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방법 논문

In Vitro 바이러스 수명 주기를 조사하기 위한 입자 시스템과 같은 SARS-CoV-2 바이러스 생산

1.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68389

⸱

2025년 6월 6일

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 실제 바이러스를 밀접하게 모방한 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자를 생성하기 위해 최적화된 체외 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 생물 안전성 레벨 3 실험실이 필요한 제약 없이 바이러스 감염, 조립 및 배출 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

초록

중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 유사 입자(SC2-VLP) 방법은 생물 안전 레벨 3(BSL-3) 실험실 없이도 SARS-CoV-2 수명 주기를 연구할 수 있는 강력하고 접근 가능한 도구를 제공합니다. 이 시스템은 바이러스 입자 생성의 민감하고 정밀한 검출을 위해 T20 신호에 융합된 루시퍼라제 리포터를 사용하여 조립, 게놈 패키징 및 배출을 포함한 바이러스 수명 주기의 중요한 단계를 효과적으로 모방합니다. SC2-VLP는 HEK-293T 세포의 RNA 패키징 신호와 함께 막(M), 뉴클레오캡시드(N), 포위(E) 및 스파이크(S)를 포함한 SARS-CoV-2 구조 단백질을 공동 발현하여 생성됩니다. 기존의 바이러스와 유사한 입자 시스템과 달리 SC2-VLP 방법은 정확한 정량화와 자연 바이러스 수명 주기에 대한 충실도를 보장합니다. 또한, S 단백질을 HIV 기반 렌티바이러스 입자에 통합함으로써 바이러스 진입을 연구하는 데 국한되는 렌티바이러스 가성형 분석 방법과 비교했을 때, SC2-VLP 시스템은 SARS-CoV-2 생물학의 여러 단계를 탐색하기 위한 보다 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. 이 방법은 살아있는 바이러스 처리의 위험을 우회하고 접근성을 확장합니다. SC2-VLP 방법은 항바이러스 연구와 SARS-CoV-2에 대한 치료 전략 개발에서 상당한 진전을 나타냅니다.

서론

코로나19 팬데믹은 현대 역사상 가장 파괴적인 글로벌 보건 위기 중 하나로 부상했으며, 전 세계적으로 수백만 명의 사망자를 낳았습니다1. 원인이 되는 바이러스인 SARS-CoV-2는 감염, 게놈 복제, 조립 및 배출과 같은 주요 단계를 포함하는 복잡한 수명 주기를 따릅니다. 감염 과정은 바이러스 스파이크 단백질(S)이 숙주 세포 수용체인 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 결합하여 바이러스 게놈이 숙주 세포로 방출되는 것을 촉진할 때 시작됩니다 2,3. 그런 다음 바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp)는 게놈 RNA의 복제를 촉매합니다. 이 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질(N)과 복합체를 이루어 막 단백질(M)에 의해 인식되는 안정적인 구조를 형성합니다. M 단백질은 RNA-N 복합체 S와 외피 단백질(E)4,5를 모집하여 바이러스 조립에서 중심적인 역할을 합니다. 조립 후, 비리온은 비정형(noncanonical) 리소좀 매개 밀매 경로(lysosome-mediated trafficking pathway) 6를 통해 빠져나갑니다.

