이 프로토콜은 단단하고 마이콜산이 풍부한 세포벽이 제기하는 도전을 극복하여 마이코박테리아로부터 고품질 DNA를 추출하는 CTAB 방법을 설명합니다. 이 과정은 효소 소화, CTAB를 이용한 세포 용해, 유기 추출과 에탄올 침전을 통한 DNA 정제를 포함합니다. 이 방법은 분자 연구에 적합한 DNA를 생성하며, 균세균 연구에 신뢰할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
효율적이고 신뢰할 수 있는 DNA 추출은 분자생물학의 근본적인 단계로, PCR, 시퀀싱, 유전체 분석과 같은 후속 응용에 고품질 유전 물질을 제공합니다. 그러나 지질과 균산이 풍부한 마이코박테리아의 독특한 세포벽 구성은 효율적인 DNA 분리에 큰 도전 과제를 제기합니다. 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 방법은 빠르게 성장하는 균주와 느린 균주를 포함한 균주에서 고순도 DNA를 추출하는 효율성 덕분에 널리 사용되고 있습니다. 이 기술은 라이소자임과 단백질효소 K를 이용해 박테리아 세포를 효소적으로 파괴한 후, CTAB를 이용해 세포 구성 요소를 용해하여 다당류 및 단백질과 복합체를 선택적으로 결합하는 과정을 포함합니다. DNA 정제와 농합은 유기 용매 추출과 에탄올 침전을 통해 이루어집니다. 저희 데이터에 따르면, CTAB 프로토콜은 젤 전기영동과 나노드롭 분석을 통해 고품질과 최소한의 오염으로 고양의 DNA(200 - 1000 ng/μL)를 생성합니다. 다양한 마이코박테리아 종에서 추출된 DNA는 높은 순도를 지니며 다양한 분자 연구에 적합합니다. 본 연구는 CTAB 방법의 절차적 단계를 보여주며, 마이코박테리아 DNA 추출과 관련된 독특한 도전 과제를 극복하는 데 그 유용성을 강조합니다.
서론
고품질 DNA 추출은 분자생물학에서 기본적인 단계로, PCR, 전체 유전체 시퀀싱, 기타 유전체 연구와 같은 후속 응용에 필수적입니다. 마이코박테리움은 마이코박테리아 결핵(M.tuberculosis)과 같은 병원성 종과 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)와 같은 비병원성 환경 종을 모두 포함하는 속으로, 두껍고 지질이 풍부하며 소수성 세포벽 때문에 DNA 추출이 어려울 수 있습니다 1,2,3. 이 단단한 세포벽은 세포를 파괴하고 유전체 DNA를 효과적으로 방출하기 위해 특수 용해 방법을 사용해야 합니다.
세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 방법은 다양한 마이코박테리아 종에서 고품질 DNA를 분리하는 데 신뢰성이 입증되었습니다 4,5. 양이온성 계면활성제인 CTAB는 다당류 및 기타 세포 성분에 결합하여 추출 과정에서 이들의 제거를 용이하게 합니다. 어려운 샘플에서도 CTAB 기반 프로토콜은 효소 용해, 열처리, 유기 용매 추출과 결합할 때 온전하고 순수한 DNA의 효율적인 분리를 보장합니다 7,8. CTAB 방법은 마이코박테리아 종에서 효율적인 DNA 추출에 중요한 역할을 했으며, 특히 순수하고 고품질의 DNA 입력 물질이 필요한 전체 유전체 시퀀싱, 메타게놈학, 분자 진단 연구에서 중요한 역할을 했습니다 9,10. 비드 비딩이나 상업용 키트와 같은 다른 DNA 추출 기술과 비교할 때, 여기서 제시된 CTAB 프로토콜은 장기 독기 시퀀싱과 후생유전학 응용에 필수적인 DNA 무결성 보존에 있어 뚜렷한 이점을 제공합니다. 이전 연구들은 CTAB가 기계적 파괴 방법에 비해 낮은 DNA 수율을 보고했지만, 동시에 CTAB가 DNA 전단을 최소화하고 DNA 무결성을 유지하는 능력을 강조합니다11,12. 순도와 수율의 한계를 해결하기 위해 현재 프로토콜은 배양 시간을 단축하고 다양한 샘플 유형에서 일관성을 개선하는 방식으로 최적화되었습니다. 이러한 정교함은 Opperman 등의 연구 결과에 의해 뒷받침되었는데, 이들은 Mycobacterium avium 배양에서 추출한 DNA가 16S rRNA 시퀀싱 및 라인 프로브 분석과 같은 후속 응용에 충분한 농도와 품질을 갖추었음을 입증했으며, 특히 고급 분자 분석을 위해 온전한 유전체 DNA가 필요한 연구에서 CTAB 프로토콜을 다재다능하고 확장 가능한 마이코박테리아 연구의 도구로 활용할 수 있음을 더욱 뒷받침했습니다13. 또한 차세대 시퀀싱(NGS)은 일반적으로 100-1000 ng의 고품질 유전체 DNA14를 필요로 하며, PacBio 시퀀싱과 같은 롱리드 시퀀싱의 경우 고품질 DNA15 ≥5 μg가 필요하므로, 대량의 고품질의 온전한 DNA가 필요할 때는 CTAB가효과적인 방법으로 남아 있습니다.
