출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

Summary

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

Abstract

뇌의 상주 면역 세포인 미세아교세포는 발달 및 질병 중에 영역 및 상황별 전사 프로필을 나타냅니다. 이 프로토콜은 마우스 소뇌 조직에서 미세아교세포 집단을 연구하기 위한 두 가지 보완적인 방법인 유세포 분석법과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 제시합니다.

사용된 첫 번째 방법인 유세포 분석 기반 프로토콜은 출생 후 초기 뇌에 최적화되어 실험 조건 전반에 걸쳐 강력한 세포 분리 및 일관성을 보장합니다. 효소 소화를 사용한 조직 해리로 시작하여 Percoll 밀도 구배 원심분리를 통해 미엘린 제거를 통해 고품질 신경 세포 현탁액을 생성하고 CD45 및 CD11b 발현을 기반으로 한 게이팅 전략을 사용합니다. 살아있는/사한 염색은 세포 생존력을 보장하며, 형광색소 접합 항체는 미세아교세포에서 선택된 표면 마커의 발현을 프로파일링하는 데 사용됩니다. 보상 대조군은 형광 마이너스 1(FMO) 대조군을 사용하여 검증된 게이팅 전략과 함께 라텍스 비드를 사용하여 수행됩니다.

두 번째 방법은 동일한 업스트림 분리 단계에 따라 10X Genomics를 사용하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함하며, 이를 통해 조건 전반에 걸쳐 미세아교세포의 전사체 프로파일링이 가능합니다. 미세아교세포 클러스터는 유전자 발현 분석을 사용하여 확인하고, 실험군 간 차등 발현 분석을 실시한다. 랜덤 포레스트 분류기는 다중화될 때 남성과 여성 샘플을 구별하기 위해서만 적용됩니다.

이러한 재현 가능하고 적응 가능한 프로토콜은 초기 뇌 발달 동안 소뇌의 미세아교세포 다양성과 실험적 교란 후 잠재적인 변화를 조사하기 위한 강력한 프레임워크를 제공합니다.

Introduction

출생 후 초기는 인지, 정서, 행동 기능의 토대를 마련하는 복잡한 세포 및 분자 과정을 특징으로 하는 뇌 발달의 중요한 단계입니다¹. 그러나 이 기간은 중단이 신경 발달 궤적을 변화시키고 장기적인 신경학적 또는 정신 장애로 이어질 수 있기 때문에 취약성으로도 특징지어집니다. 뇌에 상주하는 면역 세포인 미세아교세포는 시냅스 가지치기, 식균 작용, 면역 감시 및 환경 모욕에 대한 반응을 통해 발달 중인 뇌를 형성하는 데 중심적인 역할을 합니다 ^2,3. 이 세포는 뇌 영역, 발달 단계 및 병리학적 맥락에 따라 달라지는 전사 프로필을 채택하여 놀라운 가소성을 나타냅니다 ^4,5.

발달 중인 뇌에서 미세아교세포 활성화를 정확하게 분석하려면 미성숙 뇌 조직의 맥락에서 동적 표현형을 분석할 수 있는 강력하고 반복 가능한 방법론이 필요합니다. 유세포 분석법은 신뢰할 수 있는 솔루션을 제공하여 세포 집단 및 마커 발현의 고처리량 특성화를 가능하게 합니다⁶. 그러나 출생 후 초기 뇌에서 미세아교세포를 연구하는 데 적용하는 것은 조직의 섬세한 특성과 효율적인 세포 분리 및 농축 프로토콜의 필요성으로 인해 기술적으로 어렵습니다 ^7,8.

여기에 제시된 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 결합하여 출생 후 3일(P3)부터 출생 후 30일(P30⁾⁹까지의 소뇌에 특히 초점을 맞추고 출생 후 초기 마우스 뇌에서 미세아교세포를 분리하고 특성화합니다.

이 워크플로에는 효소 해리, 파편 제거 및 세포 농축을 위한 밀도 구배 원심분리, 세포외 및 세포내 마커 패널을 사용한 면역염색이 포함됩니다. 미세아교세포 다양성을 특성화하기 위해 다양한 표면 및 세포내 마커가 사용됩니다^10,11. 고정된 라벨(염증성 또는 회복성)을 할당하는 대신, 프로토콜은 개별 마커 발현 프로파일을 기반으로 하위 집단을 정의합니다. 예를 들어, CD80, CD86 및 iNOS, CD206 및 Arg1, CD86 및 CD64, 또는 CD163 및 CD206을 분자적으로 구별되는 하위 집합으로 식별 및 분석합니다. 이들 마커는 서로 다른 활성화된 미세아교세포 상태^(10,11)를 반영하고 발현 프로파일로 제시된다.

이 다중 매개변수 게이팅 전략은 표면 마커 발현을 기반으로 미세아교세포 하위 집합을 정확하게 식별할 수 있게 하여 출생 후 뇌 발달 중 면역 이질성을 분석하기 위한 간소화된 프레임워크를 제공합니다. 표현형 프로파일링을 확장하고 전사 다양성을 밝히기 위해 세포 분리 후 단일 세포 RNA 시퀀싱이 수행됩니다. 이 연구는 신경 발달 과정과 미세아교세포 활성화의 장기적인 영향에 대한 이해를 높이기 위해 일관되고 확장 가능한 워크플로를 확립합니다. 발달 및 지역적으로 정보에 입각한 프레임워크 내에서 최적화된 유세포 분석과 scRNA-seq를 통합함으로써 이 프로토콜은 초기 생애 미세아교세포 생물학 및 신경 발달 결과와의 관련성을 조사하기 위한 강력한 도구 역할을 합니다.

Protocol

모든 동물 절차는 CHU Sainte-Justine 연구 센터의 윤리 위원회에서 검토 및 승인되었으며 Ste-Justine 연구 센터 및 몬트리올 대학교(캐나다 퀘벡주 몬트리올)의 지침 및 정책을 준수합니다.