팬데믹에 대응하여 백신, 중화 항체 및 항바이러스 약물을 개발하기 위해 상당한 글로벌 자원이 동원되었습니다. 이러한 중재에 대한 평가는 SARS-CoV-2 연구를 진전시키는 데 필수적이었다7. 그러나 살아있는 바이러스와 관련된 실험은 생물안전 레벨 3(BSL-3) 실험실에서 수행해야 하기 때문에 살아있는 바이러스를 연구하는 것은 상당한 물류 문제를 야기합니다. BSL-3 시설의 제한된 가용성으로 인해 SARS-CoV-2를 이해하고 퇴치하기 위한 연구 속도가 제한되었습니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 SARS-CoV-2 연구에서는 두 가지 주요 시스템인 바이러스 유사 입자(VLP)와 렌티바이러스 유사형 분석(lentiviral pseudotyping)이 널리 채택되었으며, 둘 다 BSL-3 봉쇄가 필요하지 않습니다8. VLP 시스템은 M, S, E 및 N을 포함한 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 유전자와 세포의 동시 형질주입(co-transfection)을 포함하며, 이 단백질은 함께 바이러스와 유사한 입자를 생성합니다. 이러한 입자는 바이러스의 구조적 및 기능적 특성을 모방하여 SARS-CoV-2 수명 주기의 주요 과정을 연구하는 데 유용한 도구이며 백신 개발을 위한 효과적인 항원이기도 합니다 9,10,11.

반대로, 렌티바이러스 pseudotyping 시스템은 렌티바이러스의 수포성 구내염 바이러스(VSV) G 단백질을 SARS-CoV-2 S 단백질로 대체하여 루시페라제 또는 GFP와 같은 리포터 유전자를 통합할 수 있는 렌티바이러스 입자를 생산할 수 있도록 합니다. 이 시스템은 S-ACE2 상호작용12를 차단하는 중화항체를 조사하는 데 특히 유용합니다. 그러나 렌티바이러스 pseudotyping은 원형질막에서 입자 방출을 매개하는 HIV 구조 단백질의 사용으로 인해 SARS-CoV-2 바이러스 조립 또는 배출을 반영하지 않습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 Syed 등은 최근 RNA 게놈 내에서 SARS-CoV-2 패키징 신호를 확인했으며, 이는 바이러스 게놈 인식에 대한 N 단백질의 특이성을 보여줍니다13. 이 패키징 신호를 리포터 유전자에 융합함으로써 이러한 유전자를 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자(SC2-VLP)에 효율적으로 통합할 수 있습니다13. 이 전략은 SARS-CoV-2 조립 및 배출 프로세스를 복제할 뿐만 아니라 감염 단계를 민감하게 측정할 수 있습니다. 본 연구에서는 SC2-VLP 시스템을 사용하기 위한 실험 방법론을 소개하고 이 접근 방식을 수행하기 위한 주요 고려 사항을 강조합니다.

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프로토콜

1. SC2-VLP의 생성

  1. 10% v/v FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 완전 배지가 있는 10cm 직경의 조직 배양 플레이트에 ~3.0 × 106 개의 HEK-293T 세포를 파종합니다.
    참고: 높은 transfection 효율과 최적의 SC2-VLP 생산을 보장하기 위해 HEK-293T cell은 ~10의 낮은 계대 수로 유지되어야 합니다.
  2. HEK-293T 세포를 37°C, 5%CO2 에서 약 24시간 동안 배양하고 현미경으로 세포 밀도를 확인합니다. ~70%가 밀려나면 진행합니다.
  3. 60 μL의 PEI를 1 mg/mL 스톡에서 200 μL로 혈청 프리 배지로 희석합니다.
  4. 6.7 μg의 N 플라스미드, 10 μg의 Luc-T20 플라스미드, 0.016 μg의 S 플라스미드 및 3.3 μg의 M-IRES-E 플라스미드를 200 μL의 무혈청 배지에 추가합니다( 보충 파일 1 참조).
  5. 1.3단계에서 희석된 PEI를 1.4단계에서 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 플라스미드가 포함된 용액에 부드럽게 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이것이 transfection 용액입니다.
  6. 1.5단계의 transfection 용액을 HEK-293T 세포에 조심스럽게 떨어뜨리고 조직 배양 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 완전히 혼합합니다.
  7. 감염 후 6시간 후에 세포 배양 배지를 DMEM 완전 배지로 교환하고 형질 주입된 HEK-293T 세포를 37°C, 5%CO2 에서 48시간 동안 배양합니다.
  8. SC2-VLP가 포함된 감염된 HEK-293T 세포의 상층액을 채취한 후 0.45μm 주사기 필터를 통해 상층액을 여과하여 세포 파편을 제거합니다. 이것은 SC2-VLP 매체입니다.
    참고: HeLa, Vero E6 및 Caco2 세포주에서 SC2-VLP를 생산하려고 시도했지만 HEK-293T 세포에 대한 프로토콜의 특이성을 나타내는 측정 가능한 바이러스 역가를 얻지 못했습니다.