용해하기 어려운 미생물로부터 효율적이고 일관되며 효과적인 DNA 추출 방법론을 확립하는 것은 실험실 간 재현성과 신뢰성을 보장하기 위해 필요하며, 특히 균주 식별 및 역학 연구에 활용됩니다 5,7. 이 프로토콜은 CTAB 방법을 사용하여 마이코박테리아로부터 전체 유전체 DNA를 추출하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 현재 프로토콜은 독특한 마이코박테리아세포벽이 제기하는 함정을 해결하고 도전을 극복함으로써 연구자들이 분자생물학 워크플로우에서 일관되고 신뢰할 수 있는 결과를 달성할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
대표성 결과는 스텔렌보쉬 대학교 REC: BES 윤리 위원회(BES-2024-22504)의 승인을 받아 산출되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 마이코박테리아 배양 현탁액 제조
참고: 검사 대상 종에 따라 이 단계는 생물안전 레벨 2(BSL-2) 또는 생물안전 레벨 3(BSL-3) 실험실에서 수행되어야 합니다. 배양 시기와 조건은 균류류의 성장 속도와 생리적 특성 때문에 성장 요구에 따라 달라집니다.
- 각각 5mL 또는 8mL의 박테리아 배양물을 Middlebrook 7H9 액체 배지 또는 MGIT 배지에 OADC를 보충하여 37°C에서 배양하여 박테리아 증식을 허용합니다. 느리게 성장하는 마이코박테리아는 10-14일이 걸리며, 빠르게 성장하는 마이코박테리아는 약 2-5일이 걸립니다.
참고: 시작 배양이 고체 한천 플레이트(예: Middlebrook 7H10 한천)에서 시작된 경우, 멸균된 이중 증류수에 여러 군집을 긁어 넣어 마이코박테리아 세포의 현탁액을 준비할 수 있습니다. - 액체 배양물을 15mL 튜브에 부어주세요.
- 인큐베이터에서 80°C에서 1시간 동안 열죽입니다.
- 결 핵균 이나 BSL-3가 필요한 기타 병원성 종의 경우, 열로 죽인 배양물을 BSL-2 실험실로 옮깁니다.
2. 세포벽 소화 및 DNA 추출
참고: 배양물이 열로 비활성화된 후에는 다음 단계들을 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 안전하게 수행할 수 있습니다. 만약 장기 독자 시퀀싱이나 고분자량 DNA가 필요한 대체 응용 분야를 위한 추출이 목표라면, 넓은 구경 피펫 팁을 반드시 사용하고, 보텍스 단계에서는 보텍스 대신 반전(inversion) 또는 피펫 혼합으로 교체하세요.
- 15 mL 튜브를 3220 x g 에서 실온(RT)에서 15-30분 원심분리합니다. 투명한 상정액은 버리고(모든 매체가 제거되었는지 확인하세요).
- 배양 펠릿을 300 μL Tris-EDTA(TE) 완충액에 완전히 재현탁합니다.
- 재현탁된 펠릿을 2mL 튜브로 옮깁니다.
- 100 μL 라이소자임(10 mg/mL)을 추가하고 피펫으로 5번 위아래로 섞은 후, 튜브를 부드럽게 두드려 균일한 분산을 보장합니다.
