Method Article

병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스와의 상호작용에 대한 실시간 영상 및 특성 분석

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 논문은 회전 원반 공초점 현미경을 사용하여 망막에서 미세아교세포 운동성과 시냅스 후 눈점과의 접촉을 시각화하고 정량화하는 방법을 시연합니다.

Abstract

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미세아교세포는 조직 감염과 손상에 반응하는 중추신경계(CNS)의 상주 대식세포입니다. 미세아교세포는 염증 기능 외에도, 시냅스 가지치기를 통해 회로 정교화에 발달 역할을 합니다. 그러나 신경염증과 신경퇴행에서 시냅스 가지치기의 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 망막 이식 모델을 사용하여 미세교세포 역학을 체 외에서 연구합니다. 미세아교세포 운동성과 시냅스 후 단백질과의 상호작용을 조사하기 위해, 시냅스에 AAV-PSD95-RFP를 표지하고, 회전 원반 공초점 현미경을 이용해 시냅스 후 단백질과 함께 위치하는 운동성 미세아교세포의 타임랩스 영상을 기록합니다. 그 후 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 미세아교세포와 PSD95의 표면 및 스팟 재구성을 만듭니다. 미세아교세포 변위 길이, 돌기 속도, 시냅스 후 지점과의 접촉 등의 데이터를 이 표면에서 추출하여 항상성 상태와 신경 손상 후 미세교세포의 행동을 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포가 시냅스 가지치기에서 어떤 역할을 하는지 조사하는 데 유용할 수 있습니다.

Introduction

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회로 기능과 항상성은 고도로 조절된 시냅스 발화와 다양한 세포 유형 간의 독특한 상호작용에 의존합니다. 중추신경계(CNS)의 상주 대식세포 역할을 하는 미세아교세포는 망막에 존재하지 않는 비신경세포 집단으로, 시냅스 가지치기에서 독특한 역할을 합니다. 중추신경계 발달 과정에서 미세교세포는 기능하지 않거나 약한 시냅스를 가지치기하여 신경 회로를 정교하게 만듭니다2. 발달 중인 뇌의 미세아교세포는 주변 환경을 조사하며, 중요한 시기에 신경보호 역할을 하도록 준비되어있습니다. 시각 시스템 발달에서 미세아교세포는 피질 뉴런과 인터뉴런의 발달에 중요한 조절자이며, 시냅스 재형성의 중요한 시기에 형태학적 변화를 보인다. 마찬가지로, 발달 중인 망막에서는 미세아세포세포가 세포자멸사 세포를 제거하여 새로운 시냅스 연결을 위해 자리를 내주며, 이는 이러한 정화 과정에서 항상성 표지 P2Ry12의 상향 조절로 확인되었습니다5. 그러나 최근 연구 결과는 미세아교세포가 발달 중인시각계의 신경 회로를 정교하게 만드는 데 결정적인 역할을 하지 않을 수 있음을 강조하며, 미세아교세포가 시각 회로 발달에서 어떤 역할을 하는지에 대해 논란이 있음을 강조합니다.

손상 상황에서 미세아교세포는 형태를 활성 상태로 바꾸며 신경퇴행성 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, 알츠하이머병 모델의 미세아리아는 아밀로이드-베타 플라크7과 SPH, PSD958과 같은 시냅스 표지자의 삼킴 증가를 보였습니다. 망막 신경퇴행에서 많은 연구팀은 시냅스 물질이 삼켜진 미세아교세포를 발견했으나, 9, 10, 11, 12, 13 시냅스의 능동적 삼킴에 대한 명확한 증거는 없다. 예를 들어, He 등은 망막색소변성9 모델에서 미세교세포 수가 증가하고 삼켜진 시냅스 물질의 부피가 증가함을 발견했으나, 온전한 시냅스의 식과 잔해의 제거 중 어느 쪽이 있었는지는 명확하지 않다. 또한, "휴식 상태 vs. 활성화" 또는 "M1 vs. M2" 같은 전통적인 미세아교세포 분류는 지나치게 단순화되었고 현대적 통찰에 비해 점점 더 부정확해지고 있습니다. 미세교세포는 이산적인 범주가 아닌 단계별 상태로 존재합니다. 따라서 Paolicelli 등은 구식 이진 분류에서 미세아교세포 상태에 대한 보다 미묘하고 엄격하게 정의된 명명법으로 전환하여 미세교세포 형태와 활동을 더 잘 이해하고 정의할 것을 요구했다12. 따라서 미세아교세포 기능을 체외 및 생체 내에서 평가하는 전략은 발달 및 질병 맥락에서 미세아교세포 상태와 활성을 식별하는 분야 능력을 향상시킬 것입니다.