2. SC2-VLP 효과성 검토

참고: ACE2 및 TMPRSS2를 안정적으로 발현하는 HEK-293T 세포주는 렌티바이러스 형질도입 접근법14,15를 사용하여 확립되었습니다. ACE2 및 TMPRSS2의 단백질 발현은 3단계(SC2-VLP 조성 분석)에 설명된 것과 유사한 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었습니다.

  1. 96웰 플레이트에서 ACE2 및 TMPRSS2의 안정적인 발현을 가진 4.0× 4 개의 HEK-293T 세포를 시드하고 1.8단계에서 50μL의 SC2-VLP 배지를 추가합니다.
  2. 96웰 조직 배양 플레이트를 37°C에서 5% CO2 로 24시간 동안 배양합니다.
  3. 96-웰 플레이트에서 배지를 제거하고 137mM NaCl, 2.7mM KCl,10mM Na2HPO4 및 1.8mM KH2PO4를 함유하는 37°C에서 100μL의 PBS 완충액으로 한 번 세척합니다.
  4. HEK-293T ACE2/TMPRSS2 세포를 20μL의 수동 용해 완충액으로 용해하고 실온의 오비탈 쉐이커에서 15분 동안 샘플을 부드럽게 흔듭니다.
    참고: 용해 완충액에는 25mM 트리스-포스페이트(pH 7.8), 2mM DTT, 2mM 1,2-디아미노사이클로헥산-N,N,N'-테트라아세트산, 1.25mg/mL 라이소자임, 2.5mg/mL BSA, 10% 글리세롤 및 1% 트리톤 X-100)이 포함되어 있습니다.
  5. 96웰 플레이트를 4,000 × g 의 속도로 냉장 마이크로플레이트 원심분리기에서 4°C에서 15분 동안 회전시킨 다음 즉시 플레이트를 얼음 수조로 옮깁니다.
  6. 불투명한 흰색 96웰 플레이트에 100μL의 재구성된 루시퍼라제 분석 버퍼를 취하고 2.5단계에서 20μL의 용해물을 추가합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 짧게 혼합합니다.
  7. 다음 매개변수가 있는 플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정합니다: 감지 모드: 발광; 파장 범위: 전체 스펙트럼; 플레이트 형식: 96웰 표준 불투명 플레이트; 통합 시간: 200ms.

3. SC2-VLP 조성의 검사

  1. 50% PEG 8000 및 2.2% NaCl을 함유한 PEG 8000 용액 1.36mL를 1.8단계의 SC2-VLP 배지 10mL에 추가합니다.
  2. 혼합물을 오비탈 셰이커에 보관하고 용액을 4°C에서 밤새 천천히 혼합합니다.
  3. 용액을 4°C, 2,000×g에서 30 분 동안 원 심분리하고 웨스턴 블로팅 분석을 위해 SC2-VLP 펠릿을 수집합니다16.
    참고: 웨스턴 블로팅 분석의 경우 항체에 관한 모든 정보가 재료 표에 나와 있습니다.

