC)
단일 슬롯 그리드	한천 과학	AGG2525	2 x 0.75mm 또는 2 x 1mm
염화나트륨	켐푸르	117941206
인산이수소나트륨 이수화물	켐푸르	117991808
실체 현미경	PZO
주사기 필터	바이오센스	BS25PES045
TEM	요엘	JEM-2100 시리즈
울트라마이크로톰	라이카	UC7
우라닐 아세테이트	라케마
비브라톰	라이카	VT1000 에스