- 혼합물을 37°C에서 회전식 인큐베이터에서 하룻밤(~16시간)에 배양하세요; 배양 시간이 짧으면 용해 효율이 떨어져 DNA 수율이 낮아질 수 있습니다.
- 다음 날, 단백질분해효소 K 5 μL(10 mg/mL)과 10% SDS 70 μL 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, 샘플이 다섯 개라면 10% SDS 350 μL 및 프로테�나제 K 25 μL 혼합하여 거품 형성을 방지합니다.
- 각 샘플에 혼합물을 75 μL씩 첨가합니다.
- 탭핑하여 혼합한 후 65°C에서 인큐베이터나 가열 블록에서 10분간 배양하고, 간헐적으로 역전으로 혼합합니다.
- 5 M NaCl 100 μL 첨가.
- 65 °C에서 100 μL 예열된 CTAB/NaCl 용액을 추가합니다.
참고: 피펫팅 정확도를 보장하기 전에 CTAB/NaCl 용액을 65 °C로 가열하며, RT 시 물질의 점도를 고려하십시오. - 용액이 우유가 될 때까지 두드려 섞으세요.
- 65°C에서 인큐베이터나 가열 블록에서 10분간 배큐하며, 간헐적으로 역전을 통해 혼합합니다.
- 각 샘플에 같은 부피(~ 675 μL)의 클로로포름/이소아밀 알코올 용액(24:1)을 추가하고 탭하여 혼합합니다.
참고: 이 단계는 배기함에서 진행하시기 때문에, 클로로포름은 흡입 시 독성이 있어 주의가 필요합니다. - 샘플을 12000 x g 온도에서 실온에서 10분간 원심분리합니다.
- 550-600 μL 상의 수상을 조심스럽게 흡인하여 멸균된 1.5mL 튜브에 넣고 적절히 라벨링하세요.
참고: 다른 층을 건드리지 않도록 주의하세요. 만약 어떤 층이 의도치 않게 손상된다면, 튜브를 다시 원심분리하세요.
3. DNA 침전 및 용출
- 같은 부피(550-600 μL)의 얼음 차가운 이소프로판올을 넣고 튜브를 뒤집어 혼합합니다.
참고: DNA 농도가 높으면 혼합 과정에서 흰색 침전물이 발생할 수 있습니다. - 튜브를 -20°C에서 30분에서 1시간 정도 부화하세요.
참고: 더 긴 배양 시간은 DNA 침전을 증가시킬 수 있지만 , 염분 침전을 유발할 수도 있습니다. 따라서 DNA 농도가 낮을 것으로 예상되면 하룻밤 배양이 가능합니다. - 상온에서 최고 속도(~21130 x g)로 30분간 원심분리하여 불용성 DNA를 펠릿으로 만듭니다.
참고: 1.5 튜브의 앞면이 원심분리기 로터 안쪽을 향하도록 하세요. 이 단계에서 DNA는 튜브 하단과 뒤쪽에 침전됩니다. 이는 다음 단계에서 보이지 않을 수 있는 펠릿을 방해하지 않도록 하는 데 중요합니다. DNA 농도가 높으면 흰색 침전물이나 펠릿이 보일 수 있습니다. 펠릿이 없다고 해서 추출 실패를 의미하지는 않습니다; 남은 단계들을 진행하세요. - DNA 펠릿을 방해하거나 빠르게 디캔팅하지 않고 튜브 앞면에서 상청액을 흡입하면서도 펠릿이 손상되지 않도록 하세요.
참고: 시작 배양이 작고 DNA 농도가 낮을 것으로 예상된다면 상청액을 흡인하는 것이 더 좋습니다. - 얼음처럼 차갑게 식은 75% 에탄올 1000 μL을 추가하세요.
- 튜브를 여러 번 뒤집어 섞으세요.
- 12000 g 에서 원심분리기를 30분간 × 30분 동안 (3단계와 같은 방향으로).
- 펠릿을 건드리지 않고 모든 에탄올을 흡입하거나 디캔트하세요.
참고: 높은 염분 강전이 예상되면 5-8단계를 반복할 수 있습니다. - 튜브는 RT에서 하룻밤 또는 최소 30분 이상 자연 건조시키세요.