마이크로글리아 기능을 체외 및 생체 내에서 연구하는 전략이 존재하지만, 체외 생체 영상은 여러 가지 이점을 가지고 있습니다. 첫째, 각막의 선명함이나 백내장 발달은 망막 영상 촬영을 방해하지 않아 미세한 돌기와 시냅스 천점을 명확히 시각화할 수 있습니다. 더불어 생체 내 영상은 설정에 더 많은 기술적 기술이 필요하므로, 체외 준비는 더 높은 처리량이 필요해 실험당 더 많은 동물 이미징이 가능합니다. 생체 내 영상이 이론적으로 이점을 제공할 수 있음에도 불구하고, 종방향 영상을 위해서는 미세아교세포 돌기 운동성을 포착하려면 높은 레이저 출력(100-230 μW)이 필요합니다14,15. 그러나 낮은 레이저 출력과 적절한 영상 매체를 사용한 미세아교세포의 체외 영상은 적절한 준비를 통해 생체 내 영상과 동일한 영상 품질을 제공할 수 있으며, 조직이 더 이상 제자리에 있지 않더라도 말이다.

우리는 일시적 안압(IOP) 상승10 이후에 미세아교세포의 수, 복잡성, 과정 움직임이 증가함을 입증했습니다. 고정 조직에서는 이 미세아리오시스가 시냅스 단백질과의 공존 위치를 증가시킵니다10. 이전 연구들은 또한 쥐 레이저 유도 안구 고혈압 모델(LIOH) 및 기타 신경퇴행성 모델 10,16,17,18,19,20에서 망막 신경절 세포(RGC)의 초기 시냅스 손실과 수상돌기 퇴행성을 입증했습니다. 그러나 이들이 시냅스를 가지치기하는 데 능동적인 역할을 하는지, 아니면 분해된 시냅스를 포함한 세포 잔해를 제거하는 보다 수동적인 역할을 하는지는 아직 알려지지 않았습니다. 시냅스 해체가 신경퇴행의 초기 특징인 만큼, 미세아교세포 역학과 시냅스 해체에서의 역할을 이해하는 것이 매우 중요합니다 8,10. 여기서는 라이브 영상을 사용하여 미세아교세포 역학과 RGC 수상돌기의 흥분성 시냅스 후 밀도 단백질-95(PSD95)와의 상호작용을 이해합니다.

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Protocol

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동물들은 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스에 12시간 빛과 12시간의 어두운 빛 주기 하에 수용되었으며, 별도 명시가 없는 한 물과 표준 식단을 자유롭게 제공했습니다. 모든 절차는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 재료와 기기에 대해서는 재료표를 참조하십시오. 유리체 주사부터 영상 검사 및 분석까지의 실험 절차 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. AAV-PSD95-TagRFP 바이러스 생산 및 효율성

  1. PSD-95pTagRFP 서열(Addgene 플라스미드 #52671; RRID:Addgene_52671) 그리고 GFP를 제거한 후 AAV-CMV-GFP에 CMV 프로모터 하류에 삽입합니다(Addgene 플라스미드 #67634; 리드: Addgene_67634).
  2. 바이러스를 3중 형질전환 HEK293T으로 준비하고, PEG/클로로포름으로 정제하며, 1012 ip/mL로 농축한 것입니다(Negrini 등에서 설명).21살.
    참고: 이 바이러스 생산 방법은 일반적으로 초원심분리보다 낮은 역가를 생성하지만, 이러한 실험에서는 감염이 드문드문있는 세포를 사용하는 것이 바람직합니다. 이 실험에서 사용된 캡시드/혈청형 버전은 7m8였으며, (Addgene 플라스미드 #64839; 리드: Addgene_64839).
    1. 전체 영상 프로토콜을 진행하기 전에 AAV의 효율을 테스트하세요.
      참고: 이 프로토콜을 구현하는 독자는 개별 RGC 수상돌기를 식별하고 분리하는 것이 목표이므로 RGC의 라벨링을 최소화하는 것을 목표로 해야 합니다.
  3. 성공적인 형질전환을 확인한 후, 1x ACSF에 2% PFA로 망막을 고정합니다. 시냅스 단백질의 경우, 공초점 현미경으로 63배 신호를 확인하여 형광 표지의 선명한 해상도를 검증합니다.
    참고: 고정 농도가 낮아 시냅스 단백질의 표지 보존에 도움이 됩니다. 만약 사용되는 AAV가 시냅스 성분이 아니라면, 독자는 4% PFA를 선택할 수 있습니다.

