이 프로토콜은 3D 프린팅 하이드로겔 종양 절편에서 맨틀 세포 림프종의 생성, 배양 및 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
이 논문에서
요약
초록
맨틀 세포 림프종(MCL)은 자주 재발하고 기존 화학 요법에 대한 제한된 반응만 보이는 드물고 공격적인 B 세포 신생물입니다. MCL 연구의 주요 과제는 세포가 2D 현탁액 배양에서 배양될 때 자발적인 세포사멸을 겪는 경향이 있기 때문에 생체 외에서 1차 MCL 세포를 배양하는 것입니다. 3D 모델은 고형 종양의 생체 내 상황을 더 잘 요약하는 것으로 알려져 있지만 림프종에서의 적용은 여전히 제대로 연구되지 않았습니다. 림프절 내에서 MCL의 생체 내 조건을 복제하는 3D 모델을 개발하면 생존율을 향상시키고, MCL-종양 미세환경 누화에 대한 연구를 용이하게 하며, 생체 내 약물 반응을 모방할 수 있습니다. 여기에서는 최적화된 배양 방법과 함께 하이드로겔 종양 절편 형태의 MCL의 3D 프린팅 모델이 확립되었습니다. MCL 세포주 또는 일차 MCL 세포를 사용하여 세포를 알지네이트, I형 콜라겐 및 기저막 기질을 함유한 하이드로겔에 젤라틴 지지욕에 바이오프린팅하여 담그는 표준화된 공정이 개발되었습니다. 생성된 MCL 하이드로겔 종양 절편은 배양 기간 동안 안정성을 유지하기 위해 필터 지지대에서 배양됩니다. 시스템에 약물 치료를 적용할 수 있습니다. 하이드로겔 종양 절편 내부의 단일 세포의 반응은 4색 라이브 3D 형광 이미징으로 추적할 수 있습니다. 일차 MCL 세포는 하이드로겔 종양 절편에서 배양될 때 안정적인 생존력을 입증했습니다. 이 프로토콜은 하이드로겔 종양 절편에서 MCL 세포의 생성, 배양 및 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 종양 미세 환경을 밀접하게 모방하고 공기-액체 계면 배양을 활용함으로써 제시된 모델은 전통적인 2D 배양에 비해 생리학적 관련성을 향상시킵니다. 이는 MCL의 생물학적 및 치료 연구를 발전시킬 수 있는 상당한 잠재력을 제공합니다.
서론
맨틀 세포 림프종(MCL)은 림프절1의 맨틀 영역에서 발생하는 드물고 공격적인 B 세포 비호지킨 림프종입니다. 맨틀 영역은 B 세포 난포의 배아 중심을 둘러싸고 있는 작은 림프구 고리로 구성됩니다. 일반적으로 MCL은 초기 화학 요법 후 빈번한 재발과 함께 공격적인 임상 경과를 보입니다. 질병 형성에 대한 이해향상1과 면역화학요법2, 브루톤 티로신 키나제 억제제3 또는 항체-약물 접합체4를 포함한 새로운 치료법의 개발로 인해 MCL 환자를 위한 치료 옵션은 반응률 향상과 무진행 생존 기간의 연장으로 이어졌습니다. 그러나 약물 내성과 재발로 인해 여전히 질병이 불치하게 됩니다5. 부분적으로, 이것은 이질성과 종양 발생 및 약물 내성에 대한 종양 미세 환경의 영향의 결과입니다6. MCL 연구의 과제는 세포가 생체 외에서 자발적인 세포사멸을 겪기 때문에 현탁 배양7에서 일차 MCL 세포를 배양하는 것이 어렵다는 것입니다 4,5. 이는 전임상 모델에서 MCL을 더 잘 모델링하기 위한 대체 접근 방식의 필요성을 강조합니다.
생체 내에서 종양은 종양 세포, 면역 세포, 간질 세포 등 다양한 세포 성분과 세포외 기질(ECM)과 같은 비세포 성분으로 구성된 3차원(3D) 구조입니다. 콜라겐 및 라미닌과 같은 거대분자로 구성된 ECM은 친수성이 높은 탄성 섬유의 복잡한 섬유망을 형성하여 젤과 같은 환경을 만듭니다 2,8,9,10. 생체 외 종양의 이러한 생체 내 조건을 더 잘 복제하기 위해 다양한 3D 모델이 개발되었습니다. 최근 몇 년 동안 이러한 모델은 주로 고형 종양에 초점을 맞춘 암 약리학 및 생물학을 연구하는 데 중요해졌습니다11.
현재까지 혈액암세포는 현탁액과 림프절, 골수 또는 이차 림프 조직과 같은 간질 주변 모두에서 성장할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 림프종에서 이 분야는 제대로 연구되지 않았습니다12. 생체 내에서 MCL 세포는 림프절의 맨틀 영역에서 혈액이나 골수로 전파되지만 주로 기원한 림프절 내에서 증식합니다13,14. 림프절 내에서 MCL 세포는 T 세포, 대식세포 및 중간엽 간질 세포로 둘러싸여 있으며, 이들 모두 MCL 세포의 생존 또는 약물 반응을 조절하는 것으로 나타났습니다 14,15,16,17,18. 또한, MCL-종양 미세환경 누화와 다공성 및 기계적 특성은 약물 반응 및 내성에 영향을 미칠 수 있는 중요한 요소입니다 6,14. 따라서 원발성 MCL을 연구하려면 기본 미세 환경을 시뮬레이션하는 MCL의 표준화되고 재현 가능한 3D 종양 모델이 필요합니다. 지금까지 주로 1차 MCL 세포의 스페로이드 또는 오가노이드와 같은 세포 기반 모델이 확립되었습니다 6,19. 그들은 일차 MCL 세포의 생존력과 장기 배양을 성공적으로 향상시킵니다. 그러나 세포외 기질은 이러한 모델에서 과소 대표됩니다. 이러한 맥락에서 고급 3D 바이오프린팅은 유망한 접근 방식을 제공합니다. 살아있는 세포와 하이드로겔을 직접 조립함으로써 생리학적으로 관련된 하이드로겔 기반 3D 림프절 모델을 생성할 수 있는 이 기술은 가능합니다.
