생체 외 심장 및 신경 조직에서 Ryanodine 수용체 2 어셈블리의 단일 분자 분석

요약

이 연구는 네이티브 수용체 조직을 보존하는 소포 기반의 단일 분자 이미징 방법을 제시하여 수용체 조립, 기능 및 질병 연구에서 정확한 화학량론 정량화와 광범위한 응용을 가능하게 합니다.

초록

수용체 조립을 이해하는 것은 생리학적 과정에서 수용체의 기능과 조절의 기저에 있는 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 기존의 체외 단일분자 연구는 이종 발현 시스템에서 단백질을 분리하는 데 의존하지만, 세포 표면 단백질의 조직 및 조립과 관련된 생체 내 생리학적 복잡성을 포착하지 못하는 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)을 사용하여 나노 스케일 소포 내에 캡슐화된 GFP 태그 Ryanodine Receptor 2(RyR2) 분자를 연구합니다. 동물에서 빠르게 추출된 장기에서 생성된 이러한 소포는 추출 시 수용체의 조립 상태에 대한 스냅샷을 효과적으로 제공하여 동물의 생리학적 환경 변화에 대응하여 소단위 화학량론 및 수용체 조직에 대한 자세한 분석을 가능하게 합니다. 이 접근 방식은 TIRFM과 단계적 광표백 분석을 활용하여 수용체 화학량론의 판독값을 제공합니다. 단일 분자 수준에서 수용체를 이미징하면 살아있는 동물에 조립된 수용체 집단 내의 이질성을 쉽게 감지하고 질병 상태와 관련된 조립 변화를 모니터링할 수 있습니다. 결과적으로, 이 방법은 수용체 어셈블리의 분포와 생리학적 환경의 변화와의 상관 관계를 결정하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서론

막수용체(membrane receptor)는 인체 전반의 생리학적 과정에서 중요한 역할을 한다¹. 주요 기능은 세포 내 신호 전달 이벤트를 시작하기 위해 세포 외 자극의 전달을 통해 세포 간의 통신을 중재하는 것입니다. 신호 전달에 대한 근본적인 역할로 인해 기존 치료제의 거의 70%가 막 수용체를 표적으로 합니다². 그들은 종종 여러 화학량론(multiple stoichiometry) ^3,4을 가진 헤테로머 형태로 조립된 여러 소단위체(subunit)로 구성된 올리고머 구조(oligomeric structure)이다. 수용체가 어떻게 기능적 복합체로 조직되는지 이해하는 것은 건강과 질병에 대한 수용체의 역할을 규명하는 데 매우 중요하다 ^5,6. 면역침전(immunoprecipitation 및 western blotting)과 같은 전통적인 생화학적 방법은 평균화된 앙상블 측정을 제공하여 수용체 하위 집단⁷의 이질성을 모호하게 합니다. 대조적으로, 단일 분자 기술은 개별 수용체를 직접 관찰할 수 있어 수용체 집단 내 이질성을 정량화할 수 있습니다 ^8,9,10. 단일 분자 기술은 막 수용체 조립, 화학량론 및 올리고머화를 정량화하는 표준이 되었습니다^11,12. 이 접근법은 분리된 단백질 또는 세포 배양 조건을 사용하여 생리학적으로 관련된 많은 막 수용체에 널리 적용되었습니다. 단일 분자 연구는 주로 단백질을 세포 환경에서 분리할 수 있는 체외 발현 시스템에 의존합니다. 그러나 살아있는 시스템 내의 복잡성은 이러한 유형의 이종 발현 시스템에 완전히 반영되지 않습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 심장 및 신경 조직에서 직접 유래한 나노소포 내에서 멤브레인 수용체를 캡처하여 생리학적으로 관련된 상태의 멤브레인 수용체를 분리하고 이미지화하는 접근 방식을 개발했습니다. 이 방법은 소포 형성 시 수용체 조립 상태를 효과적으로 보존하여 다양한 생리학적 환경에서 수용체의 반응을 나타내는 중추적인 지표인 수용체 소단위 화학량론을 직접 시각화할 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 이종 발현이나 재구성을 필요로 하지 않고 살아있는 동물 내의 복잡한 생물학적 환경에서 발생하는 막 수용체의 화학량론적 조립을 조사할 수 있습니다. TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)을 사용하여 소포로 캡슐화된 수용체의 단일 분자 해상도 이미징을 달성하고 광표백 흔적을 추출하여 소단위 구성을 결정합니다.