4. SC2-VLP 생산 세포에서 S 및 그 돌연변이의 세포 내 국소화 분석

  1. 직경 15mm의 유리 바닥 배양 접시에 ~3.0 ×6 HEK-293T 세포를 고르게 파종한 다음 세포가 transfection 전에 ~70% 포화도까지 부착하고 성장하도록 합니다.
  2. 단계 1.3 - 1.7에 설명된 대로 transfection 절차를 반복하고 다음과 같이 플라스미드 수량만 수정합니다: N 플라스미드: 1.3 μg, Luc-T20 플라스미드: 2 μg, S 플라스미드: 0.0032 μg, 및 M-IRES-E 플라스미드: 0.66 μg.
  3. 얼음처럼 차가운 PBS 1mL로 배양 접시를 두 번 부드럽게 세척한 다음 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정 용액 1mL를 실온(RT)에서 15분 동안 추가합니다.
  4. RT에서 1mL의 PBS로 2 x 5분 동안 세포를 세척한 다음 RT에서 10분 동안 0.25% Triton X-100 1mL를 첨가하여 세포를 투과화합니다.
  5. RT에서 1mL의 PBS로 2 x 5분 동안 세포를 세척한 다음 RT에서 1시간 동안 5% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL를 첨가하여 비특이적 항체 상호 작용을 차단합니다.
  6. ~200 μL의 1차 항체 용액(유리 바닥을 덮을 수 있을 만큼)을 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: 1차 항체 용액은 PBS에 용해된 5% BSA를 1:200의 희석 비율로 희석하여 제조합니다: 1:200의 마우스 항-S 항체, 1:200의 토끼 항-Sec61β 항체, 1:200의 토끼 항-GM130 항체, 1:200의 토끼 항ERGIC53 항체. 5% BSA/PBS 용액은 희석제 및 차단 완충액으로 사용되어 후속 면역형광 염색 절차 중 비특이적 결합을 최소화했습니다.
  7. 1차 항체 용액을 제거한 다음 RT에서 1mL의 PBS로 3 x 5분 동안 세포를 세척합니다.
  8. 형광 접합 2차 항체 용액을 RT에서 1시간 동안 첨가한 다음 RT에서 PBS 1mL로 3 x 5분 동안 세포를 세척합니다.
    참고: 모든 후속 단계는 형광 접합체의 광표백을 방지하고 신호 무결성을 보존하기 위해 어두운 곳에서 또는 최소한의 빛 노출 상태에서 수행해야 합니다. 마우스 또는 토끼에서 유래한 두 가지 유형의 형광 접합 2차 항체를 사용하여 S 단백질 또는 세포 소기관 마커 단백질을 염색합니다.
  9. RT에서 2.5μg/mL Hoechst 용액으로 핵을 5분 동안 염색한 다음 RT에서 1mL의 PBS로 3 x 5분 동안 세포를 세척합니다.
  10. S 단백질 또는 소기관 염색을 관찰하고 다음 매개변수를 사용하여 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다: 자동 컨포칼 조리개를 사용하여 VBF(평균화 없음, 라인 순차 스캔)로 설정된 PMT 모드. 채널 1(FITC)의 경우 500 - 548nm 방출, HV 525V, 게인 1x 및 오프셋 5%로 25% 출력에서 488nm 레이저를 사용합니다. 채널 2(Alexa Fluor 594)의 경우 610 - 670nm 방출, HV 500V, 게인 1x 및 오프셋 5%로 25% 출력에서 594nm 레이저를 사용합니다. 채널 3(DAPI)의 경우 430 - 470nm 방출, HV 490V, 게인 1x 및 오프셋 5%로 25% 출력에서 405nm 레이저를 사용합니다.

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결과

SARS-CoV-2 수명 주기의 송신 및 조립 단계는 감염 및 복제 단계보다 덜 연구되었습니다17,18. SC2-VLP 분석법이 개발되기 전에는 이러한 과정을 살아있는 SARS-CoV-2를 사용해야만 조사할 수 있었기 때문에 BSL-3 실험실에서만 연구를 수행할 수 있었습니다13. 그림 1에 표시된 SC2-VLP 워크플로우는 실험 프로토콜을 간략하게 설명하고 SARS-CoV-2 수명 주기의 이러한 단계와 관련된 프로세스를 보여줍니다. 이 접근법에서는 SARS-CoV-2의 구조 단백질(M, E, S, N)과 RNA 패키징 신호(T20)를 암호화하는 플라스미드가 HEK-293T 세포에 동시 형질주입됩니다. T20 신호에 융합된 루시페라제 리포터는 방출된 SC2-VLP를 민감하게 검출할 수 있으며,

