방법 논문

ELISA(Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 사용한 고형 조직의 cGMP(Cyclic Guanosine Monophosphate) 측정

DOI:

10.3791/68432

⸱

2025년 7월 3일

 ,  ,  , 
1Molecular Biology and Genetics Section, Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 경쟁력 있는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 고형 조직의 고리형 구아노신 일인산염(cGMP) 농도를 측정합니다. 이 프로토콜은 고형 조직을 처리하고, 경쟁력 있는 ELISA를 수행하고, 흡광도를 밀리리터당 피코몰 단위의 cGMP 농도로 변환하고, 최종 농도를 조직 그램당 cGMP 나노몰로 계산하는 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고리형 구아노신 일인산염(cGMP)을 생성하는 주요 경로는 산화질소(NO)-cGMP 경로입니다. 이 경로에서 NO는 구아노신 삼인산을 cGMP로 전환하는 용해성 구아닐릴 시클라아제(sGC)의 촉매 활성을 자극합니다. NO는 포유류의 경우 주요 혈관 확장제, 혈소판 응집 억제제, 면역 기능 매개체, 신경 전달 물질로 작용하고 다른 생리적 역할 중에서도 신체 활동 중 지구력을 향상시키기 때문에 관심이 있습니다. 다른 조직에서 NO의 풍부함을 측정하면 그 기능을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 NO는 반감기가 몇 초 미만이기 때문에 직접 측정할 수 없습니다. 일반적으로 NO의 대사 산물인 질산염과 아질산염은 NO의 풍부도를 추정하기 위해 측정됩니다. 이는 이러한 분자가 산화 환원 반응을 통해 생체 내에서 상호 전환될 수 있기 때문입니다. NO의 존재량을 추정하는 덜 일반적인 방법은 NO의 다운스트림에 있는 신호 분자인 cGMP의 농도를 측정하는 것입니다. 그러나 조직에서 cGMP를 측정하는 것은 장기에서 NO의 기능을 더 잘 이해할 수 있는 가능성을 창출했음에도 불구하고 거의 수행되지 않았습니다. 따라서 고형 장기 및 조직에서 cGMP 농도를 측정하기 위한 프로토콜이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 수집된 돼지 조직을 균질화하고, 처리된 샘플에 대해 경쟁적 ELISA를 수행하고, 흡광도를 원래 조직 1g당 cGMP 나노몰로 변환했습니다. 요컨대, 이 프로토콜은 순환 GMP ELISA 키트를 사용하여 고형 조직의 cGMP 농도를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고리형 구아노신 일인산염(cGMP)은 산화질소(NO)-cGMP 경로를 통해 생리적 변화를 유도할 수 있는 신호 분자입니다. NO-cGMP 경로에서 NO는 구아노신 삼인산을 cGMP로 변환하는 세포질 효소인 수용성 구아닐릴 시클라아제에 결합하여 촉매 활성을 증가시킵니다 1,2. 이후 cGMP 농도가 증가하면 혈관 확장을 촉진하는 신호 전달 경로3가 활성화되어 혈압 4,5 가 감소하는데, 이는 생체 내 NO의 존재에 대한 주요 생리적 반응 특성입니다. 또한, NO는면역 기능에 영향을 미치고6, 신체 활동 중 지구력을 향상시키며4, 혈소판 응집을 억제하여 혈액 응고를 예방하는 것으로 알려져 있습니다7.

NO를 직접 측정하는 것은 대부분의 생물학적 조직에서 in vivo8 반감기가 몇 초 미만이기 때문에 어렵습니다. 결과적으로, NO의 생리학적 효과를 규명하기 위해서는 생체 외에서 NO의 풍부함을 측정하는 방법이 필요합니다. 따라서 사용 가능한 정량적 방법은 NO의 직접 측정을 피합니다. 조직에서 NO 농도를 추정하는 일반적인 방법은 NO의 보다 안정적인 대사 산물인 아질산염 및 질산염 4,5,9,10,11을 측정하는 것입니다. NO의 풍부도를 측정하기 위해 아질산염과 질산염 농도를 사용하는 주요 합병증은 두 대사 산물이 각각 NO 전구체와 저장 분자 역할도 한다는 것입니다. NO의 대사 산물, 특히 질산염은 특정 식품에 풍부합니다. 따라서, cGMP 농도의 변화, NO의 다운스트림인 cGMP는 활성 NO의 양을 추정하는 데 유용하며, NO의 풍부도는 이전에 존재하는 아질산염과 질산염의 간섭 없이 결정될 수 있습니다.