TIRFM은 유리 표면의 ~150nm 내에서 형광단을 선택적으로 여기시켜 용액 ^3,10의 분자에서 배경 형광을 감소시키기 때문에 단일 분자 막 단백질 이미징에 매우 적합합니다. 이러한 감금은 신호 대 잡음비를 크게 향상시켜 개별 막 수용체 복합체를 정확하게 검출할 수 있습니다. 형광 표지된 수용체의 단계적 광표백을 분석함으로써 소단위 화학량론을 직접 결정하고 수용체 집단 내 잠재적 이질성을 평가할 수 있습니다¹². 이는 특히 라이노딘 수용체 2(Ryanodine Receptor 2, RyR2)와 관련이 있는데, 이 채널은 호모-테트라머(homo-tetramer)로만 조립되는 심장의 흥분-수축 결합과 그 조립이 이루어지지 않은 뇌의 시냅스 기능에 중요한 역할을 하는 큰 세포 내 Ca²⁺ 방출 채널입니다 ^1,13,14. 신경 조직에 여러 RyR 동형이 존재한다는 점을 감안할 때, RyR2가 심장에서와 같이 4개의 동일한 소단위로 구성된 뇌에서 순전히 동질체 사합체 복합체를 형성하는지 또는 RyR1 또는 RyR3와의 이질체 조립이 생체 내에서 발생하는지 여부는 불분명합니다 ^15,16,17,18.

이 방법은 심장과 뇌의 특정 영역에서 소포를 분리함으로써 RyR2 조직의 잠재적인 조직 특이적 차이를 조사할 수 있습니다. 우리는 심장 조직에서 RyR2의 특성을 활용하여 체외 단일 분자 소단위 화학량론에 대한 통계적으로 강력한 기초를 제공하기 위해 호모테라머만 형성할 수 있으며, 알려진 사합체 어셈블리는 다른 기관에서 알려지지 않은 어셈블리를 조사하기 위한 대조군 역할을 합니다. 생리적 상호 작용을 유지하면서 원래 상태의 수용체를 이미지화할 수 있는 능력은 다양한 장기와 다양한 생리학적 조건에서 수용체 조립을 연구하기 위한 강력한 프레임워크를 제공합니다. 이 프로토콜은 GFP 태그가 지정된 RyR2의 소포 분리, 고정화 및 단일 분자 이미징을 위한 워크플로우를 설명하여 수용체 화학량론의 정확한 특성화를 가능하게 합니다. 이 기술은 심장 및 신경 조직의 RyR2 조직에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 다양한 생리학적 및 병리학적 맥락에서 수용체 조립 및 조절을 연구하기 위한 광범위한 응용 프로그램을 제공합니다 19,20,21.