1. 뇌에서 세포 분리

1. 마취/안락사 절차 후, 두개강에서 뇌 전체를 신속하게 제거하고 미세아교세포 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다( 재료 표 참조). 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 필요한 경우 추가 마우스에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
   이 연구에 사용된 모든 쥐는 Tremblay 박사의 실험실에 있는 사내 번식 식민지에서 파생되었습니다. 실험 마우스는 원래 Jackson Laboratories에서 공급된 B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT} 마우스와 B6-Rosa26^iDTR/WT 마우스를 교배하여 생성되었습니다. 이 육종 전략은 IDTR 대립유전자에 대한 이형접합체의 자손을 생산하여 타목시펜 유도 Cre-loxP 시스템을 통해 Cx3Cr1 발현 세포(주로 미세아교세포)의 조건부 고갈을 가능하게 했습니다. 조직 수집 전에 케타민(150μg/g)과 자일라진(10μg/g)의 복강내 주사를 통해 마우스를 마취했습니다. 안락사는 기관의 동물 관리 및 사용 지침에 따라 깊은 마취 하에 참수에 의해 수행되었습니다.
2. 원하는 경우 전체 뇌를 보존하거나 특정 영역의 해부를 진행하십시오. 세포 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 미세아교세포 배양 배지( 재료 표 참조)가 들어 있는 작은 페트리 접시에서 해부를 수행합니다.
   참고: 이 프로토콜은 P1에서 P30까지의 전체 뇌와 소뇌에 대해 검증되었습니다.
3. 미세아교세포 배양 배지를 제거하고 페트리 접시에서 메스를 사용하여 뇌 조직을 잘게 자릅니다.
4. 효소 분해를 위해 균질화된 조직을 5mL 튜브로 옮깁니다. 2 mg/mL 콜라게나제 D 및 14 μg/mL DNase I가 보충된 2 mL의 HBSS(1x)를 추가합니다( 표 1 참조). 파라필름으로 튜브 캡을 밀봉합니다. 튜브를 37°C 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 흔듭니다. 소화를 멈추려면 튜브를 얼음 위에 놓으십시오.
5. 균질을 140μm 금속 메쉬 필터( 재료 표 참조)에 통과시켜 큰 파편을 제거합니다. 유리 유봉을 사용하여 세포를 해리합니다.
6. 미세아교세포 배양 배지(세척당 3mL)로 필터를 여러 번 세척합니다.
7. 10mL 피펫을 사용하여 여과액을 수집하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 용액을 500g에서 4°C에서 7 분 동안 원심분리합니다.
8. 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상청액을 버립니다. 랙을 부드럽게 긁어 펠릿을 재현탁합니다.
9. 37% 실리카 기반 콜로이드 배지 용액 10mL를 첨가하여 미엘린과 파편을 제거합니다. 최소한의 제동력으로 4°C에서 10분 동안 용액을 500g에서 원심분리합니다.
10. 10mL 피펫을 사용하여 용액 상단의 미엘린 층을 흡인합니다.
    참고: 지속적인 흡인은 미엘린이 용액에 다시 혼합되는 것을 방지합니다.
11. 10mL의 HBSS(1x)를 첨가하여 세포를 세척하고 4°C에서 7분 동안 500×g에서 원심분리합니다.
12. 상청액을 버리십시오. 랙으로 부드럽게 긁어서 펠릿을 재현탁한 다음 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액 10mL를 추가합니다( 표 1 참조). 용액을 500g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
13. 상청액을 버리고 최종 펠릿을 재현탁한 다음 세포를 유지합니다. 분리된 세포는 이제 유세포 분석 염색 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 준비가 되었습니다.
14. 단일 세포 RNA 시퀀싱 분리의 경우, 트리판 블루( 재료 표 참조)와 함께 현미경으로 안정적인 형광 시약( 재료 표 참조)을 사용하여 세포를 계수하여 살아있는 세포와 죽은 유핵 세포를 구별합니다. 세포가 최대 90%의 생존율로 우수한 상태이고 1000개 세포/μL의 농도에 도달하는지 확인하십시오. 다음 단계는 섹션 9.1에 설명되어 있습니다.
    알림: 프로토콜 내내 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 모든 원심분리 단계는 최소 브레이크가 지정된 Percoll 단계를 제외하고 최대 브레이크로 4°C에서 수행해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 같은 날 전체 프로토콜을 수행하십시오. 단일세포 RNA 서열분석프로토콜 필터의 경우, 분리에 사용되는 모든 용액의 경우, 1.11단계에서 두 번째 세척을 위해 HBSS(1x)를 사용하고, 1.12단계에서 70-100μL의 세포 용액을 유지한다.

2. 유세포 분석 세포외 염색 프로토콜

1. 모든 세포를 바닥이 원추형인 96웰 플레이트로 옮깁니다( 재료 표 참조). 플레이트를 500g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 플레이트를 빠르게 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다.
3. 세포 펠릿을 25μL의 차단 용액에 재현탁합니다( 표 1 참조). 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
4. 세포외 항체 염색 혼합물을 준비하기 위해( 표 2 참조), 항체 스톡을 10,000 × g 에서 원심분리하여 잠재적인 응집체를 제거합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액에서 원하는 부피를 조심스럽게 흡인하여 염색 혼합물을 준비하고 FACS 완충액으로 부피를 25μL로 조정합니다.
5. 각 웰에 25μL의 세포외 항체 혼합물을 첨가합니다. RT에서 20분 동안 배양합니다.
   참고: 실험적으로 사용하기 전에 모든 항체를 소뇌(또는 뇌) 단일 세포 현탁액에서 적정하여 최적의 작동 농도를 결정했습니다. 적정은 포화 곡선을 생성하기 위해 연속 희석에 의해 수행되었으며, 신호 병기를 위해 최소 배경을 가진 신호 고원에 해당하는 희석을 선택했습니다.
6. 혼합하지 않고 150μL의 FACS 완충액을 웰에 추가합니다. 플레이트를 500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다.
7. 세포 펠릿을 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 플레이트를 500× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다. 동일한 조건에서 200μL의 FACS 완충액을 사용하여 세척을 한 번 더 반복합니다.

