애기장대 로제트를 이용한 잎 표면 및 아포플라스틱 RNA의 분리 및 분석에 대한 단계별 가이드

요약

우리는 애기장대 식물의 잎 표면과 아포라스트에서 세포외 RNA를 분리하는 간단하면서도 재현성이 높은 방법을 설명합니다.

초록

식물 잎의 표면과 잎 내의 세포간 공간(아포플라스트)은 식물과 상호 작용하는 미생물 간의 분자 교환을 위한 핵심 인터페이스 역할을 합니다. 이전 작업에서 우리는 애기장대 로제트의 아포라스트에 다양한 범위의 RNA 종의 존재를 입증했습니다. 보다 최근에 우리의 연구 결과는 애기장대 식물이 잎 표면에 RNA를 적극적으로 분비한다는 것을 밝혔습니다. 이를 조사하기 위해 우리는 동일한 애기장대 식물 세트에서 잎 표면 세척액(LSW)과 아포플라스틱 세척액(AWF)을 모두 수집하는 재현성이 높은 방법을 개발했습니다. 또한 우리는 잎 표면 면봉(LSS)을 포함하는 비침습적 기술을 탐색하여 멸균 면봉 끝이 있는 막대기로 잎 표면을 부드럽게 면봉으로 닦아 RNA를 수집할 수 있었습니다. 미생물 오염의 위험을 최소화하기 위해 세포외 RNA(exRNA)를 분리하기 전에 LSW, AWF 및 LSS 분획을 필터링했습니다. 변성 RNA 겔 전기영동을 사용하여 정제된 exRNA를 분석한 결과, LSW, LSS 및 AWF RNA 샘플에서 다양한 길고 작은 RNA 종을 관찰했습니다. exRNA 샘플과 실험 조건 간의 추가 정량 및 비교 분석은 자유롭게 액세스할 수 있는 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 수행되었습니다. 이 프로토콜은 식물 잎에서 소량의 exRNA를 분리하고 분석하기 위한 효율적이고 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이러한 RNA 제제는 시퀀싱 및 기타 분자 분석을 통해 추가로 특성화될 수 있으며, 식물-미생물 상호 작용에서 exRNA의 역동적인 역할에 대한 통찰력을 제공합니다.

서론

잎은 박테리아, 곰팡이, 난균 및 원생생물을 포함한 다양한 미생물에 의해 식민지화되어 생물 및 비생물적 스트레스 요인으로부터 식물을 보호하고 궁극적으로 식물의 성장과 발달을 촉진할 수 있습니다 1,2,3,4. 식물 잎에는 상호 작용하는 미생물을 수용하는 두 개의 주요 구획인 착생(잎 표면)과 내생(아포라스트)²이 있습니다. 잎 표면은 소수성 큐티클층으로 보호되어 수분 손실을 방지하고 왁스와 큐틴과 같은 성분을 포함합니다. 위쪽(정축) 잎 표면에는 자외선으로부터 보호하고 온도를 조절하며 초식동물을 억제하는 역할을 하는 트리코메라고 하는 특수한 털 같은 표피 세포가 포함되는 경우가 많습니다. 대조적으로, 아포플라스트는 광합성을 위한 가스와 물 교환을 촉진하고 미생물 집락화에 도움이 되는 습한 환경을 제공합니다⁵. 이러한 차이에도 불구하고 두 잎 구획 모두 특정 미생물을 선호하며, 착생 미생물 네트워크는 내생 미생물 네트워크에 비해 다양성 측면에서 더 복잡합니다⁵. 이러한 미생물 군집의 구성이 각 세포외 구획에서 어떻게 조절되는지는 잘 알려져 있지 않습니다. 우리는 미생물 군집 구조가 부분적으로 숙주 식물에서 분비되는 세포외 RNA(exRNA)에 의해 결정될 수 있다고 추측합니다.

최근 연구에서 우리는 아포라스트 또는 세포 용해물의 RNA와 다른 다양한 RNA 종이 잎 표면에 존재한다고 보고했습니다⁶. 식물의 exRNA에 대한 대부분의 연구는 마이크로RNA(miRNA) 및 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 작은 비암호화 RNA에 초점을 맞추었지만, 특히 RNA 간섭 메커니즘이 없는 종에서 서열 상보성과 독립적으로 세포 과정을 잠재적으로 조절할 수 있는 rRNA 및 tRNA 유래 단편과 같은 다른 RNA 종에는 덜 관심을 기울였습니다 ^{7,8, 9}.

