우리는 실제 바이러스를 밀접하게 모방한 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자를 생성하기 위해 최적화된 체외 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 생물 안전성 레벨 3 실험실이 필요한 제약 없이 바이러스 감염, 조립 및 배출 메커니즘을 조사할 수 있습니다.
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방법 논문
In Vitro 바이러스 수명 주기를 조사하기 위한 입자 시스템과 같은 SARS-CoV-2 바이러스 생산
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 유사 입자(SC2-VLP) 방법은 생물 안전 레벨 3(BSL-3) 실험실 없이도 SARS-CoV-2 수명 주기를 연구할 수 있는 강력하고 접근 가능한 도구를 제공합니다. 이 시스템은 바이러스 입자 생성의 민감하고 정밀한 검출을 위해 T20 신호에 융합된 루시퍼라제 리포터를 사용하여 조립, 게놈 패키징 및 배출을 포함한 바이러스 수명 주기의 중요한 단계를 효과적으로 모방합니다. SC2-VLP는 HEK-293T 세포의 RNA 패키징 신호와 함께 막(M), 뉴클레오캡시드(N), 포위(E) 및 스파이크(S)를 포함한 SARS-CoV-2 구조 단백질을 공동 발현하여 생성됩니다. 기존의 바이러스와 유사한 입자 시스템과 달리 SC2-VLP 방법은 정확한 정량화와 자연 바이러스 수명 주기에 대한 충실도를 보장합니다. 또한, S 단백질을 HIV 기반 렌티바이러스 입자에 통합함으로써 바이러스 진입을 연구하는 데 국한되는 렌티바이러스 가성형 분석 방법과 비교했을 때, SC2-VLP 시스템은 SARS-CoV-2 생물학의 여러 단계를 탐색하기 위한 보다 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. 이 방법은 살아있는 바이러스 처리의 위험을 우회하고 접근성을 확장합니다. SC2-VLP 방법은 항바이러스 연구와 SARS-CoV-2에 대한 치료 전략 개발에서 상당한 진전을 나타냅니다.
서론
코로나19 팬데믹은 현대 역사상 가장 파괴적인 글로벌 보건 위기 중 하나로 부상했으며, 전 세계적으로 수백만 명의 사망자를 낳았습니다1. 원인이 되는 바이러스인 SARS-CoV-2는 감염, 게놈 복제, 조립 및 배출과 같은 주요 단계를 포함하는 복잡한 수명 주기를 따릅니다. 감염 과정은 바이러스 스파이크 단백질(S)이 숙주 세포 수용체인 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 결합하여 바이러스 게놈이 숙주 세포로 방출되는 것을 촉진할 때 시작됩니다 2,3. 그런 다음 바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp)는 게놈 RNA의 복제를 촉매합니다. 이 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질(N)과 복합체를 이루어 막 단백질(M)에 의해 인식되는 안정적인 구조를 형성합니다. M 단백질은 RNA-N 복합체 S와 외피 단백질(E)4,5를 모집하여 바이러스 조립에서 중심적인 역할을 합니다. 조립 후, 비리온은 비정형(noncanonical) 리소좀 매개 밀매 경로(lysosome-mediated ....
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프로토콜
1. SC2-VLP의 생성
- 10% v/v FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 완전 배지가 있는 10cm 직경의 조직 배양 플레이트에 ~3.0 × 106 개의 HEK-293T 세포를 파종합니다.
참고: 높은 transfection 효율과 최적의 SC2-VLP 생산을 보장하기 위해 HEK-293T cell은 ~10의 낮은 계대 수로 유지되어야 합니다. - HEK-293T 세포를 37°C, 5%CO2 에서 약 24시간 동안 배양하고 현미경으로 세포 밀도를 확인합니다. ~70%가 밀려나면 진행합니다.
- 60 μL의 PEI를 1 mg/mL 스톡에서 200 μL로 혈청 프리 배지로 희석합니다.
- 6.7 μg의 N 플라스미드, 10 μg의 Luc-T20 플라스미드, 0.016 μg의 S 플라스미드 및 3.3 μg의 M-IRES-E 플라스미드를 200 μL의 무혈청 배지에 추가합니다( 보충 파일 1 참조).
- 1.3단계에서 희석된 PEI를 1.4단계에서 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 플라스미드가 포함된 용액에 부드럽게 첨가하고 실온에서 1....