3. 세포내 염색

1. 세포를 100μL의 사포닌-파라포름알데히드(PFA) 완충액( 표 1 참조)에 재현탁하여 세포를 고정하고 투과시킵니다. 빛으로부터 보호된 RT에서 10분 동안 배양합니다.
2. 혼합하지 않고 사포닌 완충액 100μL를 첨가합니다( 표 1 참조). 플레이트를 500× g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다.
3. 세포 펠릿을 200μL의 사포닌 완충액에 재현탁합니다. 20μL의 비드( 재료 표 참조)를 11개의 빈 웰에 추가하여 보상 대조군을 준비합니다. 플레이트를 500× g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다.
4. 세포내 항체 염색 혼합물을 준비하기 위해( 표 3 참조), 항체 스톡을 10,000 × g 에서 원심분리하여 잠재적인 응집체를 제거합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액에서 원하는 부피를 조심스럽게 흡인하여 염색 혼합물을 준비하고 사포닌 완충액으로 부피를 50μL로 조정합니다.
5. 펠릿을 50μL의 세포내 항체 혼합물에 재현탁합니다( 표 3 참조). 각 항체 1μL를 비드 웰에 추가합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
6. 혼합하지 않고 각 세포 샘플 웰에 사포닌 완충액 150μL를 첨가하고 보상 대조군이 포함된 각 웰에 FACS 완충액 100μL를 첨가하여 비드를 세척합니다. 플레이트를 500× g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다.
7. 세포 펠릿을 200μL의 사포닌 완충액에 재현탁하고 보상 대조군을 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 플레이트를 500 × g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 한 번에 상청액을 제거합니다. 동일한 조건에서 200μL의 사포닌 완충액을 사용하여 세척을 한 번 더 반복합니다.
8. 세포와 보상 대조군을 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 현탁액을 FACS 튜브로 옮기고 유세포 분석을 획득할 때까지 4°C에서 보관합니다.
   알림: 빛에 민감한 시약과 관련된 모든 단계가 최소한의 조명 조건에서 수행되는지 확인하십시오. 하나의 비드 웰에는 염색되지 않은 비드 튜브에 해당하는 항체가 포함되어 있지 않습니다.

4. 유세포 분석 획득

1. 유세포 분석기를 켠 다음 컴퓨터를 켭니다.
2. 유세포 분석기 소프트웨어를 열고 세포 분석기 탭에서 실행 을 선택하여 유체 공학 시작을 시작합니다.
3. 새 폴더를 클릭하고 이름을 지정하여 새 실험 폴더를 만듭니다. 그런 다음 새 실험을 클릭하여 실험 이름을 지정하고 새 튜브를 선택하여 표본과 샘플 튜브를 추가합니다.

5. 보상 제어 설정

1. 염색되지 않은 대조군과 함께 패널에 사용되는 각 형광색소에 대해 단일 염색 보상 비드를 준비합니다.
2. 세포 분석기에 보상 튜브를 로드합니다. FSC(Forward Scatter) 및 SSC(Side Scatter) 전압을 약 250으로 설정합니다.
3. 음수 모집단이 축의 첫 10년에 있도록 각 형광 채널의 전압을 조정합니다.
4. 튜브당 최소 5,000개의 이벤트를 획득합니다.
5. 보상 행렬을 사용하여 모든 양의 피크가 음의 모집단에서 명확하게 분리되고 각 축에서 10⁴ 위의 중심이 될 때까지 스펙트럼 중첩을 조정합니다.
   참고: 세포분석기 설정 또는 형광색소 성능이 스펙트럼 중첩에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 모든 실험에 대해 보상 제어를 수행해야 합니다. 일부 뇌 조직 응용 분야에서 세포 기반 보상 제어가 권장되지만, P3 마우스 소뇌에서 얻을 수 있는 미세아교세포의 수가 적기 때문에 항체 캡처 비드가 이 프로토콜에 사용되어 세포 기반 보상의 타당성을 제한합니다. 항체 형광은 초기에 뇌 유래 세포에서 검증되었으며 비드 기반 신호와 유사한 것으로 밝혀졌습니다. 조직 자가형광을 평가하고 기본 신호 수준을 설정하기 위해 초기 패널 최적화 중에 염색되지 않은 뇌 유래 세포 현탁액을 포함합니다. 이 제어는 각 형광 채널에서 음수 모집단을 적절하게 설정하는 데 필수적입니다.

6. FMO 컨트롤 준비 및 획득

1. 각 주요 마커에 대해 테스트 중인 항체를 제외한 모든 항체를 포함하는 형광 마이너스 1(FMO) 대조군을 준비합니다.
2. 완전히 염색된 샘플과 동일한 수집 설정을 사용하여 FMO 컨트롤을 실행합니다.
3. FMO 플롯을 사용하여 낮거나 겹치는 모집단에 대한 게이팅 임계값을 정의하고 실제 긍정을 배경 소음과 구별합니다.
   참고: FMO 제어는 특히 뇌와 같이 자가형광이 높은 조직에서 정확하고 신뢰할 수 있는 게이팅 경계를 정의하기 위해 초기 패널 최적화 중에 수행되어야 합니다. 염색 패널, 기기 설정 또는 실험 조건이 수정되면 FMO 제어를 반복해야 합니다. 동일한 검증된 패널 및 세포분석기 설정을 사용하는 후속 실험의 경우 이전에 정의된 게이팅 임계값을 재사용하여 생물학적 복제 전반에 걸쳐 일관성을 보장할 수 있습니다.

7. Isotype 대조군 준비 및 획득

1. 형광색소 및 농도가 테스트 항체와 일치하는 이소형 대조군 항체로 대조군 샘플을 염색합니다.
2. 동일한 세포 분석기 설정을 사용하여 데이터를 수집합니다.
3. 특히 세포내 마커 또는 제대로 특성화되지 않은 항체의 경우 잠재적인 비특이적 결합을 평가하기 위해서만 아이소타입 대조군을 사용하십시오. 게이팅에 이소타입 대조군은 특정 항체와 동일한 결합 동역학을 반영하지 않으므로 사용하지 마십시오.
   참고: 아이소타입 대조군은 게이팅에 적합하지 않으며 모집단을 정의하는 데 사용해서는 안 됩니다. 이들의 사용은 선택 사항이며 선택된 경우에 항체 특이성을 검증하기 위해 예약되어야 합니다.