여기에서는 최적화된 배양 방법과 함께 하이드로겔 종양 절편 형태의 MCL의 3D 바이오프린팅 모델이 확립되었습니다. 세포는 부유 하이드로겔(FRESH) 바이오프린팅20의 자유형 가역적 매립에 의해 콜라겐 유형 I-, 알지네이트 및 마트리겔 기반 하이드로겔 슬라이스에 포매됩니다. 하이드로겔 종양 절편은 필터 지지대에서 배양되며, 이를 통해 MCL 세포는 림프절의 생체 내 조건을 밀접하게 요약하는 환경에서 성장할 수 있습니다.
이 프로토콜은 하이드로겔 종양 절편에서 MCL 세포의 생성, 배양 및 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 4색 라이브 3D 형광 이미징을 활용하여 하이드로겔 종양 절편 내부의 단일 세포의 생존력 또는 약물 반응을 추적할 수 있습니다. 일차 MCL 세포는 하이드로겔 종양 절편에서 배양될 때 향상된 생존율을 입증했습니다. 이 모델은 MCL 생물학 및 치료 반응을 연구하기 위한 도구를 제공하여 미세환경 영향과 MCL 환자 가변성을 이해하는 길을 열어줍니다.
프로토콜
1차 MCL 세포에 대한 작업은 지역 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 이 연구에서 의과대학, Eberhard-Karls-University 및 University Hospital Tuebingen의 윤리 위원회는 환자 및 건강한 기증자 샘플의 수집 및 정밀 검사(프로젝트 번호 159/2011BO2)를 승인했으며 헬싱키 선언에 따라 환자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 여기에 사용된 1차 MCL 세포는 전체 MCL 환자 림프절에서 분리되었으므로 MCL 세포뿐만 아니라 면역 세포 및 섬유아세포와 같은 다른 세포도 포함했습니다.
1. 지지욕용 젤라틴 슬러리 준비
참고: 젤라틴 슬러리는 3D 바이오프린팅 공정 중에 지지 욕조 역할을 합니다. 바이오잉크의 가교를 유도하여 3D 구조를 형성할 수 있습니다. 젤라틴 슬러리의 준비는 세포 배양 후드 내의 멸균 조건에서 수행되어야 합니다.
- 6.75g 젤라틴 분말을 1.5mL의 1M HEPES, 15mL의 110mMCaCl2 및 133.5mL의 멸균H2O에 용해시켜 10mM HEPES 및 11mM CaCl2에 4.5%(w/v) 젤라틴 용액을 뚜껑이 있는 멸균 메이슨 용기에 준비합니다. 메이슨 용기가 고성능 믹서에서 혼합하기에 적합한지 확인하십시오.
- 용액을 37°C에서 4시간 동안 배양하거나 용액을 교반할 때 도말이 관찰되지 않을 때까지 배양하여 젤라틴이 완전히 용해되었음을 나타냅니다. 젤라틴을 4°C에서 밤새 또는 최소 12시간 동안 식힙니다.
- 10mM HEPES와 14.4mM CaCl2로 구성된 멸균 세척 완충액을 준비합니다. 세척 완충액을 4°C로 예식시킵니다.
- 멸균 숟가락을 사용하여 응고된 4.5% 젤라틴을 여러 조각으로 부수십시오.
- 4.5% 젤라틴이 들어 있는 메이슨 병에 예식된 세척 완충액을 완전히 채워 젤라틴 슬러리를 준비하는 과정 내내 완충액이 차갑게 유지되도록 합니다.
- 젤라틴 현탁액이 0°C에 도달할 때까지 -20°C에서 45-60분 동안 젤라틴 함유 메이슨 병을 얼리지만 아직 얼음 결정이 형성되기 시작하지 않았습니다. 온도계를 사용하여 온도를 모니터링하십시오.
- 믹서 뚜껑과 칼날을 메이슨 용기에 부착한 다음 메이슨 용기를 믹서에 장착합니다. 펄스 설정을 사용하여 젤라틴 현탁액을 120초 동안 혼합합니다.
알림: 다른 유형의 블렌더를 사용할 때 블렌더 설정을 조정해야 할 수 있습니다. - 혼합된 현탁액을 예식된 50mL 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 2분 동안 3,800 x g 에서 원심분리합니다. 현탁액이 바닥의 고체 젤라틴 슬러리와 상단의 액체 세척 완충액으로 분리되었는지 확인하십시오.
- 얼음 위에서 다음 단계를 수행합니다. 젤라틴 슬러리를 세척합니다. 세척 완충액 위에 보이는 기포를 제거하려고 상단 액체 층을 흡인합니다. 20mL의 신선한 4°C 세척 완충액을 튜브에 추가합니다. 튜브를 소용돌이쳐 젤라틴 슬러리를 세척 완충액과 혼합합니다.
- 원심분리 및 세척 과정을 최소 3회 반복하거나 세척 완충액 상단에 기포가 보이지 않을 때까지 반복합니다. 최종 세척 후 흡인으로 잔류 세척 완충액을 제거합니다. 젤라틴 슬러리는 4°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
2. 세포가 함유된 바이오잉크의 제조
- 인쇄 1-2일 전에 멸균 5% 알지네이트 용액을 준비합니다. 50mL 튜브에 20mL의 멸균 PBS에 알지네이트 1g을 첨가합니다. 건조한 알지네이트 분말 잔류물을 방지하려면 PBS를 조금씩 첨가하고 첨가 사이에 소용돌이를 일으킵니다. 용액을 37°C 수조에서 몇 시간 동안 배양하거나 실온의 튜브 롤러에서 밤새 배양합니다. 알지네이트가 완전히 용해되면 필요할 때까지 용액을 4°C에서 보관합니다.