- 각 튜브에 25-50 μL TE 버퍼(pH 8)를 추가하여 DNA를 재현탁합니다.
참고: DNA는 하류 적용이 EDTA에 민감할 경우 Tris(10 mM, pH 8) 버퍼 또는 뉴클레아제 무첨가물에 재현탁할 수 있습니다. - DNA 펠릿을 4°C에서 하룻밤 동안 재현탁시킵니다.
- 품질 관리 평가를 수행하기 전에 4°C에서 2-3일간 보관하세요.
- 장기간 보관할 때는 -80°C에서 보관하세요.
4. DNA 정량 및 품질 관리
참고: DNA 품질 관리는 일반적으로 미세부적 분광광도계와 겔 전기영동을 사용하여 수행됩니다. 형광 기반 정량 시스템도 추출된 DNA를 정량하는 데 사용할 수 있습니다.
- 분광광도계 방법
- 제조사의 지침에 따라 DNA 농도를 측정하고 품질을 결정하세요.
참고: DNA 샘플은 이상적으로 1.7에서 2.0 사이의 260/280 비율을 가집니다. DNA에서는 보통 순수한 수치로 1.8이 간주됩니다. 이 범위 이하의 값은 잔류 단백질, 구아니딘 또는 280nm 근처에서 강하게 흡수되는 기타 시약에 의한 오염을 나타냅니다. 2.0-2.2 사이의 260/230 비율이 이상적입니다. 비율이 예상보다 낮으면 EDTA, 페놀, 탄수화물과 같이 230nm에서 흡수되는 오염물질이 존재함을 나타낼 수 있습니다. 샘플의 흡수도 그래프도 확인해 보세요.
- 제조사의 지침에 따라 DNA 농도를 측정하고 품질을 결정하세요.
- 전기영동
- DNA 완전성을 평가하고 분해 또는 분해가 발생했는지 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동19 를 수행하세요.
- UV 겔 문서 시스템 하에서 DNA를 시각화하려면 SYBR Safe 염료가 포함된 1.0% 아가로스 젤을 사용하세요. 젤을 80V로 45분간 돌리세요.
참고: 목표는 DNA 사다리의 가장 높은 대역 위에 명확하고 뚜렷하며 분자량이 높은 밴드를 갖는 것입니다. 매번 신선한 1× TAE 버퍼를 사용하세요.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
CTAB 방법을 이용한 이 DNA 추출 프로토콜(그림 1)은 M. tuberculosis, M. abscessus, M. chelonea와 같은 다양한 마이코박테리아 종에 대해 평가되었습니다. DNA를 추출하여 샘플 간 수율, 순도, 무결성 등을 비교했습니다.
DNA 농도는 균사균 종마다 다르며, 일부 경우 190-600 ng/μL에서 >1000 ng/μL 사이였으며, 이는 CTAB가 고수율 DNA를 추출함을 나타냅니다. 260/280과 260/230 비율은 각각 1.9-2.0과 1.8-2.2 사이로 나타났으며, 이는 고순도 DNA를 나타냅니다(표 1). 분광광도계는 260 nm에서 단일 흡광도 피크를 나타냈습니다(그림 2B). 이 데이...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
대표적인 결과는 CTAB 방법이 균류균 종에서 DNA 추출과 DNA 추출 과정에서 발생하는 도전 과제를 해결하는 데 유용함을 보여줍니다. 마이코박테리아는 복잡하고 지질이 풍부한 세포벽으로 잘 알려져있습니다 2. 현재 결과는 PCR, 염기서열 분석 및 기타 유전체 연구와 같은 후속 응용에 적합한 고농도, 고품질 온전한 DNA를 제공한다는 점에서 이 기술의 성공에 기여하는 여러 중요한 측면을 강조합니다.