8. 유세포 분석 게이팅 전략

1. 순차 게이팅을 위해 다음 도트 플롯을 만듭니다.
   FSC-A 대 SSC-A를 사용하여 파편 배제
   FSC-A 대 FSC-H를 선택하여 싱글릿을 선택합니다.
   FSC-A 대 Amcyan (생존율 염료)을 사용하여 살아있는 세포를 게이트합니다.
2. CD11b(FITC) 대 CD45(AF700)를 사용하여 미세아교세포를 CD11b⁺CD45⁺ 로 식별합니다.
   참고: 발달 단계(P3-P15), 염증 상황 및 효소 소화로 인해 TMEM119 및 P2RY12는 유세포 분석을 통해 다른 골수 집단에서 미세아교세포를 명확하게 분리하는 데 신뢰할 수 없었습니다. 따라서 이전에 출생 후 뇌에서 검증된 CD11b⁺CD45⁺ 게이팅 전략은 오염을 최소화하면서 미세아교세포 집단을 식별하는 데 사용되었습니다. 제어 조건에서 일반적인 수율은 P3에서 P15까지 전체 뇌당 30,000에서 200,000개의 미세아교세포 범위입니다. 특히 소뇌에 초점을 맞춘 실험의 경우 평균 수율은 뇌당 약 5,000개의 미세아교세포입니다.
3. FMO 컨트롤을 사용하여 활성화 마커에 대한 게이팅 임계값을 정의합니다.
4. 면역 관련 마커의 발현을 기반으로 미세아교세포 하위 집단을 식별합니다.
   CD80⁺ (슈퍼 브라이트 436)
   CD86⁺⁽ PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. 마커 발현의 조합으로 미세아교세포 하위 집합을 추가로 특성화합니다.
   CD206⁺ (APC) ^{다음 Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE) ^{다음 CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (슈퍼 브라이트 600)^{다음 CD206+} (APC)
   참고: 마커 조합은 미세아교세포 집단 내의 분자 이질성을 설명하는 데 사용됩니다. 이러한 하위 집합은 마커 발현만을 기반으로 보고되며 미세아교세포 가소성 및 상황 의존적 표현형을 인식하는 현재 표준에 따라 특정 기능적 역할이 할당되지 않습니다.
6. 실험 샘플을 로드합니다. FSC를 300으로, SSC를 200으로 설정합니다. 낮은 유속을 사용하고 원하는 수의 이벤트를 기록합니다.
7. 획득 후 세포분석기를 세척하고 데이터를 . 분석을 위한 FSC 파일.
8. 유세포 분석기 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.

9. 단일 세포 RNA 시퀀싱 샘플

1. 유세포 분석에 대해 설명된 것과 동일한 세포 분리 프로토콜(단계 1.14 참조)을 사용하여 해리된 세포를 FACS 완충액에 재현탁합니다. 세포 안정성을 유지하기 위해 수집 튜브 및 모든 후속 처리 단계에서 FACS 완충액을 사용하십시오.
2. 뇌 영역에서 모든 세포 유형을 포획하는 것이 목표인 경우 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행하지 마십시오. 그러나 실험에서 미세아교세포에 대한 농축이 필요한 경우 시퀀싱 전에 FACS 분류 단계를 포함하십시오.
3. 벤치탑에서 안정적인 형광 생존율 염료와 트리판 블루를 사용하여 세포 생존율을 즉시 평가합니다( 재료 표 참조). 혈구계를 사용하여 현미경으로 세포를 계산합니다( 재료 표 참조).
4. 단일 세포 RNA 시퀀싱을 진행하기 전에 세포 현탁액이 최소 90%의 생존율을 나타내는지 확인하고 약 1,000 cells/μL의 최종 농도로 조정하십시오.
5. 모든 샘플을 얼음 위에 보관하고 해리 직후 처리하여 세포 스트레스와 전사 변화를 최소화합니다.
6. 제조업체의 지침에 따라 쌍으로 샘플을 멀티플렉싱합니다.
   참고: 실험 비용을 줄이기 위해 동일한 실험 그룹의 남성 1명과 여성 1명을 통합했습니다.
7. scRNAseq 라이브러리를 준비하고( 재료 표 참조) 권장 제조업체 지침을 따르십시오.
   참고: 라이브러리 준비는 몬트리올 대학의 면역학 및 암 연구소(IRIC)의 유전체학 플랫폼에 의해 수행되었습니다.
8. 시퀀싱 시스템을 사용하여 scRNA-seq 라이브러리를 레인당 평균 3200M 리드 깊이로 시퀀싱합니다.
   참고: 시퀀싱은 몬트리올의 Genome Quebec에서 수행되었습니다.

10. 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석

1. Mouse GRCm39 2024-A 참조 게놈과 함께 10X Genomics의 Cell Ranger 소프트웨어(v8.0.0)를 사용하여 고유 분자 식별자(UMI) 수 분석을 수행합니다. 다운스트림 분석을 위해 Seurat R 패키지(v5.1)를 사용합니다.
2. 예를 들어 총 RNA의 30%를 초과하는 미토콘드리아 RNA를 가진 세포(그림 1A) 또는 잠재적인 스트레스가 있는 세포를 제거하기 위해 선택된 보다 엄격한 임계값을 포함하여 품질 관리를 수행합니다. log10GenesPerUMI가 0.75보다 크고(그림 1B), 고유 특징 수("nUMI")가 500 미만, 세포당 검출된 유전자 수("nGene")가 300보다 큰 저품질 세포를 필터링합니다(그림 1C). 다음으로 R의 "scDblFinder" 패키지로 물방울을 제거합니다. 임계값을 보여주는 nUMI와 nGene의 상관 플롯을 사용하면 이제 필터링 효과를 볼 수 있습니다(그림 1D).
3. Seurat의 SelectIntegrationFeatures 함수를 사용하여 샘플당 2,000개의 매우 가변적인 유전자를 식별하여 배치 효과를 완화합니다.
4. CCA(Canonical Correlation Analysis)를 사용하여 데이터 세트를 통합하고 차원 축소를 위해 주성분 분석(PCA)을 수행합니다. 50개의 주성분(PC)과 함께 RunPCA 함수를 사용하여 데이터를 확장하고 원치 않는 변동 원인(예: 미토콘드리아 함량)을 회귀시킵니다. 엘보우 플롯 및 JackStraw 분석을 기반으로 유지된 PC 수를 평가합니다.
5. Seurat RunUMAP 함수를 통해 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 알고리즘을 사용하여 클러스터를 시각화합니다. FindAllMarkers 함수를 사용하여 클러스터별 유전자 발현 프로파일을 식별합니다. 식별된 마커 유전자를 PanglaoDB 및 CellMarker와 같은 선별된 단일 세포 리소스와 상호 참조하여 전사 시그니처를 기반으로 클러스터에 주석을 달습니다(그림 2). 미세아교세포를 포함한 세포 유형은 사전 정의된 표면 마커가 아닌 이러한 전사체 프로파일에서 추론됩니다.

