종양 및 질병 연구를 위한 접착제 기반 조직 마이크로어레이 구축

Summary

이 프로토콜은 접착제 기반 TMA 구성을 위한 저비용 생산 및 효율적인 검증 방법을 설명하여 종양 및 질병 연구를 위한 편리한 병리학적 진단 플랫폼을 제공합니다.

Abstract

조직 마이크로어레이 기술(TMA)은 여러 조직 샘플을 동시에 검출하고 분석할 수 있는 고처리량 플랫폼으로, 효율적인 종양 및 질병 바이오마커 연구를 촉진합니다. 그러나 기존의 TMA 구축 방법은 운영 복잡성, 시간 소모적인 절차, 다양한 정확도 등의 한계에 직면하는 경우가 많습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 접착제 기반 TMA 구성 방법이 개발되어 조직 코어 고정이 개선되고 구조적 안정성이 향상되었습니다. 체계적인 검증에는 조직학적 평가(HE 염색), 표적 단백질의 면역조직화학적 프로파일링 및 형광 제자리 혼성화(FISH) 분석이 포함되었습니다. 결과는 접착제 기반 분석법이 우수한 슬라이스 무결성을 유지하고 신호 대 잡음비를 개선하며 일관된 배치 간 재현성을 보장한다는 것을 보여주었습니다. 이 접근 방식은 수동 작업으로 제한되지만 중간 처리량의 TMA 생산을 위한 안정적이고 비용 효율적인 옵션을 제공합니다. 이 방법은 대규모 자동화보다 유연성과 샘플 다양성을 중시하는 연구 환경에 특히 적합하며 학술 및 진단 환경에서 TMA의 유용성을 확장합니다.

Introduction

TMA(Tissue Microarray)는 조직 샘플 ^1,2,3을 분석하기 위한 고처리량 기술입니다. 다중 기증자 조직 코어를 얻고, 이론적으로 동일한 성능 조건 ^2,4에서 동시 차등 및 비교 분자 분석을 위해 기증자 파라핀 블록을 수혜자 조직 블록으로 옮깁니다. 조직 마이크로어레이(TMA)를 구성하는 고전적인 방법은 홀 펀치를 사용하여 기증자 조직 샘플에서 조직 코어를 추출하고 이를 수혜자 파라핀 블록으로 순차적으로 배열하는 것입니다. 이 방법은 유사한 깊이의 기증자 파라핀 블록에 적합하며 단일 슬라이스에서 여러 샘플을 효율적으로 분석할 수 있어 연구의 효율성과 데이터의 일관성을 크게 향상시킵니다 ^5,6,7. 그럼에도 불구하고 이 방법은 포매 과정에서 조직 코어의 부적절한 취급을 포함하여 여전히 특정 제한 사항을 가지고 있으며, 이로 인해 후속 분석에서 샘플의 염색이 일관되지 않을 수 있습니다⁸.

TMA 구성의 두 번째 방법은 테이프 방식 ^9,10이다. 이 방법은 코어 길이^11,12에 관계없이 완료 시 TMA 상단과 같은 높이가 되는 거꾸로 된 직립 코어 주위에 블록을 주조하여 건설 과정을 반전시킵니다. 그러나 이 방법은 조직 코어의 적절한 배치와 테이프의 효율성을 보장해야 하며 기존 기술에 비해 처리할 수 있는 샘플 수도 제한됩니다.

본 연구는 전통 기술에 존재하는 조직 코어의 불충분한 안정성, 복잡한 조작 등의 문제를 해결하기 위해 TMA 구축을 위한 혁신적인 접착제 방법을 제안한다¹³. 이 방법은 접착제를 사용하여 여러 조직 코어를 정밀하게 고정하며 조작이 간단하고 샘플 견고성이 강하다는 장점이 있습니다. 기존의 절편 또는 테이프 방법에 비해 접착제 방법은 조직 코어의 유지율을 높이고 비용을 절감할 수 있습니다. 이 방법은 표본 크기가 중간 정도인 임상 연구에 적용할 수 있으며 특히 실험 계획의 유연한 조정이 필요한 연구 설계에 적합합니다. 그러나 이 방법의 처리 능력은 초고처리량⁹의 요구 사항을 충족하지 못한다는 점에 유의해야 합니다. 한편, 실제 적용 과정에서 표준화된 운영 규범과 품질 관리 시스템을 완벽하게 구축해야 합니다. 운영자는 기술 운영의 표준화와 결과의 반복성을 보장하기 위해 체계적인 교육을 받고 전문적인 평가를 통과해야 합니다. 종합적인 분석에 따르면 이 기술은 운영 유연성, 비용 효율성 및 기술적 신뢰성 사이에서 적절한 균형을 이루고 있으며 자원이 제한되어 있지만 품질 관리가 여전히 보장되어야 하는 연구 시나리오에 특히 적합합니다.