- MCL 세포주로 작업하는 경우 T75 플라스크에서 현탁액으로 세포를 배양합니다. 인쇄 당일, 1.4 x 107 세포가 1mL의 바이오잉크를 준비하는 데 사용할 수 있는지 확인하여 9-10개의 하이드로겔 종양 조각을 생성합니다.
- 일차 MCL 세포로 작업하는 경우 바이오프린팅 전에 현탁 배양에서 세포를 배양할 필요가 없습니다. 바이오프린팅 직전에 냉동 보존된 1차 MCL 세포를 해동합니다. 1차 MCL 세포를 배양 배지가 있는 50mL 튜브로 옮깁니다. 남은 동결 배지를 제거하려면 즉시 튜브를 340 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 제거합니다. 세포 계수를 위해 세포 펠릿을 20mL의 신선한 배지에 재현탁합니다.
- 인쇄 당일, 관심 세포에 적합한 바이오잉크를 준비합니다. Jeko-1 세포의 경우 0.5%(w/v) 알지네이트, 20%(v/v) I형 콜라겐, 1x RPMI 및 2mM HEPES로 구성된 바이오잉크를 준비합니다. 바이오잉크 1mL에 5% 알지네이트 100μL, I형 콜라겐 200μL, 10x RPMI 100μL, 10mM HEPES 200μL, PBS 350μL를 혼합합니다. 셀은 2.6단계에서 추가됩니다.
- 일차 MCL 세포의 경우, 0.5%(w/v) 알지네이트, 20%(v/v) I형 콜라겐, 1x RPMI 및 0.5mM HEPES로 구성된 바이오잉크를 준비합니다. 바이오잉크 1mL에 대해 5% 알지네이트 100μL, I형 콜라겐 200μL, 10x RPMI 100μL, 10mM HEPES 50μL, 기저막 매트릭스 500μL를 혼합합니다. 셀은 2.6단계에서 추가됩니다. MCL 세포주로 작업하는 경우 배양 플라스크에서 50mL 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다.
- 세포를 0.4% 트리판 블루와 1:1 비율로 혼합합니다. 세포 계수기 또는 Neubauer 챔버를 사용하여 생존 세포(염색되지 않음)를 계산합니다. 1.4x107 세포에 해당하는 바이오잉크 1mL에 대한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다. 계산된 부피를 새 50mL 튜브로 옮깁니다. 340 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 준비된 바이오잉크에 세포 펠릿을 재현탁하여 최종 세포가 함유된 바이오잉크를 생성합니다.
참고: 세포 펠릿의 부피는 50μL 배지인 것으로 추정되었습니다. 2.4단계에서 준비된 바이오잉크와 함께 1mL의 바이오잉크를 산출합니다.
3. 목욕 내 바이오 프린팅
참고: 가능하면 세포 배양 후드 아래와 같은 멸균 환경에서 3D 프린팅 공정을 수행하십시오. 사용된 3D 프린터는 Hinton et al.20에 설명된 대로 주사기 펌프 익스텐더를 추가하여 FRESH 프린팅을 위해 수정되었습니다.
- 바이오프린터를 켜고 3D 프린터 소프트웨어에 연결합니다. 하이드로겔 종양 슬라이스에 대한 청사진이 포함된 .stl 파일을 엽니다. 최대 5개의 슬라이스를 동시에 인쇄할 수 있습니다. 각 하이드로겔 종양 절편의 직경이 8mm이고 높이가 1.5mm인지 확인하십시오. 채우기 밀도를 85%로 설정합니다. 프린터 헤드를 홈으로 고정합니다.
참고: STL 파일은 Fusion 360으로 설계되었으며 보충 코딩 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 3D 프린팅의 경우 소프트웨어 Cura 버전 15.04.5가 사용되었습니다. - 미리 준비한 젤라틴 슬러리를 직경 35mm의 페트리 접시에 반쯤 채워질 때까지 옮깁니다. 젤라틴 슬러리에 에어 갭이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 일회용 정밀 물티슈를 사용하여 슬러리에서 여분의 물을 빼내어 젤라틴 지지 욕조를 생성하는데, 이는 반죽 모양이며 충분한 힘이 가해질 때까지 모양을 유지합니다.
- 세포가 함유된 바이오잉크를 2.5mL 유리 주사기에 옮기고 0.8mm 무딘 노즐에 연결합니다. 주사기를 뒤집고 과도한 공기와 기포를 조심스럽게 배출하십시오. 주사기가 준비되면 바이오프린터에 삽입합니다. 3D 프린터 소프트웨어를 사용하여 노즐에서 배출되기 시작할 때까지 바이오잉크를 압출합니다. 노즐이 막히는 것을 방지하기 위해 일회용 과학 정밀 물티슈를 사용하여 배출된 바이오잉크 방울을 닦아냅니다.
- 젤라틴 지지욕을 주사기 노즐 바로 아래에 놓습니다. 노즐이 젤라틴 슬러리 내부, 지지 욕조 바닥에서 2mm 위에 위치할 때까지 프린터 헤드를 내립니다.
- 3D 프린터 소프트웨어를 통해 인쇄 프로세스를 시작합니다.
- 인쇄 과정이 완료되면 막힘을 방지하기 위해 노즐에서 과도한 젤라틴 슬러리를 제거합니다. 하이드로겔 종양 조각이 들어 있는 지지욕을 꺼내 뚜껑을 덮어 무균 상태를 유지합니다.
- 인쇄된 하이드로겔 종양 조각이 들어 있는 지지 수조를 37°C에서 배양하여 젤라틴이 녹도록 합니다. 이 단계는 인쇄된 하이드로겔 종양 조각을 지지 욕조에서 방출합니다.
- 세척 완충액과 세포 배양 배지를 37°C로 예열합니다. 젤라틴이 녹는 동안 하이드로겔 종양 조각을 세척하기 위한 6웰 플레이트를 준비합니다. 2개의 웰에 10 mM HEPES, 14.4 mM CaCl2 세척 완충액(젤라틴 슬러리 세척에 사용되는 것과 동일한 완충액)을 채우고 2개의 웰을 세포 배양 배지로 채웁니다.