11. 성별 기반 세포 분리

1. 성별 특이적 유전자의 발현을 기반으로 남성 및 여성 세포를 식별합니다: 4개의 여성 특이적 유전자(Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) 및 3개의 남성 특이적 유전자(Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Seurat의 Subset 함수를 사용하여 이러한 유전자에 대해 정규화된 UMI 수를 1> 발현하는 세포를 필터링하여 남성 및 여성 집단을 분류합니다.
3. 남성 및 여성 셀을 별도로 하위 집합하여 Seurat 개체를 생성합니다. 다운스트림 비교를 위해 이러한 개체를 독립적으로 저장하고 분석합니다.
4. FeaturePlot 및 VlnPlot 함수를 사용하여 성별 특이적 유전자 발현을 시각화하여 분류를 검증하여 남성과 여성 세포 집단 간의 명확한 분리를 보장합니다.
   참고: 12.1 및 12.2단계는 샘플이 1명의 남성과 1명의 여성을 혼합하여 다중화된 경우에만 수행해야 합니다.

12. 통계적 모델 기반 미세아교세포 분류

1. 알려진 그룹 레이블이 있는 ~1,000개의 셀로 구성된 학습 집합을 사용하여 R에서 5개의 통계 모델(랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀, 순진한 베이즈, 지원 벡터 머신, 의사 결정 트리)을 빌드합니다.
2. 10배 교차 검증 및 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 사용하여 모델 성능을 평가합니다(그림 3). Seurat의 FindAllMarkers 함수를 사용하여 분류에 기여하는 주요 유전자를 식별합니다.
3. ROC 곡선 아래 면적(AUC)이 가장 높은 모델을 선택합니다. 랜덤 포레스트 모델은 우수한 AUC 점수를 기반으로 선택되었습니다.
4. RandomForest R 패키지의 predict 함수를 사용하여 선택한 모델을 분류되지 않은 셀에 적용합니다. 병합을 사용하여 예측된 분류를 Seurat에서 이전에 주석이 달린 데이터 세트와 병합합니다.
5. FeaturePlot 및 VlnPlot을 사용하여 마커 유전자 발현을 시각화하여 분류를 검증합니다. 예측된 세포 동일성의 일관성을 보장하기 위해 적절한 통계 테스트(예: 피셔의 정확 테스트)를 사용하여 분류된 세포를 추가하기 전과 후에 겹치는 마커 유전자 세트의 농축을 평가합니다.

13. 미세아교세포 차등 유전자 발현 분석

1. Seurat 함수 "FindMarkers"를 사용하여 관심 그룹의 두 특정 그룹 간에 차등 유전자 발현(DEG) 분석을 수행하며, ident.1 은 관심 그룹을 나타내고 ident.2 는 참조 그룹을 나타냅니다.
   참고: 출력에는 ident.1에 비해 ident.2에서 차등적으로 발현되는 유전자가 나열됩니다. 이러한 맥락에서 상향 조절된 유전자는 ident.1에 비해 ident.1에서 더 높은 발현을 보이는 유전자인 반면, 하향 조절된 유전자는 ident.1에서 더 낮은 발현을 나타냅니다. 이들의 비교는 화산 플롯을 생성하고 조건별 전사 변화를 해석하는 데 사용됩니다.
2. 조정된 P-값≤ 0.05로 차등적으로 발현된 유전자(DEG)를 식별합니다. 두 특정 그룹 간의 비교를 위해 다음 기준과 함께 FindAllMarkers 함수를 사용하십시오: 세포의 최소 10%에서 발현된 유전자(min.pct = 0.1) 및 0.25의 log2 배율 변화 임계값(logfc.threshold=0.25). 모든 미세아교세포에 대한 다중 그룹 비교의 경우 동일한 매개변수와 함께 FindAllMarkers 함수를 사용합니다. 조정된 P-값이 0.05≤ 유전자는 유의하게 차등적으로 발현되는 것으로 간주됩니다. DEG 발현 패턴을 시각화하려면 EnhancedVolcano 패키지의 내장 함수를 사용하여 화산 플롯을 생성합니다(그림 4).
3. 먼저 미세아교세포, 특히 Ptprc및Itgam 유전자에 해당하는 CD45⁺ 및 CD11b⁺를 찾는 데 사용되는 세포 분석 마커를 검사하여 유세포 분석 결과를 비교합니다. Seurat의 FeaturePlot 함수를 사용하여 유전자 발현을 확인합니다.
4. CD80및NOS2는 물론 Mrc1, Arg1, Fcgr1 및 CD163을 포함하여 서로 다른 미세아교세포 상태와 일반적으로 관련된 마커를 평가합니다. Seurat 함수 FeaturePlot 및 DotPlot을 사용하여 셀 클러스터 전체에서 표현을 시각화합니다.
5. Seurat의 DotPlot 함수를 사용하여 도트 플롯을 생성하여 마커 표현식을 요약하고 모집단 분류를 검증합니다.

Results

이 프로토콜은 유세포 분석을 효과적으로 활용하여 선택된 표면 및 세포내 마커의 발현을 기반으로 마우스 뇌 샘플에서 미세아교세포 집단을 특성화합니다. 다음 섹션에서는 워크플로의 주요 단계에서 얻은 결과를 자세히 설명하고 실험 조건에 대한 반응으로 미세아교세포 하위 집합의 분포와 이질성을 강조합니다.

보상 및 게이팅 전략 검증
보상 비드는 형광 신호를 보정하고 형광색소 간의 스펙트럼 중첩을 보정하는 데 사용되었습니다. 각 형광색소에 대한 양성 및 음성 모집단이 명확하게 분리되어 정확한 보상 매트릭스 생성이 가능했습니다. 게이팅 임계값은 특히 불량하거나 겹치는 마커의 경우 실제 신호와 배경을 구별하기 위해 패널 최적화 중에 FMO(Fluorescence Minus One) 제어를 사용하여 처음에 검증되었습니다. 이러한 임계값은 일관성을 보장하기 위해 동일한 염색 패널 및 세포 분석기 설정을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 재사용되었습니다. 특히 세포내 마커에 대한 잠재적인 비특이적 결합을 모니터링하기 위해 이소타입 대조군이 포함되었지만 게이팅 결정에는 사용되지 않았습니다.