여기에서 설명하는 방법은 동일한 애기장대 식물 세트를 사용하여 잎 표면 세척(LSW) 및 아포플라스틱 세척액(AWF) 모두에서 RNA를 순차적으로 분리할 수 있습니다. 또한, 우리는 멸균된 면봉 끝이 있는 스틱으로 분사된 잎 표면을 부드럽게 면봉으로 닦아 RNA 수집을 가능하게 하는 잎 표면 면봉(LSS)을 포함하는 비침습적 직교 기술을 설명합니다⁶. 미생물 오염의 위험을 최소화하기 위해 세포외 RNA를 분리하기 전에 LSW 및 AWF 분획을 모두 필터링합니다. exRNA 샘플의 양과 크기 분포를 평가하기 위해 무료로 액세스할 수 있는 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 이미지 분석과 결합된 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 소량의 exRNA를 분리하고 분석하기 위한 효율적이고 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이러한 RNA 제제는 시퀀싱 및 분자 분석을 통해 추가로 특성화될 수 있으며, 식물-미생물 상호 작용에서 세포외 RNA의 역동적인 역할에 대한 통찰력을 제공합니다.

아래에 기술된 프로토콜은 식물 세포외 소포로부터 RNA를 분리하기 위한 이전에 기술된 프로토콜과 다릅니다¹⁰. 현재 프로토콜은 초원심분리 단계가 필요하지 않으며 세포외 소포뿐만 아니라 전체 세포외 세척액에서 RNA를 분리할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 잎 표면에서 RNA를 분리하기 위한 두 가지 직교 방법을 제공한다는 것입니다. 우리가 아는 한, 잎 표면에서 RNA를 분리하는 것은 최근 간행물⁶ 이전에 설명되지 않았습니다.

프로토콜

1. 완충액 준비 및 멸균

1. 증류수 1L에 20mM 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산(MES), pH 6.0, 2mM CaCl₂ 및 0.01M NaCl을 포함하는 소포 분리 완충액(VIB)을 준비합니다.
   참고: 잎 아포라스트의 이온 농도를 모방하기 위해 VIB에서 NaCl 농도에 대한 약간의 조정이 0.1M에서 0.01M로 이루어졌습니다.
2. VIB를 121°C에서 20분 동안 오토클레이브하고, 액체 사이클을 반복합니다. 또는 0.45μm 진공 필터를 사용하여 VIB를 필터 멸균합니다.
   참고: 이 단계는 미생물 오염이 식물의 유도로 이어지고 결과적으로 결과의 변동성으로 이어질 수 있으므로 완충액이 멸균되었는지 확인하기 위한 것입니다. 이 완충액은 단기 보관을 위해 실온(멸균 후 뚜껑을 열지 않고)에서 보관하거나 장기 보관을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 식물 재료 및 성장 조건

1. Arabidopsis thaliana Col-0 야생형(WT) 씨앗을 표준 화분 혼합물이 들어 있는 4인치 원형 플라스틱 화분에 뿌립니다. 파종 후 종자를 생물학적 살균제(600mg/L)에 담그고 투명한 플라스틱 돔으로 덮은 후 4°C에서 3일 동안 어둡게 보관하여 동시 발아를 유도합니다.
2. 식물 수준에서 150μmol·^m-2·^s-1 광합성 광자 플럭스 밀도(3,500 및 5,000K 스펙트럼 32와트 형광등 전구의 50:50 혼합)로 9시간 빛/15시간 암광 광주기 하에서 24°C로 설정된 온도 제어 단일 성장 챔버로 종자가 있는 화분을 옮깁니다.
3. 약 10일 후, 개별 묘목을 화분 혼합물이 들어 있는 36셀 트레이 인서트로 옮기고 1-2주 동안 투명한 플라스틱 돔으로 덮습니다.
   참고: 일반적인 실험에는 각 유전자형/처리에 대해 ~12-24개의 건강한 식물이 필요합니다. 6-7주 된 식물은 세포 오염 위험이 가장 적게 최적의 양의 LSW 및 AWF RNA를 생산하는 것으로 나타났습니다.
4. 사용하는 화분 혼합물에 따라 가뭄이나 홍수 스트레스를 피하기 위해 10-15일마다 식물에 물을 줍니다.