프로토콜

1. 시료 준비

1. 경심 관류 및 장기 적출
   1. 호흡이 멈출 때까지 CO₂를 사용하여 마우스를 마취합니다.
   2. 마우스를 누운 위치에 놓고 팔다리를 고정합니다.
   3. 복부를 따라 정중선을 절개하고 흉곽을 향해 측면으로 뻗어 흉강을 노출시킵니다.
   4. 좌심실에 바늘을 조심스럽게 삽입하고 우심방을 횡단하여 관류액 배출을 허용합니다.
   5. 소포 제제의 경우 순환계에서 혈액이 제거될 때까지 차가운 1x PBS로 관류합니다.
   6. 동결 절제의 경우 PBS 관류 후 4% 파라포름알데히드(PFA)로 계속 관류하여 조직을 고정합니다.
   7. 조심스럽게 심장을 추출하여 즉시 얼음 위에 올려 놓습니다.
   8. 가는 가위를 사용하여 두피의 정중선을 따라 조심스럽게 자르고 피부를 벗겨내어 두개골을 드러냅니다.
   9. foramen magnum 근처의 두개골 기저부를 절개합니다.
   10. 가는 집게를 사용하여 세로 균열을 따라 두개골을 조심스럽게 들어 올려 뼈 조각을 제거하여 뇌를 드러냅니다.
   11. 구부러진 집게를 사용하여 뇌를 부드럽게 들어 올리고 뇌 신경을 절단하여 완전히 온전하게 추출합니다.
   12. 냉동 절편에 사용하는 경우 4°C에서 24시간 동안 4% PFA로 뇌를 수정하십시오.
   13. 소포 준비에 사용되는 경우 추가 처리를 위해 고정하지 않고 즉시 뇌를 얼음 위에 놓습니다.
2. 냉동 절편
   1. 4% PFA에서 뇌 또는 심장을 제거하고 닦아내십시오.
   2. cryomold에 OCT 화합물로 전체 장기를 삽입합니다.
   3. 완전히 응고될 때까지 금형을 -80°C 냉동고에 넣어 내장된 조직을 동결합니다.
   4. 절편하기 전에 저온 유지 장치 챔버와 시편 헤드를 -20°C로 평형을 이룹니다.
   5. -80°C 냉동고에서 냉동 유지 장치 챔버로 동결된 OCT 블록을 옮기고 10분 동안 평형을 이룹니다.
   6. 시편 척을 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 다음 OCT를 접착제로 얇게 도포합니다.
   7. 얼어붙은 OCT 블록을 척에 고정하여 올바른 방향을 확인합니다.
   8. 척을 저온 유지 장치 표본 홀더에 삽입하고 블레이드 위치를 조정합니다.
   9. 조직 표면이 노출될 때까지 과도한 OCT를 잘라냅니다.
   10. 조직을 10μm 두께로 절단하고 유리 슬라이드에 절편을 수집합니다.
   11. 실온에서 1시간 동안 섹션을 자연 건조한 후 섹션 위에 장착 매체를 적용하고 커버슬립을 배치하여 샘플을 밀봉합니다.
   12. 이미징을 위해 슬라이드를 4°C에서 보관하기 전에 장착 매체를 설정하십시오.
3. 소포 준비
   1. 심장 소포 준비
      1. 1x PBS로 경심 관류 후 심장을 추출하고 얼음 위에 놓습니다.
      2. 멸균 메스를 사용하여 심장 바닥에서 약 30mg의 심실 근육을 절개합니다.
      3. 소포 무결성을 유지하기 위해 5mM NaN₃와 함께 4-5mL의 10mM NaHCO₃가 들어 있는 원심분리 튜브로 조직을 옮깁니다.
      4. 완전히 용해될 때까지 균질화기를 사용하여 조직을 균질화합니다.
      5. 균질액을 10,000 ×g에서 20 분 동안 원 심분리하여 큰 파편을 제거하고 상층액을 수집합니다.
      6. 37,000 × g 에서 65 분 동안 초원심분리를 수행한 다음 상등액을 버리고 펠릿을 0.6 M KCl의 20 mM Tris-maleate 완충액(pH 6.8) 3-4 mL에 재현탁시킵니다.
      7. 37,000 × g 에서 65분 동안 초원심분리를 반복하여 가용화된 액토미오신 물질을 제거합니다.