- 젤라틴이 녹으면 멸균 주걱을 사용하여 하이드로겔 종양 조각을 세척 완충액으로 옮깁니다. 슬라이스를 각각 1분 동안 세척하고, 먼저 두 개의 세척 완충액 함유 웰에서, 그 다음에는 두 개의 배지 함유 웰에서 세척합니다. 세포가 함유된 하이드로겔 종양 절편은 이제 배양할 준비가 되었습니다.
- 남은 바이오잉크를 보관하여 인쇄 과정을 반복합니다.
4. 하이드로겔 종양 절편 배양 및 치료
- 하이드로겔 슬라이스를 배양하려면 6웰 플레이트 내부에 배치된 필터 지지대(0.4μm 기공 크기)에 옮깁니다. 단일 필터 지지대에서 최대 5개의 하이드로겔 슬라이스를 배양할 수 있습니다. 필터 지지대 아래에 1.5mL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 하이드로겔 종양 조각 위에 배지 한 방울을 추가하여 건조를 방지합니다.
- 하이드로겔 종양 절편의 약물 치료를 위해 세포 배양 배지에 원하는 양의 약물을 첨가하십시오. 여기서, 하이드로겔 종양 절편을 0.33 μM-27 μM 독소루비신으로 48시간 또는 72시간 동안 처리하였다. 항상 대조군으로 처리하지 않고 슬라이스 세트를 배양하십시오.
- 하이드로겔 종양 슬라이스가 있는 6웰 플레이트를 원하는 배양 기간 동안 37°C 및 5% CO2의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
5. 트리판 블루 배제 분석에 의한 세포의 생존율 분석
- 배양 또는 치료 후 세포 생존력을 평가하려면 하이드로겔 종양 절편을 용해시킵니다. 하이드로겔 종양 슬라이스를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 30 mM EDTA, 55 mM 구연산나트륨 및 150 mM 염화나트륨(pH 6.8)을 포함하는 용해 완충액 슬라이스당 500 μL를 첨가합니다. 하이드로겔이 완전히 녹을 때까지 위아래로 피펫팅합니다.
- 용액을 340 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 용해된 하이드로겔 슬라이스당 500μL의 배지에 세포를 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루와 1:1 비율로 혼합합니다. 세포 계수기 또는 Neubauer 챔버를 사용하여 생존 가능(염색되지 않은) 및 죽은 세포(염색)를 계산합니다. 추가 분석을 위해 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 기록합니다.
6. 4색 라이브 3D 형광 이미징
참고: 여기에 사용된 4색 염색은 살아있는 세포(TMRM 양성), 세포사멸 세포(형광 발생 카스파제-3 기질 양성) 및 죽은 세포(PicoGreen 양성)21,22,23 사이의 분화를 허용합니다. 핵은 DRAQ5로 검출됩니다. 그러나, 이 프로토콜은 선택한 바이오마커, 세포 구조 또는 세포 유형을 검출하기 위해 임의의 다른 광안정성, 특정 형광 염료로 조정될 수 있다. 염색하기 전에 현미경이 염색에 사용되는 형광단의 파장을 감지할 수 있는지 확인하십시오.
- 하이드로겔 종양 절편의 4색 염색을 위해, TMRM, DRAQ5 및 형광성 카스파제-3 기질을 각각 0.5μM, 5μM 및 2μM의 최종 농도로 세포 배양 배지 1mL에 첨가하여 염색 용액을 준비한다.
- 멸균 주걱을 사용하여 하이드로겔 종양 절편을 챔버가 있는 유리 커버슬립으로 옮깁니다. 완전히 덮일 때까지 하이드로겔 슬라이스 위에 준비된 염색 용액을 추가합니다. 어두운 곳에서 37°C에서 샘플을 20분 동안 배양합니다.
- 초기 배양 후, 하이드로겔 종양 절편을 덮고 있는 염색 용액을 수집하고 0.7 μL/mL PicoGreen을 첨가합니다. 염색 용액을 하이드로겔 슬라이스로 다시 피펫팅하고 어두운 곳에서 37°C에서 추가로 10분 동안 배양합니다.
- 배양 후, 하이드로겔 슬라이스를 촉촉하게 유지하기 위해 충분한 염색 용액을 남겨두고 여분의 배지를 조심스럽게 제거합니다.
- 공초점 현미경을 사용하여 슬라이스를 즉시 분석합니다. 광독성 및 광표백을 방지하려면 레이저 강도와 여기 시간을 줄여 적용되는 광자량을 최소화하십시오. 위에서 설명한 염색의 여기/방출 스펙트럼은 표 1에서 찾을 수 있습니다.
- 하이드로겔에서 세포의 세포 분포에 대한 개요를 얻으려면 z-섹션을 캡처합니다. 이미징 중에 z-절편을 촬영한 경우 적절한 소프트웨어를 사용하여 하이드로겔 종양 절편의 3D 재구성을 생성합니다. 이러한 재구성을 통해 하이드로겔 종양 절편에서 세포의 공간적 분포와 세포 상태를 철저히 분석할 수 있습니다.
- 보충 파일 1 및 보충 파일 2에 제공된 지침과 스크립트에 따라 세포 분할 및 재구성을 수행합니다.
결과
MCL 세포를 포함하는 하이드로겔 종양 절편은 상술한 프로토콜로 생성되었다. 하이드로겔 종양 절편을 3D 프린팅 및 배양하기 위한 워크플로우의 단계는 그림 1A에 나와 있습니다. 사용된 3D 프린터는 Hinton et al.20(그림 1B)에 설명된 바와 같이 주사기 펌프 익스텐더를 추가하여 FRESH 프린팅을 위해 수정되었습니다. 한 번에 최대 5개의 슬라이스를 인쇄하고(그림 1C) 하나의 필터 지지대에서 배양했습니다(그림 1D). 하이드로겔 종양 조각에 영양 공급을 제공하기 위해 필터 지지대 아래에 배지를 추가했습니다. 건조를 방지하기 위해 각 하이드로겔 종양 조각 위에 배지 한 방울을 추가했습니다. 하나의 필터 지지대에서 배양된 5개의 하이드로겔 종양 조각에 대한 개요가 하이드로겔 조각의 클로즈업 이미지와 함께 그림 1E에 나와 있습니다. 3일의 배양 기간 동안 하이드로겔 종양 절편은 안정적이었고 구조를 유지했습니다(그림 2A). 인쇄 직후 하이드로겔 종양 절편에 기포가 존재했지만 배양 중에 사라졌습니다(그림 2A).