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결과
SARS-CoV-2 수명 주기의 송신 및 조립 단계는 감염 및 복제 단계보다 덜 연구되었습니다17,18. SC2-VLP 분석법이 개발되기 전에는 이러한 과정을 살아있는 SARS-CoV-2를 사용해야만 조사할 수 있었기 때문에 BSL-3 실험실에서만 연구를 수행할 수 있었습니다13. 그림 1에 표시된 SC2-VLP 워크플로우는 실험 프로토콜을 간략하게 설명하고 SARS-CoV-2 수명 주기의 이러한 단계와 관련된 프로세스를 보여줍니다. 이 접근법에서는 SARS-CoV-2의 구조 단백질(M, E, S, N)과 RNA 패키징 신호(T20)를 암호화하는 플라스미드가 HEK-293T 세포에 동시 형질주입됩니다. T20 신호에 융합된 루시페라제 리포터는 방출된 SC2-VLP를 민감하게 검출할 수 있으며,
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토론
BSL-3 실험실의 제약 없이 세포 배양 시스템에서 SARS-CoV-2 수명 주기를 모델링하는 간단하고 효과적인 방법은 항-SARS-CoV-2 연구를 위한 중추적인 발전을 나타냅니다. SC2-VLP 방법은 이러한 요구를 충족하여 강력하고 액세스 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 연구에서는 SC2-VLP 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 SC2-VLP 생산을 위한 중요한 실험 단계를 간략하게 설명합니다. 또한 SARS-CoV-2 생물학에 대한 이해를 증진하고 항바이러스 전략 개발을 촉진하는 데 있어 그 다재다능함과 잠재적 응용 분야를 강조합니다.
전통적인 SARS-CoV-2 VLP 및 렌티바이러스 의사형 분석법은 항-SARS-CoV-2 연구에 널리 사용됩니다 8,25. 전통적인 VLP 방법에서는 SARS-CoV-2.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 베이징 중의과대학(BUCM)의 스타트업 펀드 프로그램(90011451310011)의 지원을 받았습니다. 실험에 대한 귀중한 토론과 도움을 주신 BUCM의 Ma 박사 연구실의 모든 구성원에게 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소 혈청 알부민(BSA) | 세포 신호 전달 기술 | 9998S | |
| 공초점 레이저 주사 현미경 | Olympus | FV3000 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| 태아 소 혈청(FBS) | Thermofisher | A5670402 | |
| 염소 항마우스 IgG H& L(Alexa Fluor 488) 항체 | Invitrogen | A11001 | 희석비: IF 1:1000 |
| 염소 항토끼 IgG H& L(Alexa Fluor 594) 항체 | Abcam | ab150080 | 희석비: IF 1:1000 |
| HEK-293T 세포주 | NICR(National Infrastructure of Cell Line Resource)NICR-293T-001 | 높은 형질감염 효율과 최적의 SC2-VLP 생산을 보장하기 위해 HEK-293T 세포는 낮은 계대 수(≤ P10). | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 작동 농도: 2.5 & g/mL |
| 루시페라제 리포터 분석 시스템 | Promega | E1500 | |
| Luc-T20 | Addgene | 177941 | |
| 마우스 단클론 항-GAPDH Proteintech | 60004-1-Ig | 희석 비율: WB 1:20,000 | |
| 마우스 단클론 항-S RBD | Abclonal | A23771 | 희석 비율: IF 1:200 |
| OptiMEM | Thermofisher | 31985070 | 형질감염용 무혈청 배지 |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | P3635 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermofisher | 15140122 | |
| 폴리에틸렌이민(PEI) | Thermofisher | 43896.01 | |
| Promega 수동 용해 완충액 | Promega | E1941 | |
| 토끼 다클론 항-ACE2 Proteintech | 21115-1-AP | 희석 비율: WB 1:1000 | |
| 토끼 다클론 항-ERGIC53 | Proteintech | 13364-1-AP | 희석 비율: IF 1:200 |
| 토끼 다클론 항-GM130 | Proteintech | 11308-1-AP | 희석 비율: IF 1:200 |
| 토끼 다클론 항-S | Abcam | ab272504 | 희석 비율: WB 1:1000 |
| 토끼 다클론 항-Sec61&베타; | Proteintech | 15087-1-AP | 희석 비율: IF 1:200 |
| 토끼 다클론 항TMPRSS2 | Abcam | ab109131 | 희석 비율: WB 1:1000 |
| SARS-CoV-2 M-IRES-E 플라스미드 | Addgene | 177938 | |
| SARS-CoV-2 N 플라스미드 | Addgene | 177959 | |
| SARS-CoV-2 핵단백질 토끼 mAb | Abclonal | A21042 | 희석 비율: WB 1:4000 |
| SARS-CoV-2 S 플라스미드 | Addgene | 177960 | |
| 2차 항체, HRP, 염소 항-마우스 IgG(H+L) | Invitrogen | 31460 | 희석 비율: WB 1:5000 |
| 2차 항체, HRP, 염소 항-토끼 IgG(H+L) | Invitrogen | 31430 | 희석 비율: WB 1:5000 |
| SpectraMax i3x 플레이트 리더 | 분자 장치 | SpectraMax i3x |
참고문헌
- Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
- Shang, J., et al. Structural basis of rece....
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재인쇄 및 허가