      8. 0.5mL의 20mM 트리스-말레에이트 완충액(pH 6.8)에 최종 펠릿을 50mM KCl로 재현탁시켜 심장 소포 용액을 얻고 -80°C에서 보관합니다.
   2. 뇌 소포 준비
      1. 1x PBS로 경심 관류 후 뇌를 추출하여 얼음 위에 놓습니다.
      2. 1mm 마우스 뇌 관상 기질을 사용하여 뇌를 1mm 섹션으로 자릅니다.
      3. 후각구에서 세 번째와 네 번째 부분을 확인하고 조심스럽게 해부한다: 1) 양쪽 반구에서 가장 바깥쪽 피질층; 2) 단면의 중앙 영역에 위치한 해마.
      4. 뒤쪽 끝에서 소뇌의 기저부를 가로 절단하여 소뇌를 분리합니다.
      5. 적절한 소포 수율을 보장하기 위해 5마리의 쥐에서 동일한 뇌 영역을 모읍니다.
      6. 2mL의 저온 균질화 완충액(0.32 M 자당, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, 프로테아제 억제제, pH 7.4)에서 Dounce 균질화기를 사용하여 조직을 즉시 균질화합니다.
      7. 3mL의 추가 균질화 완충액과 200×g에서 15 분 동안 원 심분리를 추가하여 큰 조직 조각을 제거합니다.
      8. 상층액과 원심분리기를 1,000 × g 에서 4°C에서 15분 동안 수집하여 핵 분획을 제거합니다.
      9. 또한 상층액을 10,000 × g 에서 4 °C에서 20 분 동안 원심 분리하여 미토콘드리아를 제거합니다.
      10. 생성된 상층액을 100,000 × g 에서 4°C에서 2시간 동안 초원심분리하여 소포를 펠릿화합니다.
      11. 최종 소포 펠릿을 1x PBS에 재현탁시켜 뇌 소포 용액을 얻고 -80°C에서 보관합니다.
4. 나노입자 추적 분석(NTA)을 통한 나노소포 특성화
   1. 제조업체의 지침에 따라 감지 셀을 조립합니다.
   2. 기기를 켜고 호환 가능한 소프트웨어를 실행합니다.
   3. 1mL 주사기에 탈이온수(DI)를 로드하고 배경에 오염 물질이 제거될 때까지 시스템 튜브를 수동으로 세척합니다.
   4. 나노소포 시료를 1x PBS에 희석하여 제조합니다.
   5. 희석된 나노베시클 시료 ~1mL를 깨끗한 1mL 주사기에 넣고 기포가 없도록 합니다.
   6. 샘플을 검출 셀에 수동으로 주입하고 소포가 명확하게 보일 때까지 초점을 조정합니다.
   7. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 하드웨어 패널에서 유속 을 200μL/s 로 설정합니다.
   8. SOP 패널에서 측정 시간을 60초로, 사이클 수를 5로 설정하고, 온도 제어가 활성화되고 25°C로 설정되어 있는지 확인합니다. SOP 저장을 클릭하고 파일 이름을 적절하게 지정하여 설정을 새 SOP로 저장합니다(예: "nanovesicle_standard.sop").
   9. Capture(캡처) 패널에서 카메라 레벨 로 13 을, 초기 검출 임계값 을 3으로 선택하여 측량기 설정을 구성합니다.
   10. 실행을 클릭하고 이전에 저장한 SOP를 선택합니다. 소프트웨어는 설정에 따라 자동으로 측정을 수행합니다.
   11. 완료되면 분석을 클릭하여 각 비디오를 처리합니다. 모든 입자가 명확하게 보이도록 검출 임계값을 조정하고 배치 분석이 완료된 후 Finish 를 클릭합니다. Export Data( 데이터 내보내기) | 모든 측정을 선택하고 나중에 사용할 수 있도록 CSV 파일로 저장합니다.
   12. 실험을 완료한 후 잔류 소포가 남지 않을 때까지 ~ 2mL의 DI 물로 시스템을 세척합니다.
   13. 튜브를 통해 공기를 주입하여 남아 있는 액체를 제거하고 다음 사용을 위해 시스템이 건조되도록 합니다.