현탁 배양(2D)에서 배양된 Jeko-1 세포와 비교하여 하이드로겔 종양 절편(3D)에서 배양된 MCL 세포주 Jeko-1의 생존율을 트리판 블루 배제 분석법으로 평가했습니다(그림 2B). 배양 3일 후, 세포의 80%가 생존 가능했던 반면, 프린팅 전 Jeko-1 세포의 초기 생존율은 88%였습니다. 2D로 배양된 Jeko-1 세포는 88%의 초기 생존율을 유지했습니다. 2D와 3D로 배양된 Jeko-1 세포 사이에는 유의미한 차이가 없었습니다. Jeko-1 세포가 하이드로겔 슬라이스에서 증식하는지 여부를 평가하기 위해 하이드로겔 슬라이스당 Jeko-1 세포의 평균 세포 수를 결정했습니다(그림 2C). 5x105 Jeko-1 세포가 인쇄 직후(d0) 각 슬라이스에 포함되었지만, 이 숫자는 배양 3일 후에 9.3x105 세포로 거의 두 배로 증가했습니다.
하이드로겔 슬라이스에서 배양된 Jeko-1 세포의 분포 및 상태는 인쇄 직후 또는 배양 3일 후에 4색 라이브 형광 이미징(그림 2D)에 의해 평가되었습니다. 프린팅 후 Jeko-1 하이드로겔 슬라이스의 3D 재구성은 세포의 균일한 분포를 보여주었습니다. 대부분의 세포는 미토콘드리아 막 전위에 대한 마커인 TMRM에 대해 양성이었습니다22. 소수의 세포는 세포사멸 유도 마커인 Caspase-3 활성23 및 사세포 마커 PicoGreen21에 대해 양성이었습니다. 배양 3일 후, 세포 클러스터 형성과 함께 세포 수의 증가가 관찰되었습니다. 대부분의 세포는 TMRM 양성을 유지한 반면, 소수의 세포만이 Caspase-3 활성 또는 PicoGreen에 대해 양성으로 염색되었습니다(그림 2C).
하이드로겔 슬라이스의 MCL 세포가 화학요법에 반응하는지 여부를 분석하기 위해 현탁 배양(2D) 또는 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 배양된 Jeko-1 세포를 MCL 환자에 대한 표준 치료의 일부인 화학요법 약물 독소루비신으로 처리했습니다24. 하이드로겔 슬라이스의 전체 구조는 독소루비신 처리 동안 유지되었습니다(그림 3A). 하이드로겔 슬라이스에서 배양된 Jeko-1 세포의 생존력은 독소루비신 처리에 대한 반응으로 용량 의존적으로 감소했습니다. Jeko-1 세포에서 독소루비신의 IC50은 2D 현탁 배양(IC50=2.0μM; 그림 3B). 4색 라이브 형광 이미징은 독소루비신 처리에 대한 반응으로 하이드로겔 슬라이스에서 배양된 Jeko-1 세포에서 TMRM 감소 및 PicoGreen 신호 증가를 보여주어 치료 유발 생존율 감소를 확인했습니다. 4색 라이브 형광 이미징에서 얻은 이미지를 3D 재구성하고, DRAQ5 핵 신호를 기반으로 분할하고, 보충 파일 1에 설명된 Python 스크립트를 사용하여 분석했습니다. 예시적인 분할 마스크는 보충 그림 1에 나와 있습니다. DRAQ5 신호에서 식별된 세포 번호를 사용하여 총 세포 수를 결정했습니다. TMRM, PicoGreen 및 Caspase-3 활성에 대해 양성인 세포 수를 사용하여 각각 생존 세포, 사체 세포 또는 세포사멸 세포의 백분율을 식별했습니다. 9μM 독소루비신을 유무에 관계없이 하이드로겔 슬라이스에서 3일 동안 배양한 Jeko-1 세포의 4색 라이브 형광 염색의 정량화는 트리판 블루 배제 분석과 유사한 생존력을 보여주었습니다(표 2).
확립된 MCL 세포주 외에도, 3개의 서로 다른 MCL 환자의 1차 MCL 세포를 2D 현탁액 배양 또는 3D 하이드로겔 슬라이스에서 배양했습니다(그림 4, 보충 그림 2). 병리학자가 확인한 바와 같이, 세 가지 MCL(환자 1-3)은 모두 Ki67 지수가 20%-50%인 고전적/일반적인 형태였습니다. 일차 MCL 세포에는 MCL 환자 림프절에서 분리된 모든 세포 유형이 포함되어 있으므로 MCL 세포뿐만 아니라 다른 유형의 면역 세포 또는 간질 세포도 포함했습니다. 1차 MCL 하이드로겔 슬라이스의 생존력은 트리판 블루 배제 분석법에 의해 평가되었습니다. 배양 4일 후, 하이드로겔 슬라이스의 1차 MCL 세포는 인쇄 전 기준선 생존율 71.0%에 비해 43.6%(3일째 45.7%)의 생존율을 유지했습니다(그림 4A). 이는 배양 4일 후 생존율이 19.6%(3일째 28.4%)인 현탁액(2D)에서 배양된 세포에 비해 생존율이 증가했음을 나타냅니다. 이 생존력은 4색 라이브 형광 이미징에 의해 시각화되었으며, 대부분의 세포는 TMRM 양성 및 생존 가능한 반면, 하위 집단은 Caspase-3 활성 및 PicoGreen에 대해 양성이어서 각각 세포사멸 및 세포 사멸을 나타냅니다(그림 4B). 그림 4B의 정량 데이터는 표 2에 나와 있습니다. 두 명의 추가 MCL 환자의 1차 세포는 각각의 2D 현탁액 배양에 비해 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 배양했을 때 세포의 생존율이 증가한 것으로 나타났습니다(보충 그림 1).
