Method Article

살아있는 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤군에 의해 매개되는 세포-세포 접촉을 평가하기 위한 GFP 상보 기반 이중 발현 시스템

DOI:

10.3791/68411

⸱

August 22nd, 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 GFP 재구성 기반 접근법을 사용하여 살아있는 초파리 날개 상상 디스크의 인접한 상피층에 있는 세포 간의 접촉을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

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배아 조직 성장 및 패턴화는 조직 자체 내의 세포 집단 간에 국소적으로 교환되는 신호에 의해 크게 제어됩니다. 사이톤군은 초파리에서 처음 확인된 신호 전달 사상체증의 일종으로, 신호 생성 세포와 신호 수신 세포 사이의 교환을 연결하고 매개합니다. 발달 중인 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤은 성체 날개를 형성할 디스크 고유(DP) 상피 내의 별개의 세포 집단 사이뿐만 아니라 DP 세포와 인접한 디스크 관련 조직의 세포 사이의 신호 교환에 관여합니다. 사이톤메는 표적 세포와 시냅스를 형성하여 친밀한 막 접촉을 형성합니다.

여기에서, 우리는 살아있는 날개 디스크에서 GFP 재구성 접근법을 사용하여 디스크 내강에 의해 DP 세포와 분리되는 DP 세포와 인접한 족주막(PerM) 상피의 세포 사이의 사이톤체 매개 접촉을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. GAL4-UAS 및 LexA-LexAop 시스템을 사용하여 각각 CD4의 막관통 도메인에 융합된 분할-GFP(spGFP1-10, spGFP11)의 상보적 단편이 디스크 내강의 양쪽에서 발현됩니다. 그런 다음 공초점 현미경에 의한 살아있는 날개 디스크 준비에서 재구성된 GFP 형광의 이미징을 사용하여 재구성된 GFP 형광을 국소화하고 정량화할 수 있는 이미지 스택을 생성합니다. 이 시스템을 사용하면 세포톤 생성 또는 표적 세포에서 단백질 코딩 또는 RNA 간섭 이식 유전자를 공동 발현하여 DP-PerM 세포 접촉에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 다른 조직에 쉽게 적응할 수 있는 이 시스템은 사이톤체 형성 또는 기능에 중요한 요인을 식별할 수 있습니다.

Introduction

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배아 조직의 발달은 조직 내의 먼 세포에 신호를 보내는 '조직 센터'에 위치한 세포에 의해 제어되며, 증식(즉, 성장 및 분열) 또는 특정 운명을 채택하는 결정을 제어합니다1. 이 세포 비자율 신호 전달은 조직을 통해 농도 구배를 형성하고 농도 의존적 반응을 유도하는 중심 세포를 조직화하여 생성된 리간드에 의해 매개됩니다. 많은 경우, 이러한 리간드는 조직의 신호 송수신 세포를 연결하는 사이톤군이라고 하는 긴 액틴 기반 신호 송구 사상증을 통해 전달되거나 포착됩니다 2,3. 초파리 날개 상상 디스크4에서 처음 발견된 세포탐은 포유류 및 기타 척추동물에서도 확인되었습니다 5,6,7,8,9. 초기 단계에서 세포 비자율 신호 전달에서 사이톤군의 역할을 더 잘 이....

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Protocol

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nubbin-GAL4 드라이버는 DP의 날개 주머니 영역에서 특이적으로 CD4-spGFP1-10을 발현하는 데 사용됩니다(그림 1A). PerM-LexA 드라이버(21)는 PerM에서 특이적으로 CD4-spGFP11을 발현하는 데 사용된다(그림 1A). 이 두 발현 시스템은 서로 독립적이어서 DP 및 PerM에서 서로 다른 이식유전자의 동시 특이적 발현을 허용합니다(그림 1B,C).

기본 유전 체계는 유전자형 nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10의 유충을 생성하기 위해 파리를 교배하는 것을 포함합니다. PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. 음성 대조군으로서 LexAop-CD4-spGFP11 이식유전자를 생략합니다. 다른 이식유전자(예: 단백질 코딩, 이중 가닥 RNA)는 DP 층( UAS 서열의 제어 하에) 또는 PerM( LexA 운영자의 제어 하에)에서 원하는 대로 발현될 수 있습니다.