2. 마우스 사육과 AAV-PSD95-TagRFP 유리체 내 주사

  1. 수컷과 암컷 CD-1 알비노 마우스(변종 022)를 B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J(균주 005582)와 교배하여 EGFP 발현 미세아세포를 가진 CD-1 백색 마우스를 생산합니다. 수컷과 암컷 Cx3cr1 이형접합 마우스를 실험에 사용하려면 최소 4세대의 백크로스킹을 기다려야 합니다. 유전적 부패를 방지하기 위해 10세대 후 CD-1 배경으로 유지하고 갱신하세요.
  2. 동물(P30-P60)을 산소 내 3-5% 마취제를 유도 챔버를 통해 마취하며, 산소 유량은 1L/분으로 조절합니다. 동물을 입체현미경에 올려놓고, 이소플루란이 코 콘을 통해 지속적으로 투여되도록 하세요. 동물이 마취되었는지 확인하려면 발가락을 최소 3번 꼬집어 확인하세요.
  3. AAV 주사 전에 0.5% 프로파라카인을 한 방울 추가하세요. 26s G 10 μL 주사기를 사용하여 양쪽 눈 상측두엽 변연에 2μL AAV-PSD95-RFP를 천천히 주사합니다. 주사 부위를 통해 AAV가 역류하는 것을 막기 위해 바늘을 천천히 제거하세요. 주사 후에는 항생제 연고를 눈에 바르세요.
  4. 참고: 바늘은 유리체 방 둘레의 절반을 넘지 않아야 합니다. 이렇게 하면 바늘 끝이 망막과 수정체를 손상시켜 반드시 반죽이거나 실패한 형질전환이 발생할 수 있습니다. 백내장 발병이나 출혈은 주사 기술의 결함을 나타냅니다.
  5. 주사 후에는 동물들이 깨어 있는지 확인한 후 원래 우리와 방으로 돌려보내세요. 주사 후 통증이 나타나면 복막 내 주사로 부프레노르핀을 투여합니다. AAV 발현은 3주를 기다려야 합니다. 유도 모델을 사용해 안압을 올리거나 다른 조작을 할 경우, 반대쪽 눈이나 순진한 동물의 눈을 대조군으로 사용하여 한쪽 눈의 안압 상승을 유도하기 전에 3주를 기다려야 합니다.

