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방법 논문

살아있는 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤군에 의해 매개되는 세포-세포 접촉을 평가하기 위한 GFP 상보 기반 이중 발현 시스템

897 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68411

⸱

2025년 8월 22일

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

이 논문에서

요약

우리는 GFP 재구성 기반 접근법을 사용하여 살아있는 초파리 날개 상상 디스크의 인접한 상피층에 있는 세포 간의 접촉을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

배아 조직 성장 및 패턴화는 조직 자체 내의 세포 집단 간에 국소적으로 교환되는 신호에 의해 크게 제어됩니다. 사이톤군은 초파리에서 처음 확인된 신호 전달 사상체증의 일종으로, 신호 생성 세포와 신호 수신 세포 사이의 교환을 연결하고 매개합니다. 발달 중인 초파리 날개 상상 디스크에서 사이톤은 성체 날개를 형성할 디스크 고유(DP) 상피 내의 별개의 세포 집단 사이뿐만 아니라 DP 세포와 인접한 디스크 관련 조직의 세포 사이의 신호 교환에 관여합니다. 사이톤메는 표적 세포와 시냅스를 형성하여 친밀한 막 접촉을 형성합니다.

여기에서, 우리는 살아있는 날개 디스크에서 GFP 재구성 접근법을 사용하여 디스크 내강에 의해 DP 세포와 분리되는 DP 세포와 인접한 족주막(PerM) 상피의 세포 사이의 사이톤체 매개 접촉을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. GAL4-UAS 및 LexA-LexAop 시스템을 사용하여 각각 CD4의 막관통 도메인에 융합된 분할-GFP(spGFP1-10, spGFP11)의 상보적 단편이 디스크 내강의 양쪽에서 발현됩니다. 그런 다음 공초점 현미경에 의한 살아있는 날개 디스크 준비에서 재구성된 GFP 형광의 이미징을 사용하여 재구성된 GFP 형광을 국소화하고 정량화할 수 있는 이미지 스택을 생성합니다. 이 시스템을 사용하면 세포톤 생성 또는 표적 세포에서 단백질 코딩 또는 RNA 간섭 이식 유전자를 공동 발현하여 DP-PerM 세포 접촉에 미치는 영향을 측정할 수 있습니다. 다른 조직에 쉽게 적응할 수 있는 이 시스템은 사이톤체 형성 또는 기능에 중요한 요인을 식별할 수 있습니다.

서론

배아 조직의 발달은 조직 내의 먼 세포에 신호를 보내는 '조직 센터'에 위치한 세포에 의해 제어되며, 증식(즉, 성장 및 분열) 또는 특정 운명을 채택하는 결정을 제어합니다1. 이 세포 비자율 신호 전달은 조직을 통해 농도 구배를 형성하고 농도 의존적 반응을 유도하는 중심 세포를 조직화하여 생성된 리간드에 의해 매개됩니다. 많은 경우, 이러한 리간드는 조직의 신호 송수신 세포를 연결하는 사이톤군이라고 하는 긴 액틴 기반 신호 송구 사상증을 통해 전달되거나 포착됩니다 2,3. 초파리 날개 상상 디스크4에서 처음 발견된 세포탐은 포유류 및 기타 척추동물에서도 확인되었습니다 5,6,7,8,9. 초기 단계에서 세포 비자율 신호 전달에서 사이톤군의 역할을 더 잘 이해하는 것은 세포가 조직으로 조직화하기 위해 어떻게 통신하는지, 그리고 이러한 통신 라인이 발달 기형 및 암을 포함한 다양한 병리학적 상태에서 어떻게 수정되는지 해독하는 데 중요합니다.

사이톤암은 소스 세포에서 리간드를 표적 세포로 전달하거나 표적 세포에서 소스에 가까운 리간드를 수신하기 위해 확장될 수 있습니다 2,3. 사이톤암은 표적과 친밀한 접촉을 하며, 여기서 리간드 전달이 발생할 수 있는 시냅스와 같은 구조를 형성하는 것으로 생각됩니다 3,10,11. 이 접촉은 소스 및 표적 사이톤의 끝 사이 또는 사이톤암과 세포체 사이에서 발생할 수 있습니다3. 광범위하게 특성화되지는 않았지만 접착 분자 또는 수용체-리간드 상호작용을 통한 세포 접착은 경우에 따라 다운스트림 신호 전달 이벤트의 적절한 활성화에 필요하며12,13,14, 이는 사이톤팀 생물학의 중요한 측면입니다.