3. 잎 표면 RNA 수집

1. 원심분리 기반 방법(Leaf Surface Wash; LSW)
   1. 각 복제에 대해 6-7주 된 애기장대 식물을 사용합니다.
   2. LSW 분리를 시작하기 전에 Silwet-L77(이하 습윤제라고 함)을 0.001%(VIB 100mL에 1μL)의 최종 농도로 멸균 VIB에 첨가합니다.
      참고: Silwet-L77은 표면 장력을 감소시키고 완충액이 잎 표면을 코팅할 수 있도록 하는 습윤제입니다.
   3. 100mL의 VIB를 500mL 스프레이 병에 옮깁니다.
   4. 애기장대 장미는 가는 가위를 사용하여 뿌리에서 조심스럽게 분리합니다.
   5. 부드러운 솔을 사용하여 잎자루에서 과도한 흙을 제거하십시오.
   6. 로제트를 평평한 트레이에 놓고 축 표면이 위를 향하도록 합니다.
   7. 스프레이 병의 5개 펌프를 사용하여 VIB + 습윤제를 비축 표면에 분사합니다.
   8. 로제트를 조심스럽게 뒤집고 VIB + 습윤제를 adaxial 표면에 5회 분사합니다.
   9. LSW를 회수하려면 250mL 원심분리기 병 안에 놓인 바닥에 구멍이 있는 바늘 없는 60mL 주사기(주사기당 최대 6주 된 로제트 2개가 들어갈 수 있음) 안에 분사된 로제트를 조심스럽게 넣습니다. 주사기를 파라필름으로 목에 감아 주사기 팁을 병 바닥 위에 매달아 놓습니다(참조는 그림 1 참조).
      참고: 구멍이 있는 60mL 주사기 준비에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 프로토콜¹¹을 참조하십시오.
   10. 로드된 병을 4°C(JA-14 로터)에서 100g 동안 10g으로 원심분리합니다.
   11. 0.22μm 주사기 필터를 통해 LSW를 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원심분리 튜브에 여과액을 수집합니다.
       참고: 일반적으로 12개의 식물은 이 프로토콜을 사용하여 마지막에 약 30mL의 LSW를 생산합니다. 그러나 이는 각 단계에서 수행되는 스프레이 횟수를 기준으로 한 추정치일 뿐입니다. 이 부피는 일반적으로 분무된 부피보다 작으며, 분무된 완충액의 일부가 취급 중에 손실되기 때문입니다.
2. 잎 표면 면봉(LSS) 방법
   1. 이전 섹션(단계 3.1.1-3.1.7)에서 설명한 대로 분리된 로제트에 VIB + 습윤제를 분사합니다.
   2. LSS를 회수하려면 멸균 면봉 스틱을 사용하여 adaxial 및 abaxial 표면을 면봉으로 닦고 적신 팁을 15mL 원심분리 튜브의 내벽에 대고 눌러 액체를 짜냅니다.
      참고: adaxial 및 abaxial LSS 샘플은 실험 설정 및 예상 결과에 따라 별도의 튜브에 수집될 수 있습니다.
   3. 0.22μm 주사기 필터를 통해 얼음 위에 놓인 15mL 원심분리 튜브로 LSS 샘플을 여과합니다.
      참고: 면봉으로 채취한 식물의 수에 따라 실험당 다양한 양의 LSS를 수집할 수 있습니다.

그림 1: 잎 표면 세척 및 아포플라스틱 세척액 분리에 사용되는 도구. (A) LSW 및 AWF를 수집하기 위해 2개의 전체 애기장대 를 60mL 주사기에 넣고 가열된 집게로 주사기 끝에 녹여 세척액이 흐를 수 있는 채널을 만듭니다. (B) 이 바늘 없는 주사기는 그림과 같이 목 부위에 파라필름으로 감쌉니다. (C) 이 단계를 통해 주사기가 병 바닥에 닿지 않고 250mL 원심분리기 병에 들어갈 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 아포플라스틱 세척액(AWF) 수집

1. LSW 또는 LSS 분리에 사용된 것과 동일한 식물 세트를 비커에 넣고 증류수로 부드럽게 두 번 헹굽니다.
2. 다음과 같이 VIB로 로제트를 진공 침투시켜 20초 동안 합니다.
   참고: 진공 침투 과정이 이전에 발표된 프로토콜¹¹에 잘 설명되어 있지만, 본 프로토콜을 명확하게 하기 위해 여기에 재현되었습니다.
   1. 300-500mL의 VIB가 담긴 프렌치 프레스 커피 메이커에 로제트를 조심스럽게 넣습니다. 프렌치 프레스에 뚜껑을 덮고 식물이 완전히 잠길 때까지 플런저를 부드럽게 내립니다.
   2. 프렌치 프레스를 식물과 완충액과 함께 진공 챔버에 넣습니다. 진공 펌프를 사용하여 20초 동안 진공을 가합니다. 버퍼가 끓기 시작해야 합니다.
   3. 진공을 해제하고 진공 챔버에서 프렌치 프레스를 제거하고 뚜껑을 열고 VIB를 별도의 500mL 플라스틱 비커에 붓습니다. 프렌치 프레스에서 로제트를 제거합니다.
      참고: VIB는 한 유전자형에 대해 같은 날에 여러 번 재사용할 수 있지만 진공 침투에 사용한 후에는 다른 날에 사용하기 위해 VIB를 보관해서는 안 됩니다.
   4. 식물에서 과도한 VIB를 부드럽게 흔든 다음 종이 타월에 잎을 빗어 제거합니다.
3. 압지로 부드럽게 닦아 잎 표면에서 과도한 완충액을 제거합니다.
4. 아포플라스틱 세척액(AWF)을 수집하려면 LSW 수집을 위해 설명된 대로 250mL 원심분리기 병 안에 놓인 60mL 바늘 없는 주사기 안에 로제트를 넣고 600×g 에서 30분 동안 4°C에서 천천히 가속하면서 원심분리합니다.
5. 0.22μm 주사기 필터를 통해 풀링된 AWF를 여과하고 얼음 위에 놓인 15mL 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.
   참고: 일반적으로 12개의 식물은 이 프로토콜을 사용하여 마지막에 약 6mL의 AWF를 생산합니다. 필터링된 LSW, AWF 및 LSS는 즉시 사용하거나 추가 사용할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
6. AWF 분리 후 각 복제에 사용된 식물의 신선한 무게(FW)를 기록합니다. 그런 다음 이 판독값을 사용하여 각 샘플의 RNA 양을 정규화합니다(그림 2).