3. 안락사 및 망막 평면 장착

  1. 다음 성분을 포함한 인공 뇌척수액(ACSF, pH 7.4)을 1x PBS에 신선한 1x 용액을 준비합니다: mM 단위: 119 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 MgCl2·6H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1 NaHPO4, 11 포도당, 20 HEPES.
  2. 급성 해부용으로 사용하기 전에 최소 15분간 용액에 산소를 공급하세요. 튜브를 산소 탱크에 연결하고, 가스가 새어나가지 않도록 중앙에 구멍이 뚫린 캡을 씌우세요.
  3. 작은 유도 챔버에서 최소 1mL의 이소플루란 마취제로 쥐를 안락사시키고, 이어서 경추 탈구를 시행합니다. 핵 제거 전에 각막의 비강 쪽에 마커를 표시해 망막 위치를 실험 내내 추적할 수 있게 하세요.
    1. 마이크로비드 주입 또는 레이저 안을 정출하려면 제한된 결막 복근절개술을 시행하고 가위를 눈 뒤에 대어 시신경 기저부에서 눈을 분리합니다. 이렇게 하면 섬세한 눈이 온전하게 유지됩니다.
  4. 해양 현미경을 사용해 23G 또는 25G 바늘로 각막에 작은 구멍을 뚫어 산소가 풍부한 ACSF가 눈을 관류할 수 있게 합니다. 이 구멍에 가위를 넣어 코 쪽 끝을 신탁 절단 모양으로 만듭니다.
  5. 림버스에서 각막과 홍채의 나머지 부분을 잘라내세요.
  6. 홍채와 렌즈를 제거하세요. 망막이 수정체에 달라붙으면 겸자를 사용해 분리하세요.
  7. 겸자를 사용해 RPE와 신경망막 사이를 부드럽게 절단하여 망막과 공막을 분리하세요.
  8. 망막을 혼합 셀룰로오스 에스터(MCE) 멤브레인 필터 페이퍼의 격자판이 없는 쪽에 올려 명확한 시각화와 영상을 촬영하세요.
  9. 망막의 나머지 세 사분면에는 작고 편안한 절개를 하고, 가장 긴 절단은 비막 위치를 추적하기 위해 남은 곳입니다.
    참고: 망막은 네잎 클로버처럼 보여야 합니다.
  10. 필터지에서 망막을 실험실 물티슈로 옮기세요. ACSF 한 방울로 망막을 촉촉하게 한 뒤, 그 물티슈로 필터지를 말리세요. 최소 8-10방울 정도 반복해서 망막이 필터 페이퍼에 잘 붙도록 하세요.
  11. 망막을 산소 공급실에 넣고 반대쪽 눈을 박리하세요.
  12. 촬영 준비가 되면, 3.10 단계에 나온 대로 필터 페이퍼를 말리고 망막을 마텍 페트리 접시 위에 뒤집어 놓으세요. 망막을 금속 구슬이나 링으로 누르세요. ACSF 3-5방울을 추가하세요.
    참고: 금속 비드 배스나 링에서 나오는 작은 금속 비드는 망막 무결성을 해치지 않으면서도 드리프트를 방지할 수 있을 만큼 충분한 크기와 무게를 가지고 있습니다.
  13. 강철 와이어와 늘린 나일론 끈을 붙이고 무게를 더해 고정되고 팽팽한 평행 줄이 있는 링을 만듭니다.
    1. 1/2인치 직경의 원통에 와이어를 감고 펜치로 팽팽하게 당기세요. 원통에서 각 링을 잘라내고 바이스 사이에 납작하게 만듭니다.
    2. 한쪽 면의 링을 사포질해서 거칠고 평평한 면을 만듭니다. 직경 1-2인치 병 입구에 나일론 줄을 늘려 고무줄로 고정하세요.
    3. 링을 나일론 줄 위에 올려놓고, 링 안쪽 둘레에 소량의 접착제를 발라 조심스럽게 나일론 줄에 붙입니다. 그 다음, 동전이나 가느다란 금속 철사 같은 가벼운 추를 반지 위에 올려 반지를 고정합니다.
    4. 건조 후에는 정밀 가위로 링 바깥 가장자리에서 나일론 끈을 잘라냅니다. 그 결과 링의 직경을 팽팽하게 늘려가는 고정된 평행 줄들이 생깁니다.
    5. 링 내 나일론 실 밀도가 너무 높으면, 실험 필요에 맞게 마이크로디스해부 스프링 가위로 개별 실을 자르세요.
      참고: 해부 및 부착 과정은 약 5분 정도 걸릴 것입니다. 조직이 생 체 밖에서 균형 잡힌 생리적 조건에 빨리 배치될수록 조직은 더 건강해집니다.

4. 회전 디스크 공초점 획득

참고: 가습실을 5%CO2 로 켜고 최소 1시간 이상 돌리면 영상 촬영 전입니다. 시스템과 시료가 열적 평형에 도달하도록 허용하면 드리프트를 줄이는 데 도움이 됩니다.