여러 연구에서 "시냅스 파트너에 걸친 GFP 재구성"(GRASP) 기술을 세포 형성 접촉 분석에 적용했습니다. 이 방법은 복잡한 신경계에서 시냅스 파트너를 식별하고 매핑하기 위해 개발되었습니다15. 이는 서로 다른 세포 집단에서 각각 막관통 도메인(예: CD4)의 세포외 영역에 융합된 분할-GFP의 두 상보적 단편(spGFP1-10 및 spGFP11)의 발현을 기반으로 합니다. 이 두 집단에서 세포의 원형질막이 직접 접촉하면 spGFP의 상보적 도메인이 근접하여 GFP 형광이 재구성됩니다. 이 접근법은 초파리에서 날개 디스크 내의 세포 사이 및 날개 디스크와 기타 밀접하게 접합된 조직 사이의 세포 접촉의 존재를 식별하는 데 사용되었습니다 12,16,17,18,19,20,21.

이 논문은 초파리 날개 상상 디스크의 형태학적으로 구별되는 두 개의 상피층, 디스크(DP) 및 족주막(PerM) 사이의 접촉 특성화에 GRASP의 적용을 설명합니다. 이 상피층은 중앙 내강을 둘러싼 주머니를 형성하며, 가성층화된 원주형 DP 세포는 한쪽에 위치하고 편평 PerM 세포는 다른 쪽에 위치하며, 둘 다 정점막이 내강을 향하고 있습니다(그림 1A). 두 층 22,23,24,25 사이에 내강 신호 전달에 대한 일부 증거가 있으며, 우리는 최근 DP21에서 정점 사이톤에 의해 매개되는 PerM 세포의 증식을 제어하기 위해 DP로부터의 신호 전달을 문서화했습니다. 이 프로토콜은 GAL4/UAS 및 LexA/LexAop 이식유전자 발현 시스템을 사용하여 DP 및 PerM 세포의 막에서 CD4에 융합된 spGFP의 상보적 단편을 발현하는 것을 포함합니다. 재구성된 GFP 형광을 사용하여 두 세포 집단 사이의 막 접촉을 판독합니다.

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프로토콜

nubbin-GAL4 드라이버는 DP의 날개 주머니 영역에서 특이적으로 CD4-spGFP1-10을 발현하는 데 사용됩니다(그림 1A). PerM-LexA 드라이버(21)는 PerM에서 특이적으로 CD4-spGFP11을 발현하는 데 사용된다(그림 1A). 이 두 발현 시스템은 서로 독립적이어서 DP 및 PerM에서 서로 다른 이식유전자의 동시 특이적 발현을 허용합니다(그림 1B,C).

기본 유전 체계는 유전자형 nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10의 유충을 생성하기 위해 파리를 교배하는 것을 포함합니다. PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. 음성 대조군으로서 LexAop-CD4-spGFP11 이식유전자를 생략합니다. 다른 이식유전자(예: 단백질 코딩, 이중 가닥 RNA)는 DP 층( UAS 서열의 제어 하에) 또는 PerM( LexA 운영자의 제어 하에)에서 원하는 대로 발현될 수 있습니다.

이것은 중단할 수 없는 라이브 이미징 프로토콜입니다. 재료 준비는 ~10분으로 추정됩니다. 영상 촬영 전에 한 번에 20분 이상 해부를 수행해서는 안 됩니다. 이미징은 ~30분이 소요되며 ~1시간 이상 지속되어서는 안 됩니다. 여러 조건 또는 많은 수의 샘플의 경우 최상의 결과를 보장하기 위해 절차를 여러 라운드로 수행해야 합니다.