2. 이미징

1. 조직 동결 절편의 컨포칼 이미징
   1. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 전원을 켜고 연결된 소프트웨어를 엽니다.
   2. 적절한 대물렌즈(20x 공기 또는 60x 오일)를 선택하고 준비된 극저온 절편 슬라이드를 현미경 스테이지에 로드합니다.
   3. 535/70nm 방출 필터가 있는 488nm 레이저 라인을 사용하여 GFP 여기(excitation)에 대한 레이저 설정을 구성합니다.
   4. 핀홀 크기(28.9μm), 레이저 강도(17%) 및 검출기 게인(15.3)을 포함한 이미징 매개변수를 최적화하여 신호 대 잡음비를 높이는 동시에 광표백을 최소화합니다.
   5. 필요한 경우 상단 및 하단 초점면을 설정하고 적절한 스텝 크기(0.275μm)를 정의하여 Z 스택을 획득합니다.
   6. 대형 영역 이미지를 획득할 때 15% 이미지 오버랩으로 자동화된 이미지 스티칭을 가능하게 합니다.
   7. 이미지 해상도를 조정하고 필요한 경우 프레임 평균을 적용하여 배경 노이즈를 줄입니다.
   8. 추가 분석을 위해 이미지를 캡처하고 '.nd2' 형식으로 저장합니다.
2. 전반사 형광(TIRF) 이미징
   1. BAM(biocompatible anchor for membrane)을 통한 소포 고정화(Vesicle immobilization) 방법²²
      1. 35mm 유리 바닥 접시를 45 ° C에서 1 시간 동안 5M NaOH로 초음파 처리 한 다음 3 번의 철저한 DI 물 헹굼으로 청소합니다.
      2. 0.1 ° C에서 1 시간 동안 45 M HCl에서 접시를 초음파 처리 한 다음 DI 물을 세 번 더 헹굽니다.
      3. 세척된 유리 표면을 실온에서 30분 동안 에탄올에 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)으로 처리하여 아민 작용기를 도입합니다.
      4. 접시를 DI 물과 에탄올로 3번 헹구어 과도한 APTES를 제거하고 건조시킵니다.
      5. 100μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS(Sunbright OE-020CS)를 1x PBS에 10분 동안 배양합니다.
      6. PBS로 접시를 씻어 미반응 시약을 제거합니다.
      7. 원하는 농도로 소포를 도입하고 소포가 결합할 수 있도록 15분 동안 배양합니다.
      8. PBS로 접시를 부드럽게 헹구어 묶이지 않은 소포를 제거하면서 고정된 소포가 부착된 상태로 유지되도록 합니다.
   2. TIRF 이미징 설정 및 획득
      1. 도립 형광 현미경 488nm 레이저 소스 및 EMCCD 카메라의 전원을 켭니다.
      2. Metamorph 및 CellSens 소프트웨어를 실행하여 이미징 제어를 초기화합니다.
      3. 60x 오일 이멀젼 대물렌즈(1.49 NA APO)를 메탄올로 세척하여 먼지와 잔류 오일을 제거합니다.
      4. 굴절률(RI)과 일치하는 이멀젼 오일을 대물 렌즈에 작은 방울 떨어뜨립니다.
      5. 준비된 소포 접시를 현미경 스테이지에 놓고 최적의 정렬을 위해 중앙에 놓이도록 합니다.
      6. epifluorescence 모드에서 excitation beam을 objective의 back aperture 중앙에 배치하여 레이저 빔 초점을 조정합니다.
      7. 스테퍼 모터를 사용하여 임계각에 도달할 때까지 레이저 입사각을 조정하여 유리 표면에서 전체 내부 반사를 보장합니다.
      8. Z-축을 통해 스캐닝하여 초점면을 식별하고, 다음을 구별합니다: 1) 유리 바닥 표면에 해당하는 첫 번째 초점면; 2) 소포 고정 표면에 해당하는 제 2 초점 평면.
      9. 소포에 초점이 맞춰지면 CellSens에서 자동 초점을 적용하여 이 평면에서 대물렌즈 위치를 고정하여 이미징 중 드리프트를 방지합니다.
      10. 레이저를 일시적으로 끄고 현미경 스테이지를 아직 여기광에 노출되지 않은 새로운 시야로 이동합니다.
      11. 레이저를 켜는 동시에 기록을 시작하여 사전 노출 없이 전체 광표백 과정을 캡처할 수 있습니다.
      12. 다음 매개변수로 이미지 획득: 노출 시간: 프레임당 100ms, 획득 모드: 시야당 900 연속 프레임, 게인 설정: 1,400.
      13. 충분한 데이터 수집을 보장하기 위해 여러 시야에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
      14. 추가 처리를 위해 이미지 스택을 TIFF 형식으로 저장합니다.