  1. 접안렌즈를 10배로 스캔해 미세교구에 초점을 맞추기 시작하세요. 조직에서 영상 부위를 탐색할 때는 미세아교세포 채널을 기준으로 삼고, 밝은 시냅스 지점이 공존 위치(10-20 μm 이내)인 미세교세포에만 집중하세요. AAV 표지는 조직 전체에서 균일하지 않기 때문에, 미세아교세포와 눈점이 같은 평면에 함께 위치한 부위를 스캔합니다. 이 기준을 충족하는 영역을 찾으면 초점을 맞추기 위해 60배로 전환하고, 카메라 버튼을 눌러 카메라 모드로 전환하세요.
    1. 영상 시스템 소프트웨어를 사용해 화면을 우클릭하여 xy-내비게이션을 찾으세요. 미리보기 화면이 나타나 3 x 3, 5 x 5 프레임 또는 최적의 영역을 위한 맞춤 크기로 조직을 스캔할 수 있습니다. 3 x 3 또는 5 x 5 프레임 크기와 하나의 참조 채널을 사용하는 스크린을 사용해 지속적인 광표백을 방지하세요.
      참고: 이 프로토콜에서는 미세글리아 채널을 사용했습니다.
  2. 60배 대물렌즈(NA 1.49)를 장착한 회전 원반 공초점 현미경을 사용해 장착된 망막을 즉시 영상화하세요.
  3. 샘플을 미리 보시려면 화면을 우클릭하고 라이브를 선택한 후 자동 조정 버튼을 클릭하면 시스템이 현재 LUT에 따라 뷰를 조정할 수 있습니다. 레이저 설정을 조정하려면 각 채널을 개별적으로 먼저 선택하고 필요에 따라 레이저 출력과 노출을 조정하세요. 그 후 형광체를 우클릭하여 '설정(Assign to Microscope) '을 선택하고, 다른 채널로 전환할 때 소프트웨어가 저장하지 않으니 사용자 지정 설정을 저장하세요.
    1. 다음 채널로 전환하고 필요에 따라 조정하세요. 형광체를 우클릭하여 설정을 저장하세요. 한 프레임에서 여러 채널을 획득할 경우, 각 채널을 개별적으로 미리 본 후 동일한 값을 입력하세요. 형광체를 우클릭해서 설정을 저장하세요.
    2. 다중 채널 획득을 위해 람다 탭에서 관심 있는 채널을 선택하세요. 라이브 영상 촬영의 경우, 관심 있는 셀에서 미세한 움직임을 빠르게 캡처하기 위해 모든 채널을 하나의 채널로 결합하여 각 채널을 동시에 획득할 수 있게 하여, 셀 속도에 따라 타임랩스에 지연이 발생할 수 있습니다.
  4. 원하는 시간에 맞는 타임랩스를 촬영하세요.
    1. 왼쪽 하단의 시간 탭에 20초 간격으로 5-10분 타임랩스를 입력하세요.
    2. 오른쪽 획득 설정 탭에서 이미지 해상도를 608 x 832 , 픽셀 크기 는 0.12 μm로 설정하세요.
    3. 0.3 μm 단계로 10 - 20 μm 단위로 이미지를 수집하여 z축을 따라 미세미세아교세포 돌기와 시냅스 지점의 적절한 해상도를 보장합니다. 성공적인 셀 추적을 위해 프레임 간 간격을 20-30초 유지하세요.
      참고: 조직이 체외에서 매우 취약하기 때문에, 실험용 망막을 먼저 촬영하고 최대 1시간 이내로 촬영하는 것이 권장됩니다. 이는 첫 번째 망막을 촬영할 때 산소가 공급되는 챔버에 있어야 하는 반대쪽 대조안의 상태를 정상화하기 위한 것입니다.
  5. 이 프로토콜을 사용해 망막의 더 표면적인 층을 촬영하세요. 20 μm보다 큰 타임랩을 획득하면 20초 간격 동안 미세한 공정 움직임을 포착하기 어려워집니다. 따라서 20 μm 스택 내에 들어맞는 미세아세포만 촬영할 수 있습니다.