그림 1: 하이드로겔 종양 절편 의 3D 프린팅 워크플로.(A) 하이드로겔 종양 절편에서 세포의 3D 프린팅 및 배양 워크플로. (B) 젤라틴 지지조에서 하이드로겔 슬라이스의 3D 바이오프린팅에 사용되는 프린터 설정. (C) 3D 프린터 소프트웨어에서 청사진을 인쇄합니다. 한 번에 최대 5개의 하이드로겔 슬라이스가 인쇄되었습니다. (D) 하이드로겔 슬라이스 배양의 개략도. 하이드로겔 슬라이스를 6웰 플레이트의 필터 지지대에서 배양했습니다. 수분을 유지하기 위해 각 하이드로겔 슬라이스 위에 배지 한 방울을 첨가했습니다. 하나의 필터 지지대에서 최대 5개의 하이드로겔 슬라이스를 배양할 수 있습니다. (E) 개요 이미지 또는 클로즈업 이미지로 표시된 바와 같이 필터 지지대에서 배양된 3D 프린팅 하이드로겔 슬라이스. 스케일 바는 표시된 대로 5mm, 1mm 또는 200μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3D 프린팅 하이드로겔 슬라이 스에서 맨틀 세포 림프종(MCL) 세포주를 배양 합니다.(A) 인쇄 후(d0) 또는 배양 3일 후(d3) MCL 세포주 Jeko-1을 포함하는 대표적인 하이드로겔 절편의 클로즈업. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. (B) 트리판 블루 배제 분석법으로 평가한 바와 같이 현탁액(2D) 또는 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 2일 동안 배양된 Jeko-1 세포의 생존력. 세 가지 독립적인 바이오프린팅 실험의 평균 ± SD가 표시됩니다. (C) 인쇄 직후(d0) 또는 최대 3일 배양 후(d1-d3) 각 하이드로겔 슬라이스에 포함된 Jeko-1 세포 수. 세 가지 독립적인 바이오프린팅 실험의 평균 ± SD가 표시됩니다. 통계적으로 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다(n.s., p > 0.05, Mann-Whitney 테스트). (D) 인쇄 당일(d0) 또는 배양 3일 후(d3)에 Jeko-1 하이드로겔 슬라이스의 3차원 재구성. 이 모델은 4색 라이브 3D 형광 이미징의 z-스택에서 생성되었습니다. 살아있는 세포는 빨간색(TMRM), 세포사멸 세포는 노란색(Caspase-3 효소 활성), 죽은 세포는 녹색(PicoGreen), 핵은 파란색(DRAQ5)으로 표시됩니다. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 하이드로겔 슬라이스에서 맨틀 세포 림프종(MCL) 세포주의 약물 치료.(A) 3일 동안 3μM 독소루비신으로 처리된 MCL 세포주 Jeko-1을 포함하는 대표적인 하이드로겔 절편의 클로즈업(d3). 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. (B) 현탁액(2D) 또는 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 배양된 Jeko-1 세포를 2일 동안 증가된 농도의 화학요법제 독소루비신으로 처리했습니다. 세포의 생존력은 트리판 블루 배제 분석법으로 평가되었습니다. 4개의 독립적인 바이오프린팅 실험의 평균 ± SD가 표시됩니다. (C) 3일 동안 9μM 독소루비신(Doxo)으로 처리한 Jeko-1 하이드로겔 슬라이스의 3차원 재구성(d3). 이 모델은 4색 라이브 3D 형광 이미징의 z-스택에서 생성되었습니다. 살아있는 세포는 빨간색(TMRM), 세포사멸 세포는 노란색(Caspase-3 효소 활성), 죽은 세포는 녹색(PicoGreen), 핵은 파란색(DRAQ5)으로 표시됩니다. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 3D 프린팅된 하이드로겔 슬라이스에서 1차 MCL 세포의 배양. (A) 트리판 블루 배제 분석법으로 평가한 바와 같이 현탁액(2D) 또는 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 최대 4일 동안 배양된 일차 MCL 세포의 생존력. 한 실험의 평균 생존 가능성이 표시됩니다. (B) 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 3일 동안 배양된 일차 MCL 세포의 3차원 재구성. Z-스택은 4색 라이브 염색으로 염색된 하이드로겔 슬라이스에서 생성되고 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 분석되었습니다. 살아있는 세포는 빨간색(TMRM), 세포사멸 세포는 노란색(Caspase-3 효소 활성), 죽은 세포는 녹색(PicoGreen), 핵은 파란색(DRAQ5)으로 표시됩니다. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 얼룩 | TMRM | 드라큐5 | NucView405 카스파제-3 기질 | 피코그린 |
| 여기/방출 | 548 nm/574 nm | 647 nm/681 nm | 429 nm/ 469 nm | 488 nm/ 520 nm |
표 1: 4색 라이브 3D 형광 이미징에 사용되는 염색의 여기/방출 최대값.
| 견본 | 세포의 % | ||
| TMRM(생존 세포) | PicoGreen(죽은 세포) | Caspase-3(세포사멸 세포) | |
| 제코-1 Ctrl | 83 | 23.6 | 18.3 |
| Jeko-1 독소 9μM | 27.6 | 81.3 | 86.6 |
| 일차 MCL 환자 1 | 75.2 | 31.1 | 33.1 |
표 2: 배양된 하이드로겔 종양 절편의 4색 생염색 의 3D 재구성의 정량화. 하이드로겔 종양 절편을 3일 동안 배양하고 9μM 독소루비신 또는 일차 MCL 세포(환자 1)로 처리하거나 처리하지 않고 배양된 Jeko-1 세포를 포함했습니다.