그림 2: 프로토콜 및 잎 표면 면봉 방법의 개략적인 그림. (A) 애기장대 로제트를 사용하여 잎 표면 세척액 및 아포플라스틱 세척액을 분리하기 위한 단계적 프로토콜의 개략도. (B) 잎 표면 RNA를 분리하기 위한 잎 표면 면봉(LSS) 방법의 개략도. Borniego et al., 2025의 그림 S1 및 그림 S4에서 채택한 수치⁶. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. RNA의 침전

1. 15mL 원심분리 튜브에서 필요한 부피의 AWF, LSW 또는 LSS를 0.1부피의 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 및 1.0부피의 저온 이소프로판올과 혼합하여 RNA를 침전시킵니다.
2. 글리코겐(20mg/mL 스톡)을 최종 농도 20μg/mL까지 첨가합니다.
   참고: RNA를 침전시키는 데 사용되는 원심분리기 튜브가 13,000 × g의 고속으로 원심분리될 수 있는지 확인하십시오. 이 단계에서 튜브가 파손되면 RNA 샘플이 손실될 수 있습니다.
3. 혼합물을 -20°C에서 최소 1시간 또는 밤새 배양합니다.
4. 튜브를 13,000 × g 에서 4°C(JA-25.50 로터)에서 30분 동안 원심분리합니다.
5. 얼음처럼 차가운 70% EtOH로 펠릿을 두 번 세척하고 10분 이상 자연 건조시키지 마십시오.
6. 펠릿을 100μL의 초순수 DNase/RNase가 없는 물 또는 VIB에 재현탁하고 RNA를 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   참고: 이 단계 후, 침전된 RNA는 -80°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.

6. TRIzol 기반 RNA 분리

1. 각 튜브에 TRIzol 시약 1mL를 넣고 회전 장치를 흔들어 혼합합니다.
   주의 : TRIzol을 취급하려면 연기 후드에서 사용하고 장갑을 착용하고 보안경을 착용하십시오.
2. 튜브를 탁상용 회전 장치에 실온(RT)에서 10분 동안 놓습니다.
3. 각 튜브에 200μL의 클로로포름을 첨가한 후 짧지만 격렬한 와류 단계를 수행합니다.
   주의 : 클로로포름을 취급할 때는 연기 후드에 사용하고 장갑을 착용하고 보안경을 착용하십시오.
4. 튜브를 RT에서 약 3분 동안 방치한 다음 4°C에서 15분 동안 13,000×g에서 원심분리합니다.
5. 수성을 표지된 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮기고 10μg의 RNase-free 글리코겐과 1부피의 차가운 이소프로판올을 첨가합니다.
   주의 : 생성된 생물학적 유해 폐기물(예: 페놀 폐기물)의 경우 기관 지침에 따라 지정된 폐기물 용기에 유기 용매를 수집하십시오.
6. 튜브를 -20°C에서 1시간 이상 배양하지 않습니다.
   참고: 이 단계에서 1시간 이상 RNA를 침전시키면 RNA 분리 효율이 감소하고 RNA 농도가 매우 낮아집니다.
7. RNA를 펠릿화하려면 튜브를 13,000 × g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
8. 얼음처럼 차가운 70% EtOH를 사용하여 RNA 펠릿을 두 번 세척하고 자연 건조시킨 후 10-20μL의 초순수 DNase/RNase가 없는 물에 재현탁합니다.
9. 재현탁된 RNA를 단기 또는 장기 보관을 위해 각각 -20°C 또는 -80°C에 보관합니다.

7. 페놀 또는 구아니딘 오염 제거

1. RNA 샘플에서 페놀 또는 구아니딘 오염을 제거하려면 96% EtOH와 암모늄 아세테이트로 1회 또는 2회 연속 침전을 수행합니다.
2. 10μL의 RNA 샘플에 1μg의 글리코겐을 첨가하고 2.5부피의 96-100% EtOH를 첨가하기 전에 0.5부피의 7.5M 암모늄 아세테이트와 혼합합니다.
   참고: EtOH의 최종 농도는 이 단계에서 전체 부피에서 70-75%여야 합니다.
3. 혼합물을 -80°C에서 30분 동안 배양하고 13,000 × g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
4. RNA 펠릿을 70% EtOH로 두 번 세척하고 10μL의 초순수 DNase/RNase가 없는 물에 재현탁합니다.