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Results

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DP와 PerM 세포 사이의 접촉을 측정하기 위한 GRASP 절차의 유용성을 테스트하기 위해 우리는 네 가지 다른 유전자형의 날개 디스크를 조사했습니다: GFP 채널에서 자가형광의 배경 수준만 표시하는 야생형 음성 대조군 디스크(유전자형: w1118); DP 층에서 CD4-spGFP1-10을 발현하지만 CD4-spGFP11 전이유전자가 없는 디스크는 GFP1-10 단독으로 생성된 형광 수준을 보여줍니다(GFP1-10은 형광을 발하지 않아야 하므로 무시할 수 있을 것으로 예상됨26); CD4-spGFP1-10 및 CD4-spGFP11이 각각 DP 및 PerM에서 발현되는 디스크(그림 3A), 이는 DP-PerM 접촉의 "정상" 수준을 나타냅니다. CD4-spGFP1-10 및 CD4-spGFP11 외에도 UAS 제어 하에 DP 세포에서 Ser/Thr 단백질 키나아제 Slik을 발현하는 .......

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Discussion

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사이톤암은 리간드 분포에 중요한 역할을 하며 발달 중인 조직의 성장과 조직을 제어합니다. 신호 교환은 사이톤체 팁이 표적과 친밀한 막 접촉을 하는 곳에서 발생합니다. 이 프로토콜에서 우리는 GRASP 기술을 사용하여 날개 디스크의 상피층 사이의 사이톤체 매개 접촉을 분석하는 간단한 방법을 설명합니다.

여기에 제시된 기술은 최소한 4개의 구성 요소(GAL4 드라이버, LexA 드라이버 및 UAS 및 LexAop 제어 하에서 상보적 spGFP 단편의 CD4 융합을 암호화하는 2개의 이식유전자)를 필요로 합니다. 우리는 우리가 선택한 드라이버를 사용하여 CD4-spGFP 단백질 중 하나의 발현과 관련된 식별 가능한 효과나 치사율을 검출하지 못했습니다. 따라서 네 가지 구성 요소를 모두 안정적으로 포함하는 범용 드라이버 스톡을 구성할 수 있습니다. 이 스톡은 DP 및/또는 PerM 세포에서 유전.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 경쟁 이해관계가 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 DH에 대한 CIHR 보조금(PJT-162109)의 지원을 받았습니다. MJ는 Institut de Recherches Cliniques de Montréal Foundation과 몬트리올 대학의 분자 생물학 프로그램에서 박사 장학금을 받았습니다. 저자는 IRCM 현미경 및 이미징 플랫폼의 도움을 크게 인정합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Discovery V12 해부 현미경자이스해부 현미경
Dumont #55 집게, 생물학 팁정밀 과학 도구11255-20집게를 해부하는
EP-Slik (slik20358)BDSC의Panneton et al. 2015 Slik을 표현하기 위한 플라이 균주
피지Schindelin, J. et al. (2012) 이미지 분석 소프트웨어
회크스트 33342 써모피셔 사이언티픽H3570 라이브 이미징 핵 염색 
LexAop-CD4-spGFP11  BDSC의93018플라이 스트레인
LSM 700 컨포칼 현미경 자이스공초점 현미경
nub-GAL4블루밍턴 초파리 스톡 센터(BDSC)86108플라이 스트레인
PerM-LexARambaud, Joseph 외, 2025플라이 스트레인
PYREX 9 함몰 유리 스폿 플레이트 판매코닝 생명과학7220-85유충 채취 및 세척용
슈나이더의 초파리 배지써모피셔 사이언티픽21720024라이브 이미징 매체
SecureSeal 이미징 스페이서, 8웰, 두께 0.12mm 그레이스 바이오 랩스654008스페이서
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트실가르드3097358-1004해부판 제작용
UAS-CD4-spGFP1-10  BDSC의93017플라이 스트레인
젠 블랙자이스획득 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....

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Cytoneme Mediated ContactDrosophila Wing DiscGFP ComplementationLive ImagingConfocal MicroscopySplit GFP SystemCell Cell ContactPeripodial MembraneTissue Growth SignalingProtein Expression

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