미세아교세포 식별
살아있는/죽은(Amcyan) 세포 게이팅 전략은 죽은 세포를 성공적으로 배제했습니다. 게이팅 전략은 CD45(AF700) 및 CD11b(FITC) 발현을 기반으로 미세아교세포 집단을 효과적으로 분리했습니다. 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 매개변수는 도트 플롯 내에서 미세아교세포 집단을 중앙에 배치하도록 최적화되었습니다(FSC = 300, SSC = 200).

미세아교세포 표현형 분석
도트 플롯 분석을 통해 표면 및 세포 내 마커의 차등 발현을 기반으로 미세아교세포 하위 집단을 식별할 수 있었습니다. FlowJo 소프트웨어의 특정 게이팅 전략을 사용하여 CD80(Super Bright 436), CD86(PE) 및 iNOS(PE-eFluor 610)를 발현하는 미세아교세포의 하위 집합을 확인했습니다(그림 6A). 이중 게이팅은 또한 CD206(APC) 및 Arg1(PE-Cy7)을 발현하는 하위 집합을 정의하는 데 사용되었습니다(그림 6B 참조). 추가 집단은 CD86(PE) 및 CD64(PerCP-eFluor 710), CD163(Super Bright 600) 및 CD206(APC)의 공동 발현으로 특징지어졌습니다(그림 6C,D). 이러한 표현형 프로파일은 미세아교세포 집단 내에서 마커로 정의된 이질성을 반영하고 고정된 기능 상태를 추론하지 않고 전사학적으로 및 면역학적으로 구별되는 여러 하위 집합을 구별하는 이 프로토콜의 능력을 보여줍니다.

미세아교세포 단일 세포 분석
UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)를 사용하여 세포 이질성을 시각화하고 다른 뇌 세포 유형 중에서 미세아교세포 클러스터를 식별했습니다. 각 점은 단일 세포를 나타내며 클러스터는 전사 유사성에 따라 색상으로 구분됩니다(그림 2).

실험 조건에서 조절된 유전자를 식별하기 위해 미세아교세포 클러스터 내에서 차등 발현 분석을 수행했습니다. 조정된 P-값이 0.05≤ 유전자는 차등적으로 발현된 것으로 간주되었습니다.

미세아교세포의 이러한 차등적으로 발현된 유전자를 시각화하기 위해 화산 플롯이 생성되어 배수 변화가 높고 통계적 유의성을 모두 갖는 유전자를 강조했습니다(그림 4).

이러한 단일 세포 결과를 유세포 분석 데이터와 비교하기 위해 미세아교세포 마커 CD45 및 CD11b(Ptprc 및 Itgam) 의 발현을 조사했습니다. UMAP은 서로 다른 세포 집단 내에서 발현을 보여줍니다(그림 7).

마지막으로, 선택된 면역 관련 마커의 발현을 평가하여 미세아교세포 간의 전사 이질성을 특성화했습니다. 바이올린 플롯은 단일 세포 수준에서 CD80 및 NOS- 와 같은 유전자뿐만 아니라 Mrc1, Arg1, Fcgr1 및 CD163 의 발현을 표시합니다(그림 8). 이러한 마커 발현 패턴은 유세포 분석 기반 프로파일링과 비교할 수 있으며 실험 조건 전반에 걸쳐 미세아교세포 하위 집합의 분자 다양성을 강조합니다.