3. 이미지 처리 및 데이터 분석

1. 컨포칼 이미지 프로세싱
   1. 연결된 소프트웨어에서 획득한 컨포칼 이미지를 엽니다.
   2. LUT(Look-Up Table) 설정을 조정하여 밝기와 대비를 최적화합니다.
   3. 시각적 일관성을 유지하기 위해 모든 이미지에 동일한 LUT 조정을 균일하게 적용합니다.
2. TIRF 비디오 처리 및 형광 강도 분석
   1. 시각화를 위한 비디오 처리
      1. 시각화를 위해 ImageJ에서 획득한 TIRF 이미지 스택(TIFF 형식)을 엽니다.
      2. 밝기와 대비를 조정하여 신호 선명도를 향상시키고 형광 소포를 배경과 쉽게 구별할 수 있도록 합니다.
      3. 프레젠테이션 또는 추가 정성 분석을 위해 조정된 이미지를 내보냅니다.
   2. 광표백 단계 분석
      1. 시간 추적 추출
         1. "getTimeTraces.m"이라는 MATLAB 스크립트( 보충 파일 1 참조)를 열고 실행합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)에서 [동영상 로드] 를 클릭하고 TIRF 이미징 .tiff 파일을 선택하여 베시클 동영상 스택을 가져옵니다.
         2. Find Peaks를 클릭하여 단일 분자 형광 신호를 자동으로 식별합니다. 신호 영역은 미리보기 창에서 원으로 표시됩니다.
         3. 데이터 채우기를 클릭합니다. 이렇게 하면 다운스트림 분석을 위해 각 지점에 대한 시간 강도 추적을 .xlsx 파일로 내보냅니다.
      2. 수동 단계 계산
         1. "simpleGraph.m" 스크립트( 보충 파일 1 참조)를 실행하여 GUI를 실행하고, 데이터 파일 로드 를 클릭한 다음 3.2.2.1.3단계에서 생성된 .xlsx 파일을 선택합니다.
         2. 왼쪽 패널에 표시된 각 시간 추적의 표백 단계를 검사합니다. 다음 기준을 충족하는 트레이스만 분석에 허용되는지 확인합니다: 1) 시간 트레이스에는 하나 이상의 고유한 표백 단계가 포함되어 있습니다. 2) 한 단계의 지속 시간은 최소 1초입니다. 3) 단계 수준 간의 강도 차이는 표백 후 강도의 표준 편차의 3배 이상입니다.
         3. 오른쪽에서 Step # 필드를 찾아 + 또는 - 버튼을 사용하여 각 트레이스에 대한 광표백 단계 수를 입력합니다.
         4. 각 항목을 완료한 후 다음을 클릭하여 다음 추적으로 이동합니다. 모든 트레이스가 처리되면 소프트웨어는 각 트레이스의 단계 수를 기록하는 .txt 파일을 자동으로 생성하고 저장합니다.
      3. 걸음 수 요약
         1. "CombinedFiles.m" 스크립트( 보충 파일 1 참조)를 실행하여 GUI를 엽니다.
         2. 텍스트 상자에 요약 출력에 대해 원하는 이름을 입력합니다.
         3. 여러 simpleGraph 결과를 하나의 파일로 결합을 클릭합니다. 파일 브라우저에서 3.2.2.2.3단계에서 생성된 원하는 .txt 파일을 하나 이상 선택합니다. 스크립트는 모든 단계 수 데이터를 자동으로 컴파일하고 1단계, 2단계의 빈도를 요약하는 결합된 .xlsx 파일을 생성합니다,... 추적.