5. 추적 분석 및 데이터 내보내

  1. 미세아세포 표면 렌더링
    1. 타임랩스 파일을 파일 변환기 소프트웨어를 사용해 IMS 형식으로 변환하세요. 4.2단계에서 획득한 이미지 특성을 기반으로 다음 복셀 크기를 입력합니다: x = 0.1272423 마이크론, y = 0.1272423 마이크론, z = 0.3 마이크론.
    2. 출시 후 분석 소프트웨어는 Arena에서 시작됩니다. Observe 폴더를 클릭하면 이전에 변환된 파일을 엽니다. 이미지가 3D 뷰인지 확인하세요.
    3. 전체 개별 미세교세포를 감지하려면 오브젝트 툴바의 파란색 표면 아이콘을 클릭하세요. 알고리즘 설정에서 마지막 세 가지 옵션을 선택하세요: 표면 추적(시간에 따라), 표면 분류, 객체-객체 통계. 파란색 재생 버튼을 클릭하면 다음 단계로 넘어가세요.
      1. 여러 미세아교세포가 존재하는 경우, 하나의 표면 물체 내에 개별 미세아교세포가 존재하도록 관심 영역(ROI)만 세분화하도록 선택하세요. x, y, z 매개변수를 설정하여 관심 있는 개별 미세교세포 표면만 만듭니다.
    4. 표면 렌더링이 생성될 채널을 선택하세요. 원한다면 표면 생성을 부드럽게 하기 위해 Smooth를 선택하고 이미지의 복셀 크기에 대해 1:1 - 1.25 비율을 사용하세요. 예를 들어, 이미지의 복셀 크기가 0.12 x 0.12 x 0.3 μm이라면, 표면 디테일을 0.15 - 0.16 μm로 설정하세요. 임계값 설정 아래에서 머신러닝 세분화를 선택하여 관심 있는 셀을 감지하도록 소프트웨어가 학습합니다.
      참고: 다음 단계는 머신러닝 세분화를 통해 Imaris AI에 학습 데이터를 공급하는 것입니다.
    5. 훈련 데이터 아래에서 두 개의 붓 도구를 관찰합니다: 배경(배경 감지용)과 전경(샘플의 실제 신호 감지용). 원하는 붓을 선택하고 Shift+왼쪽 클릭을 사용해 붓질을 그리세요. 설정에서 보간(Interpolate Display)이 선택되어 있는지 확인하세요. Train과 Predict를 선택하여 붓질로 만든 학습 데이터를 입력하세요.
      참고: 6번 이상의 스트로크를 투여하면 AI의 처리 시간이 길어지고 셀의 정확한 캡처가 불가능합니다.
      1. 가운데 노란 포인터 를 사용해 z-스택을 가로질러 이동하세요. x, y, z 평면과 타임랩스의 몇 가지 (모두는 아닌) 시간 프레임에 여러 번 붓질을 그려보세요. 한 번에 3-5번의 짧은 붓질을 하세요. AI는 한 번에 작은 정보 조각으로 배우는 것이 가장 좋습니다. 이 단계를 매번 반복적으로 조정하여 정확한 셀 표면이 생성될 때까지 반복합니다.
      2. 노란색 사각 형을 선택해 훈련 화면과 실제 생성된 표면 사이를 전환하세요. 또한 타임랩스를 통해 표면이 셀을 정확히 나타내는지 확인하세요.
    6. 정확한 표면 렌더링이 완료되면 다음 단계로 넘어가세요. 분리된 객체를 선택 해제하세요.
    7. 히스토그램의 복셀 수를 조정하세요. 임계점을 이동시켜 메인 표면에 연결되지 않은 작은 객체들을 제거하세요.
      참고: 이 단계는 배경 소음으로 인해 생긴 원치 않는 작은 표면을 제거하는 데 사용됩니다. 목표는 관심 있는 주요 셀 본체와 연결되지 않은 표면을 제거하는 것입니다.
    8. 다음으로, 필요에 따라 표면을 편집하세요. 필요에 따라 가위 도구로 메인 표면이나 절단 가장자리에 포함되지 않은 객체는 수동으로 지우세요.
    9. 원한다면, 객체와 연관될 수 있는 허용 간격의 임계값을 설정할 수 있습니다. 이동 셀의 추적 알고리즘을 선택하세요.
      참고: 자기회귀 모션은 셀 트래킹에 가장 일반적으로 사용되는 도구로, 타임랩스 내내 연속적인 움직임을 추적합니다.
      1. 최대 거리와 최대 간격 크기는 표면이 벗어날 수 있는 중요한 지점을 설정하는 사용자 정의 숫자입니다. 최대 간격 거리 를 0.96 μm , 최대 간격 크기를 3 (기본 설정)로 설정하세요.
    10. 5.1.7 단계에서 표면 객체를 필터링한 것과 유사하게, 메인 표면과 연관되지 않은 트랙을 필터링합니다. 이 역시 히스토그램으로 조정됩니다. 임계값을 설정할 위치를 정의하면, 5 타임프레임을 초과하지 않는 작은 스팟 트랙이 필터 조정에서 언제 제거되는지 확인해 보세요.
    11. 다음으로, 원한다면 분류를 설정하세요. 예를 들어, 변위 길이를 0 - 1 μm 에서 1+ μm 사이로 분류하여 작은 공정 이동이나 매우 큰 공정 또는 셀 변위를 판단합니다.