8. 정량 및 비교를 위한 RNA 겔 전기영동

1. 40% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1을 사용하여 1x 트리스-붕산 EDTA(TBE, pH 8.4)에 10% 또는 15% 폴리아크릴아미드와 7M 요소를 함유한 미니 겔(7.2cm x 8.6cm x 0.75mm)을 준비합니다. 또는 상업용 변성 미니 겔(15% TBE-Urea Gel)을 사용하여 RNA 샘플을 실행할 수 있습니다.
2. RNA 샘플(1:1)을 2x 변성 로딩 완충액(95% 포름아미드, 10mM EDTA, 0.02% SDS, 0.02% 브로모페놀 블루 및 0.01% 자일렌 시아놀)과 혼합하고 65°C에서 5분 동안 변성한 다음 즉시 얼음 위에 놓습니다.
3. 220V의 RT에서 약 1시간 15분 동안 0.5x TBE 실행 완충액에서 RNA 샘플을 분리합니다.
4. 크기 표준의 경우 저범위 ssRNA와 14-30nt ssRNA 래더 마커의 1:1 혼합을 사용합니다.
5. 0.5x TBE에서 1x SYBR 금 핵산 겔 염색으로 겔을 10분 동안 염색하고 증류수로 두 번 세척한 다음 이미징 시스템을 사용하여 이미지화합니다(그림 3).
6. 각 레인에서 분해된 RNA를 정량화하려면 ImageJ 문서의 "겔 분석" 소제목 아래에 설명된 겔 분석 방법을 사용하십시오. https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. CL과 exRNA 샘플 간의 밴딩 패턴을 비교하기 위해 매번 100ng/μL의 CL RNA를 로드하므로 CL RNA에 대한 exRNA 샘플의 농도를 추정합니다(그림 4).

그림 3: 식물 잎은 다양한 RNA로 코팅됩니다. 잎 세포 용해물(CL)에서 추출한 RNA 100ng와 AWF 및 LSW에서 분리된 RNA 2μL를 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 SYBR Gold 핵산 염색으로 염색하여 RNA 밴딩 패턴을 시각화하고 비교했습니다. RNA 크기 표준은 가장 왼쪽 레인에 표시됩니다. ImageJ 겔 분석을 사용하여 얻은 밀도 측정 측정은 각 레인의 하단에 표시되며 전체 잎 세포 용해물 레인의 RNA에 대한 RNA의 양을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: LSW RNA의 반복 추출. LSW는 Silwet L-77 또는 다양한 농도의 Silwet L-77(0.001% 또는 0.01%)이 없는 VIB를 사용하여 먼저 분리되었습니다. 동일한 애기장대 식물 세트를 사용하여 LSW를 반복적으로 분리하여 VIB + Silwet L-77(0.001%)을 사용하여 LSW RNA를 농축할 수 있습니다. L1, L2 및 L3은 동일한 식물 세트에 살포한 후 3차례의 연속 원심분리를 통해 수집된 LSW를 사용하여 분리된 RNA 샘플을 나타냅니다. 습윤제의 농도를 0.001%에서 0.01%로 증가시켜도 LSW RNA 분리가 향상되지 않았습니다. ImageJ 겔 분석을 사용하여 얻은 밀도 측정 측정은 각 레인의 하단에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9. 마이크로타이터 플레이트 기반 방법을 사용하여 RNA를 정량화하는 대체 방법

1. 초순수 RNase/DNase가 없는 물에서 CL RNA를 사용하여 표준 RNA 용액을 준비합니다. 샘플의 예상 농도를 기반으로 표준에 대한 적절한 농도 범위를 결정합니다. 0, 6.75, 12.5, 25, 50, 100, 200 ng/μL RNA 농도를 사용하고 두 번의 기술 복제를 허용할 수 있도록 각 표준물질의 충분한 부피를 준비합니다.
2. 500 mM Tris HCl pH = 8에서 1.5x SYBR Gold 핵산 겔 염색을 준비합니다.
   참고: SYBR Gold는 pH에 따라 다르며 pH = 7.0에서 8.0 사이에서 최적의 염색 민감도를 갖습니다.
3. 마이크로플레이트 설정:
   1. 각 웰에 99μL의_dH2O를 첨가합니다.
   2. 각 웰에 1μL의 RNA를 추가합니다. RNA 샘플과 RNA 표준물질 모두에 1 μL를 사용합니다.
   3. 각 웰에 50 μL의 1.5x SYBR Gold를 추가합니다.
4. 마이크로플레이트 리더의 매개변수를 다음과 같이 설정합니다.
   흔들림 - 선형 또는 궤도: 0:03 (MM:SS)
   읽기 - 여기 파장이 496nm로 설정되고 방출 파장이 540nm로 설정된 형광 종점.
5. 표준 값을 사용하여 교정 라인을 구성합니다. 교정선 방정식을 사용하여 샘플의 RNA 농도를 계산합니다.
   참고: 대체 염료를 사용하여 TRIzol-분리 샘플에서 RNA를 정량화할 수 있습니다. Ribo488 RNA 정량 시약에서도 유사한 결과를 얻었습니다. 이 염료에 대한 자세한 설명서는 회사에서 제공합니다. 간단히 말해서, 200 mM Tris pH = 8을 사용하여 염료를 1000배(1 내지 1000)로 희석합니다. 그런 다음 측정을 위해 각 웰에 99μL의 고압멸균된 dH₂O + 1μL의 RNA(샘플 또는 표준물질) + 100μL의 Ribo488 희석액을 첨가하고 5분 동안 배양한 다음 480nm 여기 및 520nm 방출을 사용하여 플레이트 리더를 사용하여 형광을 정량화합니다. 두 가지 RNA 염료를 사용하여 얻은 표준 곡선은 그림 5에 나와 있습니다.