1. 재료 준비

  1. 해부에 앞서 청소한 핀셋, 9웰 유리 함몰 스팟 플레이트(또는 유충 수집 및 세척에 적합한 기타 용기) 및 70% 에탄올로 해부에 사용되는 재사용 가능한 Sylgard(실리콘) 코팅 페트리 접시.
  2. 70% 에탄올 세척을 수행한 다음 이미징 스페이서 를 건조된 슬라이드에 붙여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 가위로 8웰 스트립에서 개별 웰을 잘라내고 반으로 자릅니다(그림 2A). 각 절반의 한쪽에서 보호 지지대를 제거하고 디스크가 놓일 중앙에 보호된 공간을 만들기 위해 약간 간격을 두고 슬라이드에 스페이서를 붙입니다(그림 2B).
    알림: 우리의 경험에 따르면 슬라이드로 전달되는 매체의 정확한 양이 덜 중요하기 때문에 샘플 장착이 단순화됩니다. 작은 초과 부피는 커버슬립 시 틈을 통해 흘러나옵니다. 비교적 짧은 시간(일반적으로 ~1시간) 동안만 이미징했기 때문에 중간 건조에 문제가 발생하지 않았습니다.
  3. 라이브 이미징 배지(보충되지 않은 슈나이더의 초파리 배지를 냉동 10mL 분취량에 보관함)를 해동하고 얼음통에 쉽게 접근할 수 있도록 보관합니다.
  4. 2mL 미세 원심분리기 튜브에서 1.5mL의 배지와 200μg/mL Hoechst 33342 20μL(최종 농도 2.7μg/mL)을 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 이 특정 형태의 Hoechst 염료는 막 투과성이 높기 때문에 사용됩니다. 주의 : Hoechst 33342를 다룰 때는 장갑을 사용해야 합니다. 도구는 사용 후 세척해야 합니다.

2. 날개 디스크 해부 및 슬라이드 준비

  1. 유전적 교배 및 25°C에서 사육 후, 튜브에서 방황하는 3령 유충을 골라 9웰 유리 함몰 스팟 플레이트의 차가운 라이브 이미징 배지로 세척합니다.
    참고: 사이톤메는 매우 취약합니다. 다음 단계에서는 디스크와 해부 도구 사이의 직접적인 접촉을 피하면서 디스크 주변의 조직을 조작하는 데 주의를 기울여야 합니다. 우리는 한 번에 서너 마리의 유충을 준비하는데, 이는 몇 개의 디스크를 손상시키는 것이 불가피하고 이는 이미징 단계에서만 눈에 띄게 나타날 수 있기 때문입니다.
  2. 해부 현미경 아래에서 유충을 실리콘 코팅 페트리 접시의 라이브 이미징 배지 한 방울로 옮기고 두 개의 해부 겸자를 사용하여 해부를 시작합니다. 그렇게 하려면 먼저 몸 길이의 약 1/3(앞쪽에서)에서 한 쌍의 집게로 유충을 꼬집어 머리와 몸 앞쪽 부분을 안정적으로 유지합니다. 두 번째 집게를 사용하여 첫 번째 집게의 바로 뒤쪽에 몸을 꼬집습니다. 그런 다음 유충의 뒤쪽 부분을 당겨 앞쪽 "절반"을 분리합니다.
  3. 절단된 끝의 양쪽에 핀셋 한 쌍으로 고정하고 다른 한 쌍으로 머리를 밀어 넣어 앞쪽 절반을 뒤집어 (양말을 뒤집는 것처럼) 상상 디스크, 기관, 침샘, 뚱뚱한 몸체 및 장을 포함한 내부 구조를 노출시킵니다.
  4. 침샘, 지방체, 장을 조심스럽게 제거하고 날개 디스크 위에 놓여 보호해야 하는 기관의 측면 줄기를 방해하지 않도록 주의하십시오.
  5. 겸자를 사용하여 날개 디스크가 부착된 세척된 앞쪽 절반을 준비된 슬라이드의 스페이서 사이에 놓인 Hoechst가 있는 깨끗한 라이브 이미징 매체 한 방울로 조심스럽게 옮깁니다(그림 2C). 해부 겸자의 한 날 또는 해부 바늘 홀더에 부착된 가는 텅스텐 와이어를 사용하여 디스크에 연결된 기관의 미세한 가지에서 부드럽게 무딘 해부하여 날개 디스크를 나머지 조직에서 분리합니다. 나머지 시체는 버리십시오.
  6. 해부 겸자 또는 텅스텐 와이어 해부 바늘의 한 날을 사용하여 디스크의 방향을 잡습니다. 납작한 눈물방울 모양으로 인해 날개 디스크는 DP 또는 PerM이 위를 향하도록 떨어집니다. 이 프로토콜의 경우 PerM 면이 위로 향하도록 모든 디스크의 방향을 지정합니다.
  7. 필요에 따라 배지를 추가하거나 제거하여 웰을 완전히 채우도록 매체 부피를 조정하고, 이미징 스페이서의 수준보다 약간 높게 합니다. 각 이미징 스페이서 절반의 상단에서 보호 백킹을 제거한 다음 샘플 위로 커버슬립을 조심스럽게 내립니다. 커버슬립이 이미징 스페이서와 접촉하는 곳(예: 해부 겸자의 둥근 끝 부분)을 부드럽게 눌러 커버슬립이 스페이서에 부착되도록 합니다.
    알림: 중간 수준은 기포가 갇히는 것을 방지하기 위해 스페이서 높이보다 약간 높아야 하지만 커버슬립을 낮출 때 상당한 흐름을 생성할 정도로 높지는 않아야 합니다.