보충 그림 1: 4색 살아있는 염색의 3D 재구성에서 세포 식별. (A) 4색 라이브 염색 및 (B) Python 이미징 분석 파이프라인을 사용하여 생성된 이 채널의 분할된 이미지에서 얻은 DRAQ5로 표지된 공초점 이미지의 3D 재구성. 스케일 바는 200μm를 나타냅니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 Figure 2: 하이드로겔 종양 절편에서 환자 2 및 3의 일차 MCL 세포 배양 . 트리판 블루 배제 분석으로 평가한 바와 같이 최대 4일 동안 현탁액(2D) 또는 하이드로겔 슬라이스(3D)에서 배양된 (A) 환자 2 또는 (B) 환자 3의 일차 MCL 세포의 생존력. 한 실험의 평균 생존 가능성이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 4색 라이브 염색에서 얻은 3D 재구성 분석 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 4색 라이브 염색에서 얻은 3D 재구성 분석을 위한 Python 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 F ile 1: Stl. 하이드로겔 종양 절편에 대한 청사진을 포함하는 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
이 프로토콜에 설명된 하이드로겔 종양 절편은 림프절 구조를 모방하는 MCL 모델을 제공하여 바이오프린팅에 의해 생성된 3D 종양 미세 환경에서 MCL 세포 생존 및 약물 반응을 연구할 수 있습니다.
가장 널리 사용되는 바이오 프린팅 방법은 디스펜싱 시스템을 통해 바이오잉크가 배출되는 압출을 기반으로 합니다. 예를 들어, 잉크젯 인쇄에서 바이오잉크는 증착 후 빠르게 가교되어 3D 구조를 형성합니다25. 그러나 이 접근 방식에는 특히 사용된 재료의 점도와 층을 쌓을 수 있는 능력 측면에서 한계가 있습니다. 대조적으로, 이 프로토콜에 사용되는 FRESH 바이오프린팅과 같은 임베디드 주사기 기반 압출 3D 바이오프린팅은 겔 인 겔 접근 방식을 적용합니다. 이를 통해 콜라겐과 같은 저점도 바이오잉크를 안정적인 구조로 인쇄할 수 있어 복잡한 종양 미세 환경을 모방할 수 있습니다20,26. 바이오프린팅을 위해 특별히 개발된 3D 프린터는 비용이 많이 들 수 있지만 여기에 제시된 방법은 보다 접근하기 쉬운 진입점을 제공합니다. 비교적 간단한 수정으로 표준 압출 프린터에 적용할 수 있습니다. 이러한 수정은 저렴한 필라멘트로 3D 프린팅할 수 있으며 디자인은 예를 들어 Hinton et al.20과 같은 오픈 소스 리소스로 제공됩니다. 그러나 FRESH 바이오 프린팅용 하이드로겔 지지대 준비는 온도에 매우 민감하며 슬러리 준비 중에 세심한 주의가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
자주, 3D 프린팅된 종양 모델은 생체 내 산소 구배가 없는 부유 시스템(25) 또는 미세유체 칩 배양(27)에서 배양되는데, 이는 높은 수준의 복잡성을 포착하지만 처리량이 낮고 높은 유지 보수가 필요합니다. 이러한 장애물은 여기에 설명된 하이드로겔 종양 절편으로 극복할 수 있습니다. 공기-액체 계면에서 최대 5개의 하이드로겔 종양 절편을 배양하는 설정은 고형 종양의 정밀 절단 종양 절편의 배양에서 파생됩니다28. 이 프로토콜에 사용되는 필터 지지체의 멤브레인은 0.4μm의 기공 크기를 갖는 폴리테트라플루오로에틸렌(PFTE) 멤브레인으로 구성되어 영양분 교환을 허용하지만 세포 부착 또는 세포 이동을 방지합니다29. PTFE 멤브레인의 배양은 슬라이스의 안정성을 유지하고 파열되거나 분해되는 것을 방지하기 위해 슬라이스를 물리적으로 지지합니다. 또한, 그들은 공기-액체 인터페이스를 제공하여 주로 위의 공기로부터 산소를 제공하고 필터(30) 아래의 매체로부터 영양분을 제공합니다. 따라서 시스템은 생체 내에서 발생할 수 있는 영양 공급, 세포 증식 및 산소화의 시공간적 변화를 통합합니다 25. 필터 지지체의 하이드로겔 종양 절편에서 배양한 1차 MCL 세포는 4일 동안 40% 이상의 생존율을 유지했으며, 이는 2D 현탁액 배양에서 관찰된 생존율보다 우수했습니다(그림 3A, 보충 그림 2). 추가 조사는 원발성 B 세포 림프종 종양의 스페로이드 및 오가노이드 6,19,30 또는 CD40L 발현 섬유아세포와 일차 MCL 세포의 공동 배양에서 설명된 바와 같이 사이토카인의 추가 또는 CD40L 발현 섬유아세포와의 공동 배양에 의해 연장된 생존율을 달성할 수 있는지 여부를 다루어야 합니다 14. 이러한 접근법을 하이드로겔 종양 절편에 통합하는 것은 천연 미세 환경과의 유사성뿐만 아니라 일차 MCL 세포의 배양을 향상시키는 것을 고려해야 합니다.
림프절에는 잘 발달된 세포외 기질 섬유 네트워크가 포함되어 있습니다. 패턴으로 인해 망상 섬유로 알려져 있습니다. 주로, 이들 섬유는 콜라겐 및 기저막 특이적 성분 31,32,33으로 구성된다. 림프절에서 생체 내 상황과 유사한 매트릭스를 생성하기 위해, 하이드로겔 종양 절편을 생성하는 데 사용되는 바이오잉크는 콜라겐 유형 I과 4개의 주요 기저막 ECM 단백질인 라미닌, 콜라겐 IV, 엔탁틴 및 페를레칸34로 구성된 매트리겔로 구성됩니다. 또한, 알지네이트를 바이오잉크에 첨가하여 하이드로겔 종양 절편을 안정화시켜 주걱을 사용하여 장기간 배양하고 한 혈관에서 다른 혈관으로 운반할 수 있습니다. 콜라겐과 알지네이트를 함유한 다양한 하이드로겔을 테스트한 결과, 알지네이트 0.5%와 콜라겐 20%가 함유된 바이오잉크를 사용할 때 안정적이고 내구성이 뛰어난 하이드로겔 슬라이스와 함께 가장 높은 세포 생존율을 보여주었습니다(데이터는 표시되지 않음). 구성 요소 외에도 0.8cm의 하이드로겔 종양 절편 직경은 평균 림프절 직경 1cm35와 더욱 유사합니다. 하이드로겔 종양 절편의 라이브 3D 이미징은 세포의 균일한 분포를 추가로 보여주었습니다(그림 2C).