그림 5: 마이크로타이터 플레이트 기반 RNA 정량 방법을 사용하여 얻은 표준 곡선. 두 가지 다른 RNA 염료인 SYBR Gold(왼쪽)와 Ribo488(오른쪽)은 샘플당 두 번의 기술 반복으로 일관된 결과를 산출합니다. 두 방법 중 하나를 사용하여 RNA 정량화를 수행할 수 있습니다. 그러나 RNA를 정량화해야 할 때마다 표준 곡선을 얻어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

애기장대 식물에서 잎 표면 세척(LSW) 및 아포플라스틱 세척 분획(AWF)을 분리하기 위한 위에서 설명한 단계적 프로토콜의 개략적인 개요가 그림 2A에 나와 있습니다. 이 방법을 사용하면 반복당 3개에서 6개의 식물에서 LSW와 AWF를 모두 추출할 수 있으며 두 분획 모두에서 동일한 양의 RNA를 일관되게 산출할 수 있습니다. 세포 용해물의 RNA 농도를 측정하기 위해 NanoDrop 분광 광도법을 활용합니다. 그러나 LSW, LSS 및 AWF에서 파생된 RNA 샘플의 경우 SYBR 금 염색 폴리아크릴아미드 겔의 밀도 정량화에 의존합니다. 이 정량 단계는 세포외 분획에 알려지지 않은 오염 물질(가능성이 있는 다당류)이 포함되어 있어 때때로 흡광도 기반 RNA 정량 방법을 공정제하고 방해하여 RNA 농도를 과대평가할 수 있기 때문에 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 향후 작업에서 비페놀 기반 RNA 정제 방법을 활용할 계획입니다.

변성 RNA 겔 분석을 통해 LSW 및 AWF에 긴 RNA와 작은 RNA를 모두 포함하여 광범위한 RNA 종이 존재하는 것으로 나타났습니다(그림 3). 특히, 잎 표면과 아포형성 분획 모두에서 동등한 RNA 양이 성공적으로 분리되었으며, RNA 양은 식물의 신선 중량(FW)당 정규화되었습니다. 놀랍게도 LSW 및 AWF 분획의 RNA 크기 프로파일은 서로 그리고 총 세포 용해물(CL) RNA의 프로파일과 크게 달랐습니다. 이러한 차이는 exRNA 분획이 세포 RNA로 오염되지 않았음을 시사합니다. 세 가지 분획 중에서 아포플라스틱 RNA(AWF)는 크기 분포에서 가장 큰 다양성을 보였으며, 이는 아포플라스틱 RNA가 잎 표면 RNA보다 더 분해됨을 시사합니다.

애기장대 잎 표면에 RNA가 있는지 추가로 조사하기 위해 면봉을 사용했습니다. 이 방법을 통해 우리는 부축(위쪽) 및 단축(아래쪽) 잎 표면에서 RNA를 개별적으로 순차적으로 수집할 수 있었습니다⁶. 이러한 분석 결과 두 잎 표면에 비슷한 양의 RNA가 포함되어 있는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 원심분리 없이 잎 표면에서 완충액을 흡수하여 RNA를 수집할 수 있는 능력은 RNA가 원심분리 중에 기공을 통해 추출되는 것이 아니라 실제로 잎 표면에 위치한다는 결론을 더욱 뒷받침합니다.

풍부한 양의 잎 표면 RNA를 추출할 수 있었던 주요 조정 중 하나는 습윤제를 첨가하는 것이었습니다. VIB에 습윤제(0.001%의 매우 낮은 농도)를 첨가했을 때 거의 2배 더 많은 RNA를 회수했습니다. Silwet L-77 유무에 관계없이 얻은 RNA 농도의 이러한 차이는 습윤제를 사용하면 잎 표면에서 RNA의 용해가 향상됨을 나타냅니다. 그러나 습윤제의 농도를 0.001%에서 0.01%로 증가시켜도 LSW RNA 분리가 향상되지 않았습니다(그림 4). 특히, 동일한 잎에서 LSW RNA를 분리하는 것을 반복하면 추가 RNA(첫 번째 세척에서 얻은 회수율의 약 63%)가 생성되었으며, 이는 잎이 표면에 RNA를 지속적으로 분비하고 잎을 처리하는 데 필요한 약 30분 이내에 거의 3분의 2가 교체됨을 시사합니다. 식물 재료가 제한적일 때 총 LSW RNA 수율을 늘리기 위해 동일한 잎을 연속적으로 여러 번 세척할 수 있습니다. 그러나 세척액의 녹색 착색으로 평가할 때 취급으로 인해 잎 재료에 누적된 손상이 발생할 수 있으므로 세 번 이상 세탁하는 것은 권장하지 않습니다. 이러한 실험을 위해 RNA 겔 기반 밀도계 분석을 사용하여 RNA 농도를 추정했습니다. 그러나 위에서 설명한 마이크로타이터 플레이트 기반 RNA 정량 방법은 한 번에 여러 샘플을 평가할 때 RNA의 정확한 정량화에 사용할 수 있습니다(그림 5).