CTAB-DNA 추출 프로토콜은 수많은 균세균 종에서 고품질의 온전한 유전체 DNA를 안전하게 얻는 효과적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 입증되었습니다 4,10. 프로토콜의 여러 중요한 단계는 고품질의 대량 DNA 추출에 영향을 미칩니다. 마이코박테리아 세포벽은 마이콜산과 소수성...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 이 프로토콜 개발과 최적화에 기여한 결핵 유전체학 팀인 Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa, Rob M Warren에게 진심으로 감사를 표하며, 이 연구 전반에 걸쳐 귀중한 지원을 제공해 주신 분들께 감사드립니다. 이 연구와 참여자들은 남아프리카 의학 연구 위원회(SAMRC), 국립 연구 재단(NRF), 스텔렌보스 대학교(SU)로부터 보조금과 자금 지원을 받았습니다. 연구비 제공자들은 연구 설계, 데이터 수집, 분석, 원고 준비에 관여하지 않았습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 피펫 팁 | 어떤 공급업체든 | ||
| 10 & 마이크로; L 피펫 팁 | 어떤 공급업체든 | ||
| 10% 도데실 설페이트 나트륨 (SDS) | 머크 (시그마-알드리치) | 71736-100 ML | |
| 15 mL 폴리프로필렌 튜브 | 어떤 공급업체든 | ||
| 2ml 튜브와 1.5ml 튜브 | 어떤 공급업체든 | ||
| 200 & 마이크로; L 피펫 팁 | 어떤 공급업체든 | ||
| 2-프로판올, 분자 B& | 머크 (시그마-알드리치) | I9516-1L | -20 & deg에 저장; C |
| 37° C 인큐베이터 | 어떤 공급업체든 | ||
| 5 M NaCl | 머크 (시그마-알드리치) | S6546 - 100 ML | |
| 65° C 인큐베이터 | 어떤 공급업체든 | ||
| 아가로스 젤 | 머크 (시그마-알드리치) | ||
| 바이오-래드 UV 젤 문서 시스템, | 바이오래드 | ||
| 원심분리기(15ml 튜브 50ml용)와 마이크로퓨지(2ml 튜브용) | 어떤 공급업체든 | ||
| 분석을 위한 클로로포름 EMPARTA® ACS | 머크 (시그마-알드리치) | 1070242500 | |
| 클로로포름/이소아밀 알코올 (24:1) | 훈풍 후드에서 클로로포름 384ml와 아이소아밀 알코올 16ml를 혼합합니다 | ||
| CTAB/NaCl 솔루션 | 머크 (시그마-알드리치) | 52370-100 G | 4.1g NaCl을 80ml 증류수에 녹입니다. 저을 때 CTAB 10g을 넣습니다. 65도의 열용액; C 인큐베이터. 증류수를 넣어 부피를 100ml로 조절하세요. 상온에서 최대 6개월간 보관하세요. |
| DNA 1 Kb 사다리 | 써모피셔 사이언티브 | ||
| 에틸 알코올, 순도, 200도, MO& | 머크 (시그마-알드리치) | E7023-500ML | 절대 에탄올 75ml와 증류수 25ml를 섞으세요 |
| 라이소자임 (10 mg/ml) | 머크 (시그마-알드리치) | 10837059001 | 상온에 담긴 동온 라이소자임을 증류수로 10 mg/ml로 재구성합니다 |
| 미들브룩 7H9 미디어 | 머크 (시그마-알드리치) | M0178 | 액체 매체 준비 시 제조사의 지침을 따르세요 |
| 미들브룩 OADC 농축 6 x 100 ML F | BD | 212240 | |
| 마이코박테리아 성장 지표관(MGIT) 배지 | BD | 245122 | |
| 나노드롭 시스템 | 써모피셔 사이언티브 | ||
| P10 피펫 | 어떤 공급업체든 | ||
| P1000 피펫 | 어떤 공급업체든 | ||
| P200 피펫 | 어떤 공급업체든 | ||
| 단백질분해효소 K, 재조합, PCR grd 2x250mg | 머크 (시그마-알드리치) | 3115801001 | 동화 단백질분해효소 K 바이알을 증류수와 함께 10 mg/ml로 재구성합니다. 알리코트를 2ml 튜브에 -20 & 도에서 냉동하세요; C |
| SYBR-세이프 | 써모피셔 사이언티브 | ||
| Tris/EDTA (TE) 완충 pH 8.0 | 머크 (시그마-알드리치) | 8890-OP 또는 382499997 | |
| 소용돌이 | 어떤 공급업체든 |
참고문헌
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
- Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
- Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
- Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
- Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
- Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
- Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
- Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
- Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
- Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
- Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
- Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
- Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
- Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
- Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
- Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
- Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
- Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
- Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