그림 1: 단일 세포 전사체 데이터의 품질 관리. (A) 세포 전체에 미토콘드리아 RNA 함량의 분포. 잠재적으로 스트레스를 받거나 죽어가는 세포를 제거하기 위해 미토콘드리아 RNA가 >30%인 세포를 제외했습니다. (B) log10GenesPerUM>I가 0.75인 세포를 필터링하여 일관된 유전자 대 UMI 비율을 보장하고 복잡성이 낮은 라이브러리의 노이즈를 줄였습니다. (C) 검출된 전사체(nUMI)가 500개 미만이거나 검출된 유전자(nGENE)가 300개 이상인 세포도 품질이 낮거나 여러 개의 세포를 제거하기 위해 제외되었습니다. (D) 필터링 임계값의 영향을 보여주는 NUMI 대 nGene의 상관 관계도. 검출된 이중항은 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 단일 세포 전사체의 UMAP 시각화. 두 개의 개별 동물로부터 얻은 전사체 프로파일을 기반으로 단일 세포의 분포를 보여주는 UMAP 플롯. 각 점은 클러스터 ID에 따라 색상으로 구분된 하나의 셀을 나타냅니다. 미세아교세포 클러스터는 다른 세포 집단 중에서 확인됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 교차 검증을 통해 평가된 랜덤 포레스트 분류기의 ROC 곡선. 유전자 발현 프로필을 기반으로 미세아교세포를 다른 뇌 세포 유형과 구별하는 데 사용되는 랜덤 포레스트 모델의 성능을 보여주는 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선. 이 모델은 알려진 라벨이 있는 ~1000개의 셀 세트에서 훈련되었고 10배 교차 검증을 사용하여 평가되었습니다. 테스트한 5가지 통계 모델(랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀, 나이브 베이즈, 지원 벡터 머신, 의사결정 트리) 중에서 랜덤 포레스트 모델이 가장 높은 분류 성능을 달성했습니다. 곡선 아래 면적(AUC)은 모델의 정확도를 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 미세아교세포의 차등 유전자 발현 분석. 두 실험군(대조군 대 소뇌 손상) 사이의 미세아교세포에서 차등적으로 발현되는 유전자에 대한 조정된 P-값에 대한 log2 배수 변화 대 조정된 P-값을 나타내는 화산 플롯. 상향 조절된 유전자는 관심 그룹(ident.1)에서 더 높게 발현되며, 하향 조절된 유전자는 참조 그룹에 비해 발현이 감소한 것으로 나타났습니다(ident.2). 유의하게 차등적으로 발현되는 주요 유전자가 라벨링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 유세포 분석법에 의한 미세아교세포 식별을 위한 게이팅 전략. (A) 대조군 출생 후 3일(P3) 마우스의 소뇌 세포에 적용된 게이팅 전략. (B) 이중항을 제외하기 위해 일중항을 선택했습니다. (C) 생존 가능한 세포는 생존 염료를 사용하여 확인되었습니다. FSC-A가 낮은 이벤트는 파편을 제거하고 온전한 세포의 분석을 보장하기 위해 제외되었습니다. (D) 미세아교세포는 두 가지 뚜렷한 집단을 가진 CD45⁺ 및 CD11b⁺로 확인되었습니다: 정지 미세아교세포에 대한 CD45 low-CD11b^int 및 활성화된 미세아교세포에 대한 CD45^int -CD11b^high. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 유세포 분석법에 의한 미세아교세포 마커 발현 프로파일의 특성화. (A) CD80, CD86 및 iNOS 발현에 기반한 CD45⁺ CD11b⁺ 세포의 순차적 게이팅. (B) CD206을 발현하는 하위 집합의 식별, 이어서 Arg1 발현에 기초한 게이팅. (C) CD86을 발현하는 하위 집합의 식별, 이어서 CD64 발현에 기초한 게이팅. (D) CD163을 발현하는 하위 집합의 식별, 이어서 CD206 발현에 기초한 게이팅. 이러한 게이팅 전략은 표면 및 세포내 마커 발현을 기반으로 하는 미세아교세포 집단의 표현형 이질성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터에서 Itgam 및 Ptprc 발현을 사용한 미세아교세포 동일성 확인. UMAP은 P15에서 소뇌 세포의 전사 환경을 표시하며, Itgam 및 Ptprc 의 유전자 발현은 클러스터 전체에 걸쳐 중첩됩니다. 이러한 표준 골수성 마커의 공동 발현은 미세아교세포 집단의 식별을 지원하고 유세포 분석에 사용되는 마커와 일치하여 전사체 분석과 단백질 수준 분석 간의 교차 검증을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 단일 세포 RNA 시퀀싱으로 확인된 미세아교세포에서 선택된 면역 관련 유전자의 발현 프로파일. 바이올린 플롯은 개별 미세아교세포에 걸쳐 CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 및 CD163 에 대한 유전자 발현 분포를 표시합니다. 이러한 마커는 일반적으로 면역 관련 과정과 연관되어 있으며 미세아교세포 집단 내에서 관찰되는 전사 이질성을 보여줍니다. 데이터는 대조군 및 소뇌 뇌 손상(CBI) 상태 모두에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 신경 세포 분리 및 염색에 사용되는 용액의 구성. 이 표는 각각의 농도와 성분을 포함하여 세포 분리 및 염색에 필요한 용액의 자세한 구성을 제공합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 세포외 염색을 위한 항체 혼합물 농도. 이 표는 세포외 염색에 사용되는 항체 및 생/사형 용액의 농도를 자세히 설명하며, 한 샘플에 대한 염색 혼합물의 각 항체에 필요한 부피와 희석액을 지정합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 세포내 염색을 위한 항체 혼합 농도. 이 표는 세포 내 염색에 사용되는 항체의 농도를 자세히 설명하고 한 샘플에 대한 염색 믹스의 각 항체에 필요한 부피와 희석액을 지정합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구는 출생 후 초기 뇌 발달 동안 미세아교세포의 분리 및 특성화를 위해 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 결합한 상세하고 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 유세포 분석법은 여전히 비용 효율적이고 접근 가능한 기술이지만, 단일 세포 전사체학과의 통합은 단백질 수준 마커 발현과 유전자 수준 전사 프로필을 연결하여 보완적인 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 효율적인 해리, 파편 및 미엘린 제거, 최적화된 면역염색 전략을 포함하여 미성숙 뇌 조직과 관련된 기술적 과제를 해결하여 주요 발달 시점에 걸쳐 미세아교세포 집단 분석에서 재현성과 신뢰성을 보장합니다.

유세포 분석을 사용하여 선택된 표면 및 세포내 마커의 발현을 기반으로 미세아교세포 하위 집합을 식별했습니다. 기능적 상태를 추론하는 대신, 하위 집합은 CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ 와 같은 마커 발현 프로파일에 의해 구별되었습니다. CD206⁺/인수1⁺ ; CD86⁺/CD64⁺ 또는 CD163⁺/CD206⁺ 표현형. 이러한 마커 정의 집단은 미세아교세포 구획 내의 분자 이질성을 반영하고 고처리량 특성화를 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다. 이러한 표면 마커 기반 분류는 미세아교세포 다양성의 전체 복잡성을 포착하지 못할 수 있지만, 특히 고차원 분자 도구를 사용할 수 없는 상황에서는 여전히 유익합니다. M1/M2 패러다임과 같은 이진 분류는 최근 문헌¹²에 설명된 바와 같이 미세아교세포 표현형의 스펙트럼과 유사한 맥락 의존적 특성을 인식하여 의도적으로 피되었습니다.

이러한 관찰은 정상적인 뇌 성숙과 환경 또는 병리학적 자극에 대한 반응 모두에서 미세아교세포의 역할을 강조하는 이전 연구와 일치합니다^13,14. 미세아교세포 이질성을 구별하는 능력은 미세아교세포 분극화가 신경 발달 장애에 어떻게 기여할 수 있는지에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다^15,16.

단일 세포 RNA 시퀀싱은 더 높은 분해능을 제공하고 전사적으로 구별되는 미세아교세포 하위 집단을 식별할 수 있지만 비용과 분석의 복잡성으로 인해 접근성이 제한됩니다. 주산기 손상 후 출생 후 15일째에 수집된 현재 데이터 세트에서 염증 반응의 피크가 대부분 해결되어 활성화된 미세아교세포의 수가 적습니다. 결과적으로 UMAP과 같은 차원 축소 기술은 잘 분리된 미세아교세포 하위 클러스터를 복구하지 못했으며 클러스터 수준 전사 분석은 이 프로토콜 원고에 포함되지 않았습니다.