토론

이 프로토콜은 건강한 애기장대 로제트에서 잎 표면 세척제(LSW), 잎 표면 면봉(LSS) 및 아포플라스틱 세척액(AWF)을 분리한 다음 RNA 추출하는 방법을 자세히 설명합니다. 중요한 단계에는 실험을 수행하기 전에 VIB를 준비하고 살균하고, 통제된 조건에서 식물을 재배하고, Silwet-L77을 사용하여 VIB가 잎 표면을 적절하게 코팅하도록 하는 것이 포함됩니다. 이러한 절차는 잎 신선한 무게로 정규화된 LSW와 AWF 모두에서 동일한 양의 RNA를 산출해야 합니다. 이러한 세포외 분획에서 RNA를 회수하려면 특히 침전 단계 이후의 RNA 펠릿과 관련하여 신중한 취급이 필요합니다.

위의 프로토콜은 애기장대 잎에 최적화되었지만 약간의 수정만으로 다른 식물 종에도 성공적으로 사용했습니다. 잎 표면에서 RNA 추출은 두 가지 기본 조정을 구현하여 최적화할 수 있습니다: 첫째, 여러 차례의 LSW 분리를 수행하고, 둘째, 습윤제의 농도를 증가시킵니다. 쌀^12,13과 같이 잎 표면이 매우 소수성인 식물 종은 더 높은 농도의 습윤제가 필요할 수 있습니다.

또한 면봉 끝이 있는 면봉을 사용하여 잎 표면 RNA를 수집하는 비침습적 방법을 설명했습니다. 이 잎 표면 RNA 분리 방법을 사용하면 수집 튜브가 얼음 양동이에 배치되도록 합니다. 잎 표면의 RNA가 분비되어 상온에서 축적되는 것을 고려하면 수집 과정에서도 안정적으로 유지될 것이라고 가정합니다. 또한 LSW와 LSS RNA의 밴딩 패턴을 비교한 결과, 분해 측면에서 큰 차이를 보이지 않습니다.

위의 프로토콜은 TRIzol 시약을 사용하여 LSW, LSS 또는 AWF에서 RNA를 정제합니다. 이 시약은 단백질을 제거하기 위해 페놀을 사용합니다. 그러나 TRIzol 기반 정제는 LSW 및 AWF⁶에 풍부한 펙틴과 같은 다당류를 제거하지 않는다는 것을 발견했습니다. 이러한 공정제 분자는 분광광도법 또는 형광법을 사용한 RNA 정량화에 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서 우리는 exRNA 농도를 평가하기 위해 RNA 겔 기반 밀도계 분석에 의존합니다. 우리는 현재 다당류에서 RNA를 더 잘 분리할 수 있는 컬럼 기반 정제 방법을 조사하고 있습니다. 그러나 이러한 방법은 실리카 멤브레인이 ~200 뉴클레오티드보다 큰 RNA 분자에 결합하도록 최적화되어 있기 때문에 작은 RNA의 회수를 제한하는 경우가 많습니다. 작은 RNA는 결합하는 동안 멤브레인을 통과하거나 세척 단계에서 손실될 수 있습니다. 따라서 지금까지 우리는 작은 RNA를 포함한 모든 RNA 크기의 보다 포괄적인 회수를 위해 TRIzol 기반 방법에만 의존하지만 신중한 취급과 상 분리가 필요합니다.

또한, RNA 겔 분석을 수행할 때 주로 다량의 rRNA 및 tRNA에 비해 존재도가 낮기 때문에 AWF 및 LSW RNA에 비해 총 세포 RNA 샘플에 대해 80nt 미만의 단편을 볼 수 없습니다. AWF 및 LSW에 더 작은 밴드가 존재하는 것은 식물의 세포외 구획에서 RNA가 분비된 후 자연적으로 발생하는 풍부한 rRNA 및 tRNA의 분해에 기인하며, 시퀀싱 및 노던 블롯 분석으로 확인된 바와 같이 식물의 수집 및 취급 중에 도입된 인공물이 아닙니다⁶.