Protocol

모든 기증자 블록은 2016년에서 2018년 사이에 난징 의과대학 부속 화이안 제1 인민병원에서 수집된 보관 병리학적 표본에서 얻었습니다. 샘플은 사용 전에 비식별화되었으며 승인된 프로토콜(난징 의과대학 부속 화이안 제1 인민병원 윤리위원회, KY-2024-250-01)에 따라 처리되었습니다.

1. 기증자 조직의 평가 및 태깅

1. 두께가 ≥5mm이고 면적이 ≥15mm× 15mm인 조직 블록을 선택합니다. 가장자리에 2mm의 안전 여유를 확보하고 조직 무결성을 유지하기 위해 괴사, 출혈 또는 석회화를 보이는 영역을 제외합니다.
2. 대상 영역 식별 및 표시
   1. 광학 현미경을 사용하여 H&E 염색 절편을 평가합니다. 저전력 스캐닝을 통해 표적 영역을 찾은 다음 고출력으로 전환하여 세포 형태학적 특성을 확인합니다. 슬라이드에 대상 영역 경계를 표시합니다.
   2. 선택한 영역의 좌표를 파라핀 블록의 표면에 매핑하여 마킹 변환을 완료합니다.

2. 조직 코어 추출

1. 천자 준비 및 샘플 전처리
   1. 직경 2mm의 휴대용 홀 펀처를 선택하고 절삭날의 부드러움과 조작 용이성을 확인하십시오.
   2. 기증자 파라핀 블록을 4°C의 차가운 플랫폼에 15분 동안 놓습니다.
2. 바늘을 표시된 지점에 수직으로 정렬하고 일정한 회전 압력을 가하여 한계 깊이에 도달합니다. 프로세스⁷ 중에 기울어지거나 진동하지 마십시오(그림 1A).
3. 바늘을 시계 반대 방향(≤2회전/초)으로 부드럽게 돌려 빼냅니다. 바늘에서 조직 코어를 조심스럽게 꺼내 사전 냉각된 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰의 코어 위치를 기록합니다(그림 1B).
   알림: 티슈 코어의 바닥이 고르지 않으면 칼날로 수평을 맞추십시오. 트리밍 후 무결성을 다시 확인하십시오.
4. 등록 양식에 모든 기증자 번호와 해당 ELISA 플레이트 웰 위치(A1-H12)를 미리 기록합니다. 작업 중에 기증자 번호와 우물 위치 간의 엄격한 일치를 확인하기 위해 다시 확인하십시오.
5. 즉시 코어의 무결성을 검사하십시오. 파손되거나 구부러지거나 직경 편차>0.1mm)가 보이는 코어는 폐기합니다.
   참고: 코어 길이 일관성(변동 계수, CV≤5%)을 보장하고 표면 긁힘이나 압축 아티팩트를 피하십시오.

3. 조직 코어 고정

1. 방수 마커를 사용하여 금형 표면에 직접 격자를 그려 선이 명확하고 균일한 간격을 유지합니다.
   1. 유효 바닥 면적이 3.0cm × 2.5cm인 표준 금형을 사용하고 각 면에 1.5mm의 빈 경계 영역을 예약합니다.
   2. 0.5mm 미세점 방수 마커를 사용하여 수평 및 수직으로 동일한 간격의 평행선 9개를 그려 9 × 9 포지셔닝 그리드(총 81개의 교차점)를 형성합니다.
      알림: 시작하기 전에 자일렌에 적신 면봉으로 금형 내부를 청소하여 박리를 유발할 수 있는 잔류 파라핀을 제거하십시오. 그리기 과정에서 강철 눈금자를 사용하여 균일한 선 두께와 명확하게 구별할 수 있는 교차점을 보장합니다.
2. 피펫을 사용하여 5μL의 접착제를 끌어당기고 미리 라벨이 붙은 슬라이드의 중앙에 부드럽게 놓아 단일 물방울을 형성합니다. 즉시 가는 핀셋을 사용하여 조직 코어를 90° 각도로 수직으로 집어 들고 접착제 방울에 수직으로 천천히 누릅니다(그림 1C).
3. 핀셋을 사용하여 금형의 해당 그리드 교차점에 코어를 삽입합니다. 안전한 접착을 보장하기 위해 5초 동안 부드러운 압력을 가합니다(그림 1D).
4. 조직 코어가 변위된 경우 접착제가 굳기 전에(30초 이내) 즉시 가는 핀셋을 사용하여 미세 조정하고 재설정합니다. 응고되고 잘못 정렬된 코어를 폐기하여 귀중한 샘플을 최대한 보존하면서 준비 품질을 유지하십시오.