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토론

BSL-3 실험실의 제약 없이 세포 배양 시스템에서 SARS-CoV-2 수명 주기를 모델링하는 간단하고 효과적인 방법은 항-SARS-CoV-2 연구를 위한 중추적인 발전을 나타냅니다. SC2-VLP 방법은 이러한 요구를 충족하여 강력하고 액세스 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 연구에서는 SC2-VLP 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 SC2-VLP 생산을 위한 중요한 실험 단계를 간략하게 설명합니다. 또한 SARS-CoV-2 생물학에 대한 이해를 증진하고 항바이러스 전략 개발을 촉진하는 데 있어 그 다재다능함과 잠재적 응용 분야를 강조합니다.

전통적인 SARS-CoV-2 VLP 및 렌티바이러스 의사형 분석법은 항-SARS-CoV-2 연구에 널리 사용됩니다 8,25. 전통적인 VLP 방법에서는 SARS-CoV-2...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 베이징 중의과대학(BUCM)의 스타트업 펀드 프로그램(90011451310011)의 지원을 받았습니다. 실험에 대한 귀중한 토론과 도움을 주신 BUCM의 Ma 박사 연구실의 모든 구성원에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민(BSA)세포 신호 전달 기술9998S
공초점 레이저 주사 현미경OlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
태아 소 혈청(FBS)ThermofisherA5670402
염소 항마우스 IgG H& L(Alexa Fluor 488) 항체InvitrogenA11001희석비: IF 1:1000
염소 항토끼 IgG H& L(Alexa Fluor 594) 항체Abcamab150080희석비: IF 1:1000
HEK-293T 세포주NICR(National Infrastructure of Cell Line Resource)NICR-293T-001높은 형질감염 효율과 최적의 SC2-VLP 생산을 보장하기 위해 HEK-293T 세포는 낮은 계대 수(≤ P10).
Hoechst 33342InvitrogenH1399작동 농도: 2.5 & g/mL
루시페라제 리포터 분석 시스템PromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
마우스 단클론 항-GAPDH Proteintech60004-1-Ig희석 비율: WB 1:20,000
마우스 단클론 항-S RBDAbclonalA23771희석 비율: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070형질감염용 무혈청 배지
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
페니실린-스트렙토마이신Thermofisher15140122
폴리에틸렌이민(PEI)Thermofisher43896.01
Promega 수동 용해 완충액PromegaE1941
토끼 다클론 항-ACE2 Proteintech21115-1-AP희석 비율: WB 1:1000
토끼 다클론 항-ERGIC53Proteintech13364-1-AP희석 비율: IF 1:200
토끼 다클론 항-GM130Proteintech11308-1-AP희석 비율: IF 1:200
토끼 다클론 항-SAbcamab272504희석 비율: WB 1:1000
토끼 다클론 항-Sec61&베타;Proteintech15087-1-AP희석 비율: IF 1:200
토끼 다클론 항TMPRSS2Abcamab109131희석 비율: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E 플라스미드Addgene177938
SARS-CoV-2 N 플라스미드Addgene177959
SARS-CoV-2 핵단백질 토끼 mAbAbclonalA21042희석 비율: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S 플라스미드Addgene177960
2차 항체, HRP, 염소 항-마우스 IgG(H+L)Invitrogen31460희석 비율: WB 1:5000
2차 항체, HRP, 염소 항-토끼 IgG(H+L)Invitrogen31430희석 비율: WB 1:5000
SpectraMax i3x 플레이트 리더 분자 장치SpectraMax i3x

참고문헌

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