이 프로토콜의 중요한 혁신은 출생 후 초기 단계(P3 내지 P30) 동안 소뇌에서 미세아교세포를 분리하고 특성화하기 위한 최적화입니다. 이 지역과 연령별 상황은 낮은 세포 수율, 미엘린 함량 및 조직 취약성 증가를 포함하여 뚜렷한 문제를 제시합니다. 이러한 제약을 해결하기 위해 프로토콜은 적응된 해리 워크플로, 효율적인 파편 및 수초 제거, 소량 소뇌 조직에 적합한 신중하게 조정된 면역염색 조건을 통합합니다. 소뇌 미세아교세포가 기능적으로나 전사적으로 다른 뇌 영역의 미세아교세포와 구별되는 것으로 인식이 증가하고 있음에도 불구하고 분리 및 분석을 위한 자세한 프로토콜은 여전히 제한적입니다. 현재 방법은 특히 소뇌 미세아교세포의 발달 연구에 맞춰진 안정적이고 접근 가능한 워크플로를 제공합니다.

이 원고의 주요 목적은 특정 생물학적 발견을 보고하기보다는 재현 가능하고 적응 가능한 방법론적 틀을 제공하는 것입니다. 이 워크플로는 전사적으로 뚜렷한 미세아교세포 상태가 더 두드러질 수 있는 다른 발달 단계 또는 실험 모델에 적응하는 데 적합합니다. 이러한 맥락에서 유세포 분석은 특히 보완 분석과 통합될 때 귀중한 도구로 남아 있습니다.

이 프로토콜의 주요 강점 중 하나는 출생 후 3일(P3)부터 출생 후 30일(P30)에 이르는 다양한 발달 단계에 걸친 적응성입니다. 이를 통해 뇌 성숙이 진행됨에 따라 미세아교세포 표현형을 종단적으로 분석할 수 있습니다. 유세포 분석법과 scRNA-seq를 병용하면 표면 마커뿐만 아니라 세포내 신호 전달 경로와 미세아교세포에 관여하는 전사 인자도 연구할 수 있습니다.

그럼에도 불구하고, 효소 소화는 일부 표면 마커의 발현에 영향을 미칠 수 있으므로 특정 실험 목표^17,18을 위해 소화 조건의 신중한 최적화가 필요합니다. 또한 유세포 분석이나 단일 세포 시퀀싱은 집단 수준 데이터를 제공하지 않으므로 기본 환경 내에서 미세아교세포 상호 작용의 공간적, 기능적 뉘앙스를 완전히 포착하지 못할 수 있습니다. 단일 세포 공간 기술을 통합하면 미세아교세포의 공간적 맥락을 보존하여 이러한 한계를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 면역조직화학, 생체 내 이미징, 웨스턴 블롯 또는 단일 세포 공간 전사체학과 같은 이미징 기술과 결합하는 향후 연구는 미세아교세포 역학에 대한 보완적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 염증, 저산소증 또는 환경적 스트레스 요인과 같은 초기 생애 손상이 미세아교세포 표현형에 어떻게 영향을 미치고 장기적인 신경 발달 결과에 기여하는지 조사할 수 있는 새로운 길을 열어줍니다. 미세아교세포 활성화 상태의 정확하고 신뢰할 수 있는 특성화를 가능하게 함으로써 신경 발달 장애를 예방하거나 완화하는 것을 목표로 초기 생애 시 미세아교세포 반응을 조절하는 치료 표적 식별을 용이하게 합니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 초기 뇌 발달 동안 미세아교세포 다양성을 연구하기 위한 강력하고 접근 가능한 프레임워크를 제공합니다. 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱의 조합은 다양한 발달 단계와 실험 모델에 걸쳐 유연한 적용을 가능하게 하여 생리학적 및 병리학적 맥락 모두에서 미세아교세포 생물학에 대한 심층적인 탐구를 촉진합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 & 마이크로; M 금속 메쉬 필터 	시그마-알드리치	S3895
15mL 튜브	사르슈테트	62.554.205
5mL 튜브	사르슈테트	55.526.006
원추형 바닥이 있는 96웰 플레이트 	사르슈테트	82.1583.001
아르기나제 1 - 접합체 Pecy7 - 클론 : A1exF5	써모 피셔 사이언티픽	25-3697-82
탁상용 형광 시약	인비트로젠	A49905
CD11b - Conjugate Fitc - 클론 : M1/70	BD 파밍겐	553310
CD163 - 접합체 SB600 - 클론 : TNKUPJ	써모 피셔 사이언티픽	63-1631-82
CD206 - Conjugate APC - 클론 : C068C2	바이오레전드	141708
CD45 - 접합체 A700 - 클론 : 30-F11	BD 파밍겐	560510
CD64 - 접합체  PerCP-eF710 - 클론 : X54-5/7.1	써모 피셔 사이언티픽	46-0641-82
CD80 - 접합체 SB436 - 클론 : 16-10A1	써모 피셔 사이언티픽	62-0801-82
CD86 - Conjugate Pe - 클론 : GL-1	바이오레전드	105008
콜라게나제 D	시그마– 알드리치	11088866001
DNase I	시그마– 알드리치	10104159001
소 태아 혈청(FBS)	시그마– 알드리치	F1051
HBSS(행크의 균형 소금 용액) 10x	Wisent 바이오 프로덕츠	311506CL
혈구계	VWR 인터내셔널	82030-470
헴스	Wisent 바이오 프로덕츠	330.050.EL
iNOS - 접합체 PE- eF610 - 클론 : CXNFT	써모 피셔 사이언티픽	61-5920-82
케이클	써모 피셔 사이언티픽	BP366-500
KH2PO4	써모 피셔 사이언티픽	BP362-500
살아있는/죽은 암시안	써모 피셔 사이언티픽	L34957
미세아교세포 배양 배지	라이프 테크놀로지	A12475-01
Na2HPO4	써모 피셔 사이언티픽	BP332-500
나크롬	써모 피셔 사이언티픽	BP358-212
파라포름알데히드	시그마– 알드리치	P6148
쥐 항마우스 CD16/CD32	BD 바이오사이언스	553142
사포닌	시그마– 알드리치	S7900
scRNAseq 라이브러리	10X 유전체학	1000121
실리카 기반 콜로이드 매체	써모 피셔 사이언티픽	45001747
아지드화나트륨	써모 피셔 사이언티픽	BP922I-500 시리즈
트리판 블루	깁코	1525006