4. 카세트 설치 및 파라핀 매립

1. 티슈 카세트를 강철 금형 위에 수직으로 놓고 압축을 가하지 않고 코어 팁과 접촉하도록 합니다. 네 모서리 모두에 마그네틱 클램프를 사용하여 카세트를 고정하고 용융 파라핀으로 이음새를 밀봉합니다.
2. 용융된 파라핀을 지그재그 패턴으로 45° 각도로 주입하고 1mL/s의 유속을 유지합니다. 파라핀 수준이 코어 팁을 2mm 초과하는지 확인합니다(그림 1E).
3. 4°C 냉각판에서 블록을 5분 동안 급속 냉각하여 단단한 지지층을 형성합니다. 내부 응력을 줄이기 위해 블록을 22°C 환경에 20분 동안 옮깁니다. 마지막으로 40°C 히트건을 사용하여 표면을 부드럽게 매끄럽게 하고 수축 자국을 제거합니다.
4. 파라핀을 약간 가열하여 부드러워준 다음 카세트 가장자리를 따라 조심스럽게 잘라 블록을 풉니다. 카세트를 부드럽게 들어 올리고 잔류 파라핀을 제거하여 조직 코어의 무결성을 보장합니다(그림 1F).

Results

본 연구에서는 접착제 방법을 사용하여 고품질 조직 마이크로어레이를 구성했습니다. 이 방법의 효과를 검증하기 위해 H&E 염색, 특정 단백질의 면역조직화학적 검출, 형광 제자리 혼성화(FISH) 분석 등 일련의 실험이 수행되었습니다. 구성 과정의 중요한 구성 요소는 예상 위치와 서로 떨어져 있는 위치에 조직 코어 점이 존재하는지 여부이며, 이는 육안 검사로 평가됩니다. TMA 블록을 육안으로 검사하면 코어가 각 TMA에 존재하고 규칙적으로 간격을 두고 있음을 알 수 있습니다(그림 2A). H&E 염색은 모든 조직 코어가 균일한 간격, 일관된 크기 및 풍부한 표적 조직으로 깔끔하게 배열되어 있음을 보여주었습니다(그림 2B). 면역조직화학적 염색 결과는 TMA에서 10개의 전립선암 관련 단백질(ZCCHC24, SMAD9, TARBP1, CDHR4, CRTAC1, DNASE1L3, GPR146, IG...

Discussion

조직 마이크로어레이(TMA)를 구축하는 혁신적인 방법인 접착제 방식은 시공 절차가 쉽고 비용 효율성이 뛰어나 상당한 이점을 보여주었습니다. 정교한 기구^(14,15)에 의존하는 전통적인 바늘 배열 방식과 비교하여, 접착제 방식은 접착에 의한 샘플 고정이 가능하며, 이는 기본 도구만으로 수행할 수 있어 기술적 임계값을 크게 낮춥니다. 전통적인 매립 방법과 달리 접착 방법은 국소 분배에 의해 고정되어 조직 코어의 국소화 시간을 크게 단축하고 고온에 의한 민감한 항원의 파괴를 방지합니다^16,17 (표 2).

그러나 실제 시공 절차에는 복잡하고 섬세한 단계가 많이 있습니다. 이러한 단계는 많...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
유방암 HER2 검출 키트	Anbiping	2502001	유방암 HER2 검출 키트
CDHR4 항체	Abcam	ab166914	CDHR4 항체
CDK1 항체	Abcam	ab265590	CDK1 항체
CRTAC1 항체	Abcam	ab254691	CRTAC1 항체
DNASE1L3 항체	Abcam	ab203669	DNASE1L3 항체
포매기	P.S.J MEDICAL	BM450A	포매기
전자동 조직 탈수기	Leica Biosystems	ASP3005	전자동 조직 탈수기
유리 현미경 슬라이드	Citotest	250124A1	유리 현미경 슬라이드
접착제	TIZO	200	접착제
GPR146 항체	Abcam	ab117104	GPR146 항체
IGSF10 항체	Abcam	ab197671	IGSF10 항체
ITIH1 항체 Abcam	ab233032	ITIH1 항체
로우 프로파일 마이크로톰 블레이드 Thermo	Fisher	3052835	로우 프로파일 마이크로톰 블레이드
마커 펜	델리	SK109	마커 펜
마이크로톰	라이카 바이오시스템즈	HistoCore BIOCUT	마이크로톰
파라핀 왁스	Solarbio	YA0012	파라핀 왁스
SMAD9 항체	Abcam	ab262940	SMAD9 항체
TARBP1 항체	Abcam	ab115896	TARBP1 항체
ZCCHC24 항체	Abcam	ab88756	ZCCHC24 항체