여기서, 하이드로겔 절편을 약물로 치료하는 능력은 고령 MCL 환자 하위 그룹을 위한 표준 치료 요법인 R-CHOP 요법(리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손)의 일부인 독소루비신으로 치료함으로써 나타났습니다24. 2D 배양과 비교하여 치료 효과에 대한 종양 미세 환경의 영향은 하이드로겔 종양 절편에서 연구될 수 있습니다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 하이드로겔 슬라이스에서 배양된 Jeko-1 세포는 2D 배양 세포보다 독소루비신 처리에 더 내성이 있었습니다. 이는 세포외 기질이 종양 강성(36), 세포-세포 통신(37) 및 약물 전달(38)을 조절함으로써 약물 반응에 영향을 미치고 약물 내성을 자주 향상시킬 수 있다는 관찰과 일치합니다. 또한 유세포 분석 및 면역조직화학적 또는 다중 면역형광 염색은 하이드로겔 종양 절편에서 단일 세포의 치료 반응에 대한 더 깊은 통찰력을 제공할 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 천연 3차원 림프절 구조를 모방하는 3D 림프절 모델을 나타내는 하이드로겔 종양 절편의 생성 및 배양을 설명합니다. MCL 세포에서 다른 원발성 림프종 적응증으로 적용을 확장할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
공개 사항
이 연구는 Robert-Bosch Stiftung과 Baden-Württemberg 과학, 연구 및 예술부(3R-Network BW)의 지원을 받았습니다.
감사의 글
훌륭한 기술 지원을 해준 Kerstin Willecke와 3D 이미지 분석에 대한 귀중한 도움을 준 Yang Zhang에게 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| µ-slide 8웰 유리 바닥 | 이비디 GmbH | 80827 | 하이드로겔 슬라이스의 라이브 이미징에 사용되는 유리 바닥 슬라이드 |
| PBS 10배 | 칼 로스 GmbH + Co.KG | 9150.1 | 바이오잉크 성분 |
| 10X RPMI-1640 미디엄 | 시그마-알드리치 | R1145 | 바이오잉크 성분 |
| 2.5 ml 기밀 주사기 모델 1002 TLL | 해밀턴 | 81420 | 바이오 프린팅용 주사기 |
| 3D 압출 프린터, PrintrBot Simple | 프린터봇 | 바이오잉크 인쇄가 가능하도록 자체 수정 | |
| 6-웰 플레이트 | Th. Geyer GmbH & Co.KG | 7696790 | 하이드로겔 슬라이스의 배양 |
| 병뚜껑 진공 여과 시스템, PES 멤브레인, 500 ml, 0.22 및 마이크로; m 기공 크기, 70 mm 직경 멤브레인 | 코닝 주식회사 | 513-3355 | 완충액의 멸균 여과 |
| 염화칼슘 탈수 | 칼 로스 GmbH + Co.KG | 티885.2 | 세척 완충액 및 젤라틴 슬러리의 성분 |
| 쥐의 콜라겐 I | 코닝 주식회사 | CLS354249 | 바이오잉크 성분 |
| 3D 프린팅용 Cura 버전 15.04.5 소프트웨어 | 얼티메이커 | 3D 프린팅에 사용되는 소프트웨어 | |
| 드라큐5 | 바이오스테이트 주식회사 | DR50050 | 하이드로겔 슬라이스의 라이브 이미징을 위한 염색 |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 이나트륨염 이수화물 | 시그마-알드리치 | E5134 | 알지네이트 용해 완충액의 성분 |
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| HEPES, 유리산, 분자 생물학 등급 | 머크 KGaA | CAS 7365-45-9 | 세척 완충액 및 젤라틴 슬러리의 성분 |
| Jeko-1 MCL 세포주 | ATCC | CRL-3006 | MCL 세포주 |
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| 구연산나트륨 | 칼 로스 GmbH + Co.KG | 3580.1 | 알지네이트 용해 완충액의 성분 |
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| 트리판 블루, 0.4% | 시그마-알드리치 | T8154 | 생존율 분석을 위한 염색 |
| 방수 온도계 | VWR | 620-2099 | 젤라틴 슬러리의 온도를 모니터링하는 온도계 |
참고문헌
- Jain, P., Wang, M. L. Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments. Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances. Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).
- Lee, H. J., et al. Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll). J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).
- Roué, G., Sola, B. Management of drug resistance in mantle cell lymphoma. Cancers. 12 (6), 1565(2020).
- Araujo-Ayala, F., et al. A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).
- Bryant, J., et al. Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models. Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).
- Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3d cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research. J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).
- Saba, N. S., et al. Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma. Blood. 128 (1), 82-92 (2016).
- Chiron, D., et al. Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma. Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).
- Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma. Front Immunol. 15, 1373269(2024).
- Nygren, L., et al. T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).
- Medina, D. J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways. Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).
- Jindal, U., et al. Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma. Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).
- Nie, L., et al. Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay. Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
- Van Der Kuip, H., et al. Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).
- Huseynov, V. Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients. Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).
- Augustine, R., et al. 3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy. Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).
- Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).
- Seaman, K., Sun, Y., You, L. Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment. Med-X. 1 (1), 11(2023).
- Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices. Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).
- Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).
- Lamaison, C., et al. A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival. Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).
- Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).
- German, S. V., et al. Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells. Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals. Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).
- Huang, J., et al. Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
- Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery. J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).
- Ahmad, V. Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management. Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).
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