    12. 마지막으로, 이전 단계의 분류를 사용하여 특정 사건에 적절한 라벨을 붙입니다.
      참고: 이 단계는 시냅스 후 신호의 스팟이 생성된 후에 가장 잘 활용됩니다.
  2. PSD95의 스팟 분류
    1. 전체 개별 미세교세포를 감지하려면 오브젝트 툴바의 파란색 표면 아이콘을 클릭하세요. 알고리즘 설정에서 마지막 세 가지 옵션을 선택하세요: 표면 추적(시간에 따라), 표면 분류, 객체-객체 통계. 파란색 재생 버튼을 클릭하면 다음 단계로 넘어가세요.
    2. 시냅스 마커의 소스 채널 을 선택하세요. 슬라이서와 다른 채널은 모두 꺼서 PSD95만 시각화하세요. ctrl 버튼과 포인터 선택 도구를 사용해 펀크타의 xy 직경을 추정하세요.
      1. 타임랩스 내내 지속되는 밝은 포인트 몇 개(크기는 0.6 μm 에서 1.2 μm 사이)를 골라보세요.
      2. 배경 뺄셈을 끄세요. 이미지에 배경 감산이 필요한 경우, 타임랩스 처리 전에 이미지 처리(Image Processing) 내 배경 뺄셈 도구를 사용하세요.
    3. 다음으로, 스팟 품질에 따라 필터를 추가하세요. 히스토그램을 드래그하여 타임랩스 내내 모든 PSD95 펀크타를 정확하게 캡처하세요.
      참고: 품질은 스팟9 중심의 강도에 따라 결정됩니다. 이 필터는 복셀 필터 수나 직경 필터 수에 비해 PSD95의 실제 신호를 가장 정확하게 포착합니다.
    4. 다음으로, 편집 단계를 통해 노이즈로 생성된 모든 부분을 제거합니다. 큐브 커서와 원 커서 사이를 전환하면 잡음 때문에 1-2 시간 동안만 나타나는 단일 또는 여러 점을 제거하세요.
    5. 원한다면, 객체와 연관될 수 있는 허용 간격의 임계값을 설정할 수 있습니다. 시냅스 마커에 맞는 추적 알고리즘을 선택하세요.
      1. 최대 거리와 최대 간격 크기는 사용자가 정의한 숫자로, 스팟들이 벗어날 수 있는 중요한 지점을 설정합니다. 최대 간격 거리 를 14.6 μm , 최대 간격 크기를 3 (기본 설정)로 설정하세요.
    6. 5.2.3 단계에서 스팟 객체를 필터링한 것과 유사하게, 구분된 펀크타와 연관되지 않은 트랙을 필터링합니다. 이 역시 히스토그램으로 조정됩니다. 임계값을 어디에 설정할지 정의하려면 작은 객체 트랙이 언제 제거되는지 확인하세요.
    7. 원한다면 분류를 설정하세요. 예를 들어, 최단 지상 거리 분류를 사용하여 포용된 지점, 접촉된 지점, 접촉하지 않은 지점을 구분합니다. 표면 내에서 0 μm < 어떤 지점처럼 포용되어 있고, 표면에서 0에서 0.5 μm 사이로 접촉하거나, 0.5+ μm 거리에서 접촉하지 않은 상태로 설정됩니다.
    8. 마지막으로, 이전 단계의 분류를 사용하여 특정 사건에 적절한 라벨을 붙입니다.
  3. 표면과 점이 관심 있는 미세교세포와 지점을 정확히 나타내면, 통계 탭 아래 각 객체의 모든 통계를 내보내세요. 상세 통계가 추출되어야 하며, 여기에는 변위 길이, 속도, 접촉 사건이 분류되어야 합니다.
    1. 면적, 부피, 변위 길이, 속도 등 많은 통계가 이마리스에서 출력됩니다. 표면 변위 길이와 속도를 내보내 실험에서 미세교세포 역학을 정의합니다.
      1. 변위 길이를 표면의 초기 위치와 최종 위치 사이의 거리(μm22 단위)로 정의합니다.
      2. 속도를 한 시간 간격에서 다음 시간 구간으로 표면의 순간 속도로 정의하며, μm/s22 단위로 측정합니다.
        참고: 접촉 사건은 저자들이 설명한 현상으로, 시간 주기 내에 최소 다섯 번의 일정한 시간 동안 개별 미세아교세포 간에 0 μm 거리를 공유하는 온전한 시냅스 후 천점입니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CX3CR1-GFP 쥐 망막의 미세아교세포는 설명된 프로토콜을 사용하여 영상화되었습니다. AAV-PSD95-RFP 주사 시점의 쥐 수치는 P30에서 P60 사이였으며, AAV 발현이 가능할 때까지 최소 21일이 경과되었습니다. 미세아교세포의 대표적인 이미지와 PSD95 눈점과의 상호작용 분석 전후 분석은 그림 2에 나와 있습니다. 미세교세포 활성화를 유도하기 위해 우리는 마우스 레이저 유도 안구 고혈압(LIOH) 모델을 사용했는데, 이 모델은 일시적으로 안압(IOP)10,16,17,1