당사의 잎 표면 세척 격리 방법은 광범위한 연구 응용 분야에 상당한 잠재력을 지닌 다용도 도구입니다. 식물과 미생물 간의 상호 작용을 이해하는 데 핵심이 될 수 있는 RNA, 단백질 및 기타 대사 산물과 같은 생체 분자를 잎 표면에서 분리할 수 있어야 합니다. AWF 및 LSW에 존재하는 미생물을 식별하려는 경우 0.22μm 필터를 통한 여과를 제거하여 이를 달성할 수 있습니다.

식물은 박테리아, 곰팡이, 바이러스를 포함한 다양한 미생물과 상호 작용하여 표면에 복잡한 군집을 형성합니다¹. 이러한 미생물 군집은 식물 성장, 질병 저항성 및 영양분 획득에 지대한 영향을 미칠 수 있습니다 ^2,3,4. 이 방법을 사용하여 잎 표면 세척을 분리 및 분석함으로써 연구자들은 exRNA, 미생물 대사 산물을 분리하고, 잎 표면에 존재하는 미생물 군집을 식별하고, 이러한 군집이 분자 수준에서 어떻게 조절되는지 조사할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
14-30 nt ssRNA 사다리 마커	타카라	3416
1.5 mL 미세 원심분리기 튜브	VWR	20170-038
10mL 무바늘 주사기	BD	303347
15mL 팔콘 튜브	VWR	89039-668
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea 젤, 10웰/12웰, 30 및 마이크로; L/20 & 마이크로; L	바이오 래드	4566053 / 4566055
36셀 트레이 인서트	트루 리프 마켓
40% 아크릴아미드 및 비스-아크릴아미드 용액, 37.5:1	바이오 래드	1610148
4인치 원형 화분	트루 리프 마켓
50mL 팔콘 튜브	VWR	89039-656
50mL 바늘 없는 주사기	BD	309653
96웰 플레이트 블랙 바닥	그르니어	655090
아크로디스크 0.22 & M 주사기 필터	폴	4192
아크로디스크 0.45 μ M 주사기 필터	폴	4454
과황산암모늄(APS)	시그마-알드리치	A3678
염화칼슘	시그마-알드리치	C1016
클로로포름(RNase 프리)	마크롱 정밀 화학	MK444110
투명 플라스틱 돔	허머트 인터내셔널	11 3348	모든 플라스틱 돔을 사용하여 식물을 덮고 습도를 유지할 수 있습니다
코튼 팁 스틱 의료용	유린	에스-21102
에탄올(Rnase 프리)	데콘 연구소, Inc.	2716GEA
프렌치 프레스 커피 메이커, 24 fl oz	스노우 피크	CS-111 시리즈
구멍이 없는 재배 트레이 10 x 20	트루 리프 마켓
얼음 양동이	Schuett-Biotech, 스폰지스	3-680 052
이소프로파놀	써모 사이언티픽	149320050
JA-14 고정각 로터	베크만 쿨터; 모델: JA-14	339247
킴와이프	KCWW, 킴벌리-클라크	34120
저범위 ssRNA 라더	NEB	N0364S
MES 수화물	시그마-알드리치	M8250
마이크로플레이트 리더	바이오텍	시너지 H1
미라클그로	미라클그로	24-8-16	다목적 식물성 식품입니다. 식물을 재배하는 데 사용되는 토양 공급원에 따라 적용을 조정할 수 있습니다.
Nalgene 센티퓨지 병 250 mL(캡 제외)	날진	3120
종이 타월
파라필름  M 랩 필름	파라필름	S-25929
플라스틱 비커(500mL)	유린	S-21658
RNase가 없는 글리코겐(20mg/mL)	써모 사이언티픽	R0561
RootShield Plus WP 생물학적 살균제	바이오웍스	68539-9
가위
실웻 L-77	파이토테크 연구소	S7777	모든 브랜드의 Silwet L-77을 사용할 수 있습니다. 그러나 Silwet은 시간이 지남에 따라 효능을 잃습니다. 일년에 한 번 교체하는 것이 이상적입니다.
소금	시그마-알드리치	S7653
부드러운 나일론 헤어 페인트 브러시	우리. 미술품 공급	6번
스프레이 병	유린	에스-7272	모든 스프레이 병을 사용할 수 있지만 스프레이 설정은 샤워 중이어야 합니다.
성로 프로페셔널 재배 믹스	성로
성로 번식 믹스	성로
SYBR 골드 핵산 젤 염색 (DMSO 10,000x 농축액)	써모 사이언티픽	에스11494
테메드	써모 사이언티픽	17919
트리졸 시약	인비트로젠	15596026
초순수 Dnase/Rnase가 없는 물	인비트로젠	10977015
요소	시그마-알드리치	U5378
진공 챔버, 0.20 Cu. Ft.	SP Scienceware - Bel-Art 제품 - H-B Instrument	F42031-0000
진공 펌프, 3.5 CFM	이상적인 진공 제품	P101532
저울	에스칼리	WBB480535	이것은 단지 예일 뿐입니다. 모든 저울을 사용할 수 있습니다.