3. 이미징

  1. 40x/1.30 NA 오일 이침 렌즈 및 현미경 소프트웨어가 장착된 공초점 현미경(GFP의 경우 파장 488nm의 아르곤 이온 레이저, Hoechst의 경우 파장 350nm의 UV 레이저)을 사용하여 실온에서 샘플을 이미지화합니다. PerM의 최고 수준(Hoechst 형광이 감소하는 곳) 바로 위에서 DP의 기저측에 이르는 1μm 스텝 크기의 이미지 스택을 획득하며, 이는 일반적으로 스택당 100개 이상의 이미지로 작동합니다. 반복되는 이미지 스택을 획득하여 타임랩스 동영상을 생성합니다.
    참고: 슬라이드를 ~1-2시간 이상 이미지화하지 않습니다.
  2. 현미경 소프트웨어 설정의 경우 8비트 코딩, 라인 평균화 2, 검출기 게인이 일반적으로 650에서 750 사이, 신호 블리드스루를 줄이기 위해 분리된 채널 트랙을 사용하여 이미지를 수집합니다. 모든 조건에 대해 동일한 레이저 및 검출기 설정을 사용하며, 각 조건에 대한 테스트를 미리 수행하여 미리 결정됩니다.
    참고: 40배 배율에서 이미지의 해상도는 μm당 5.0386픽셀(픽셀 크기: 0.1985 x 0.1985μm2)입니다. 우리의 설정에서 최적의 공초점 현미경 설정에는 가능한 한 많은 신호를 캡처하는 동시에 포화가 거의 또는 전혀 발생하지 않도록 가능한 가장 높은 레이저 강도(조직 손상 없이)가 포함되었습니다. 검출기 오프셋 및 획득 속도(필요한 경우)를 줄여 달성한 음성 대조군에서 평가된 가능한 가장 낮은 노이즈. 일반적으로 5% 미만의 레이저 출력과 최대 스캔 헤드 속도(Zen 소프트웨어 설정에서 '9')를 사용합니다. 단일 이미지 스택은 일반적으로 획득하는 데 ~1분 45초가 소요되며 타임랩스 분석을 위해 2-3분마다 이미지를 촬영합니다.

4. 이미지 분석

  1. ImageJ 소프트웨어 패키지의 최대 강도 투영 기능을 사용하는 프로젝트 스택( 이미지 | 스택 | Z 프로젝트에서 메뉴에서 최대 강도를 선택합니다).
  2. MIP 이미지에서 다각형 선택을 사용하여 날개 디스크 접힘 패턴(Hoechst 채널 사용)을 기반으로 날개 파우치 영역을 결정합니다. 외부 지우기 기능과 함께 GFP 채널에서 동일한 선택 항목을 사용합니다( 편집 | 외부 지우기)를 사용하여 모든 외부 픽셀 값을 0으로 설정합니다.
  3. MIP 이미지에서 Hoechst 채널을 사용하여 GFP 이미지를 정리하고, 특히 관련 픽셀 값을 0으로 설정하여 두 채널에 나타나는 인공 스팟을 제거합니다( 다각형 선택을 클릭한 다음 편집 | 지우기를 클릭).
  4. 정리된 MIP 이미지에서 히스토그램 함수를 사용합니다( 분석 | 히스토그램 | List)를 사용하여 모든 픽셀 값의 목록을 가져와 스프레드시트의 테이블에 복사합니다.
  5. 음성 대조군의 배경 신호 분석을 기반으로 임계값을 설정합니다(그런 다음 다른 샘플에서 확인됨, 토론 참조).
  6. 다음 공식을 사용하여 GFP 양성 표면의 백분율을 계산합니다.
    %GFP 양성 표면 = figure-protocol-1 × 100
  7. 각 값을 참조 조건(1로 설정됨)의 평균으로 나누어 마지막에 데이터를 정규화합니다.
    참고: 유효한 픽셀 = 값이 1≥ 픽셀, 값이 0으로 설정된 삭제된 픽셀은 사실상 무시됩니다. 픽셀 값 0은 자연스럽게 발생하지 않습니다.
  8. 디스크에서 재구성된 GFP 신호가 국소화되는 위치를 결정하려면 이미지 스택의 XZ 재슬라이스를 사용하여 디스크 상피의 정점기저축을 살펴봅니다. 보간 없이 피지에서 재슬라이스를 수행하고 쌍선형 보간과 함께 Scale 함수를 사용하여 Z축의 이미지 높이를 높여 가시성을 개선합니다.