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 RGC의 수상돌기를 따라 시냅스 후 부위와 개별 미세교세포 상호작용을 시각화하고 추적할 수 있게 합니다. 녹내장과 같은 신경퇴행성 질환에서는 미세아교세포가 망막의 내부 플렉시폼층(IPL)에서 시냅스와 함께 위치합니다. 미세아교세포가 시냅스 해체에서 차지하는 역할은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 그러나 미세아리아는 시냅스를 비정상적으로 집어삼키거나, 세포 세포의 잔해를 수동적으로 제거하는 것 또는 이 메커니즘의 조합 등 여러 잠재적 메커니즘을 통해 기여할 수 있습니다.

이 프로토콜은 이러한 구분을 하고 미세아교세포의 발달 및 질병 상태에서의 행동을 특징짓는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 설명된 실험 프로토콜을 사용하여 병든 쥐 망막에서 미세아교세포 역학과 시냅스 구조와의 상호작용을 성공적으로 영상화하였습니다. 레이저 상태에서 미세아교세포 돌기 변위 길이와 속도가 대조군에 비해 증가하는 것을 관찰했습니...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP는 요하네스 헬(Addgene 플라스미드 #52671; RRID: Addgene_52671), 캡시드 버전인 7m8은 존 플래너리와 데이비드 셰퍼(Addgene 플라스미드 #64839; 리드: Addgene_64839). 아파르나 락카라주에게 실험실의 회전 디스크 현미경 사용을 허락해 주셔서, 그리고 라이브 이미징에 대한 안내를 해주신 닐사 라 쿤자님께 감사드립니다. 또한 이 원고에 대해 유익한 토론과 의견을 주신 펠리스 던, 아니카 발라지, 루카 델라 산티나에게도 감사드립니다. 이마리스에 대한 데이터 분석을 도와준 수링 왕에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH-NEI EY028148 및 EY034973 연휴, ARVO 데이비드 L. 엡스타인 연방 상, NIH-NEI EY034973-S1 연방 프로그램의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 NIH-NEI P30 EY002162/EY037668의 UCSF Vision Core 공유 자원과 뉴욕 시각 장애 예방 연구(Research to Prevent Blindness)의 무제한 보조금의 지원을 일부 받았습니다. 그림 1 은 biorender.com 에서 제작되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25게이지 바늘알콘8065420920
26초 게이지 10 및 마이크로; L 주사기해밀턴701 RNWG
7m8애드진64839http://n2t.net/addgene:64839
벤드 앤 스테이 다목적 304 스테인리스 스틸 와이어스탠포드 첨단 소재SS3368고리를 만들기 위한 강철 와이어
염화칼슘 육수화물시그마-올드리치C5080-500G
해리 현미경암스코프망막 해부와 장착
해부 가위FST15024-10
D-(+)-포도당시그마-올드리치G7528-250G
겸자듀몽11252-21
젠장시그마-올드리치H3375-500G
이마리스 10.0.2옥스퍼드 인스트루먼츠분석 소프트웨어
이마리스 파일 변환기옥스퍼드 인스트루먼츠
록타이트 슈퍼글루 울트라 젤 컨트롤록타이트1363589반지 만들기 접착제
염화마그네슘 육수화물시그마-올드리치M9272-100G
MCE 멤브레인 필터 페이퍼 (13mm)밀리포어HABG013000.45 & μ; m 모공 크기
미세환경 챔버토카이 히트STXG-TIZBX-세트
니콘 이클립스 Ti2-E 역현미경니콘
NIS 요소니콘
네오마이신과 폴리미신 B 설파 및 바시트라신 아연 안검 용액 연고, USP바우쉬 + 롬24208-780-55
페인트브러시 크기 00아마존
프리즘 8.0그래프패드
프로파라카인 염산염 안과 용액 USP, 0.5%산도즈61314-0016-01
PDL 코팅 페트리 접시 (35mm)마텍P35GC-1.5-14-CNo 1.5 코버슬립
PSD95_pTagRFP애드진52671http://n2t.net/addgene:52671
염화칼륨시그마-올드리치P9333-500G
염화나트륨시그마-올드리치S7653-1KG
인산나트륨 단염성 단수화물시그마-올드리치S9638-25G

References

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