결과

이 방법의 적용 가능성을 확인하기 위해 먼저 심장 및 신경 조직 동결 절편의 컨포칼 이미징을 통해 GFP-RyR2의 발현 및 국소화를 확인했습니다(그림 1). 심장 조직의 형광 신호는 심근세포에서 RyR2의 예상 국소화와 일치하는 횡방향 줄무늬 패턴을 보였지만 뇌의 특정 영역, 즉 피질, 해마, 소뇌에서 높은 강도를 보였으며, 이는 지역 특이적 발현을 나타냅니다.

당사의 최적화된 전처리 프로토콜(그림 2A)을 사용하여 이러한 조직에서 소포를 생성한 후, 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 샘플 전반에 걸쳐 일관된 크기 분포를 확인함으로써 심장 유래 소포와 뇌 유래 소포 간의 비교를 확인했습니다(그림 2B

토론

이 연구는 GFP 태그가 지정된 RyR2를 모델 시스템으로 사용하여 막 수용체의 생체 외 캡슐화 및 단일 분자 이미징을 위한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 수립합니다. 이 프로토콜은 네이티브 조직에서 직접 수용체 복합체의 화학량론적 분석을 가능하게 하여 막 단백질의 생리학적 맥락을 보존함으로써 현재 방법을 크게 발전시켰습니다. 기존의 체외 발현 시스템과 비교했을 때, 이 접근법은 과발현 또는 세제 용해화로 인해 발생하는 아티팩트를 최소화하여 수용체 조립체에 대한 생물학적으로 더 관련성 있는 통찰력을 제공합니다 ^5,8.

이 방법의 중요성은 광표백 단계를 사용하여 단일 분자 수준에서 수용체 화학량론을 검출할 수 있는 능력에 의해 강조되며, 이를 통해 이질적인 집단을 해결하고 미묘한 구조적 변형을 검출할...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 접시 | No. 1.5 커버슬립 | 14mm 유리 직경	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Tissue-Tek Cryomold 금형/어댑터	Fisher Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML(	3-아미노프로필)트리에톡시실란
Bio-Gen PRO200 실험실 균질화기	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	해당 없음
EMCCD 카메라	및도르	해당 사항 없음	iXon Ultra 897
에탄올 절대 ≥ 분자 생물학을 위한 100% (v/v) USP(200 Proof)VWR		71006-012
Leica CM1860	Leica	n/a	극저온 조절기
MetaMorph Advanced	Molecular Devices	n/a
Nanosight NS300(Nanosight NTA 소프트웨어 포함)	Malvern Panalytical	n/a
Nikon AXR 도립 공초점 현미경	Nikon	n/a
Olympus IX83 전동 자동 초점 도립 형광 현미경	Olympus	n/a	TIRFM
파라포름알데히드 4% PBS 즉시 사용 가능한 고정 시약	VWR	76221-378
인산염 완충 식염수(PBS) 20x, 초순수 등급	VWR	97062-950
수산화나트륨, 비드, 시약 등급	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF America Corporation	n/a	Oleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek OCT 화합물	Sakura	M71484
VectaMount AQ 수성 마운팅 매체	벡터 실험실	H-5501-60