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결과

DP와 PerM 세포 사이의 접촉을 측정하기 위한 GRASP 절차의 유용성을 테스트하기 위해 우리는 네 가지 다른 유전자형의 날개 디스크를 조사했습니다: GFP 채널에서 자가형광의 배경 수준만 표시하는 야생형 음성 대조군 디스크(유전자형: w1118); DP 층에서 CD4-spGFP1-10을 발현하지만 CD4-spGFP11 전이유전자가 없는 디스크는 GFP1-10 단독으로 생성된 형광 수준을 보여줍니다(GFP1-10은 형광을 발하지 않아야 하므로 무시할 수 있을 것으로 예상됨26); CD4-spGFP1-10 및 CD4-spGFP11이 각각 DP 및 PerM에서 발현되는 디스크(그림 3A), 이는 DP-PerM 접촉의 "정상" 수준을 나타냅니다. CD4-spGFP1-10 및 CD4-spGFP11 외에도 UAS 제어 하에 DP 세포에서 Ser/Thr 단백질 키나아제 Slik을 발현하는 ...

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토론

사이톤암은 리간드 분포에 중요한 역할을 하며 발달 중인 조직의 성장과 조직을 제어합니다. 신호 교환은 사이톤체 팁이 표적과 친밀한 막 접촉을 하는 곳에서 발생합니다. 이 프로토콜에서 우리는 GRASP 기술을 사용하여 날개 디스크의 상피층 사이의 사이톤체 매개 접촉을 분석하는 간단한 방법을 설명합니다.

여기에 제시된 기술은 최소한 4개의 구성 요소(GAL4 드라이버, LexA 드라이버 및 UAS 및 LexAop 제어 하에서 상보적 spGFP 단편의 CD4 융합을 암호화하는 2개의 이식유전자)를 필요로 합니다. 우리는 우리가 선택한 드라이버를 사용하여 CD4-spGFP 단백질 중 하나의 발현과 관련된 식별 가능한 효과나 치사율을 검출하지 못했습니다. 따라서 네 가지 구성 요소를 모두 안정적으로 포함하는 범용 드라이버 스톡을 구성할 수 있습니다. 이 스톡은 DP 및/또는 PerM 세포에서 유전...

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공개 사항

저자는 선언할 경쟁 이해관계가 없습니다.

감사의 글

이 작업은 DH에 대한 CIHR 보조금(PJT-162109)의 지원을 받았습니다. MJ는 Institut de Recherches Cliniques de Montréal Foundation과 몬트리올 대학의 분자 생물학 프로그램에서 박사 장학금을 받았습니다. 저자는 IRCM 현미경 및 이미징 플랫폼의 도움을 크게 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Discovery V12 해부 현미경자이스해부 현미경
Dumont #55 집게, 생물학 팁정밀 과학 도구11255-20집게를 해부하는
EP-Slik (slik20358)BDSC의Panneton et al. 2015 Slik을 표현하기 위한 플라이 균주
피지Schindelin, J. et al. (2012) 이미지 분석 소프트웨어
회크스트 33342 써모피셔 사이언티픽H3570 라이브 이미징 핵 염색 
LexAop-CD4-spGFP11  BDSC의93018플라이 스트레인
LSM 700 컨포칼 현미경 자이스공초점 현미경
nub-GAL4블루밍턴 초파리 스톡 센터(BDSC)86108플라이 스트레인
PerM-LexARambaud, Joseph 외, 2025플라이 스트레인
PYREX 9 함몰 유리 스폿 플레이트 판매코닝 생명과학7220-85유충 채취 및 세척용
슈나이더의 초파리 배지써모피셔 사이언티픽21720024라이브 이미징 매체
SecureSeal 이미징 스페이서, 8웰, 두께 0.12mm 그레이스 바이오 랩스654008스페이서
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트실가르드3097358-1004해부판 제작용
UAS-CD4-spGFP1-10  BDSC의93017플라이 스트레인
젠 블랙자이스획득 소프트웨어

참고문헌

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  23. Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs. Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).
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  27. Panneton, V., et al. Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation. J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).

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