이전 연구는 혈장12 및 혈소판13에서 cGMP 농도를 측정하는 데 의존했지만, 고형 조직의 cGMP 농도 측정은 덜 일반적입니다. 고형 조직에서 cGMP 농도를 측정할 수 있는 능력은 특정 기관에서 NO의 활성을 특성화할 수 있습니다. 목표는 경쟁력 있는 ELISA를 사용하여 고형 조직에서 cGMP를 측정하는 간단한 방법을 식별하는 것이었습니다. 경쟁력 있는 ELISA를 사용하는 한 가지 이점은 다른 용도로 자주 사용되는 마이크로플레이트 리더와 같이 NO에 관심이 있는 대부분의 실험실에서 일반적으로 볼 수 있는 장비가 필요하다는 것입니다. 이에 비해, 일부 다른 측정 방법은 현미경(14,15), 섬광 계수기(16) 또는 레이저(17)와 같이 NO에 초점을 맞춘 실험 중에 자주 사용되지 않는 장비를 필요로 한다. 접근성 외에도 경쟁력 있는 ELISA로 cGMP를 측정하는 것은 민감합니다. cGMP 농도는 cGMP/mL18의 0.1피코몰(pmol)까지 검출할 수 있습니다. cGMP ELISA 키트(Table of Materials) 프로토콜18을 약간 수정하여 경쟁력 있는 ELISA를 사용하여 고형 조직에서 cGMP를 측정하는 방법이 확립되었습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 절차는 NIDDK 동물 관리 및 사용 위원회(ASP K049-MMB-23)에서 승인한 분자 의학 분과 동물 연구 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 조직 채취는 MedStar Health Research Institute의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 정한 지침을 따랐습니다(프로토콜 번호: 2006001373 2020-017). 생후 3개월이고 체중이 30-35kg 사이인 젊은 성인 요크셔 교배돼지(수컷 2마리와 암컷 2마리)가 연구에 사용되었습니다. 그림 1 은 cGMP ELISA 키트 프로토콜의 단계를 보여주는 회로도를 보여줍니다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1: 프로토콜 회로도. cGMP ELISA 키트 프로토콜의 단계를 보여주는 개략도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 조직 샘플 준비

참고: 조직은 채취 전에 헤파린 나트륨 용액으로 관류한 다음 사용하기 전에 -80°C에서 보관했습니다. 조직 샘플 수집에 대한 자세한 내용은 Park et al.19 를 참조하십시오.

  1. 조직 시료 처리
    1. 시술을 시작하기 전에 티슈 분쇄기, 핀셋, 숟가락으로 드라이아이스에 10분 동안 식히십시오.
    2. 일부는 분쇄 중에 손실될 수 있으므로 과도한 조직의 무게를 측정하십시오(수율 약 90%).
      참고: 이전에는 170mg을 초과하여 섭취하면 성공적인 결과를 얻을 수 있었습니다. 원하는 경우 질량을 늘리거나 줄일 수 있습니다. 조직 질량이 조직 샘플 아세틸화 및 조직 샘플 희석 단계를 위한 충분한 샘플 부피를 생성하는지 확인합니다.
    3. 드라이 아이스의 분쇄기에 조직을 추가합니다.
    4. 조직을 액체 질소로 급속 동결하고 액체 질소가 완전히 기화되도록 합니다.
    5. 분쇄기 뚜껑을 교체하고 망치로 15회 두드립니다.
      참고: 분쇄기 설정을 사용할 수 없거나 사용할 수 없는 경우 샘플을 냉동 보관하거나 최소한 얼음 위에 냉장 보관한 상태에서 가위나 메스를 사용하여 가능한 한 작은 조각으로 절단해야 합니다. 이 단계는 우수한 균질화를 보장하며 특히 더 단단한 조직의 경우 매우 중요합니다.
    6. 비드 균질화 튜브의 용기를 측정하고 냉각된 스푼과 핀셋을 사용하여 분쇄된 조직을 튜브로 옮깁니다.
    7. bead homogenizer tube에 추가된 조직의 질량을 기록하여 나중에 농도를 몰농도에서 질량당 몰로 변환합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
    8. 균질화 튜브에 조직 질량(밀리그램)의 배수와 동일한 0.1N 염산의 마이크로리터 부피를 추가합니다.
      참고: 적절한 희석으로 측정된 샘플이 표준 곡선에 속하게 됩니다. 이러한 희석은 시행착오를 통해 다양한 조직 유형에 대해 발견됩니다. 이전 실험에서는 골격근 조직에 대한 1:10 희석 비율과 간 조직에 대한 1:5 희석 비율이 성공적인 결과를 산출했습니다. 참고로, 조직 100mg을 희석하는 경우 1:10 희석 비율에는 1,000μL의 0.1N 염산이 필요하고 1:5 희석 비율에는 500μL가 필요합니다.
    9. bead mill homogenizer 또는 이와 유사한 기술을 사용하여 조직 샘플을 균질화합니다.
      알림: 때때로 s를 식히십시오.amp얼음을 사용하여 균질화하는 동안 le. 비드 밀 균질화기를 사용할 수 없는 경우, 회전식 균질화기 또는 초음파 균질화기의 사용을 포함하여 세포를 효과적으로 파괴하고 조직 균질화를 생성하는 다른 균질화 방법을 대체할 수 있습니다.
    10. 원심분리기는 4°C의 시료 온도를 유지하면서 17,000 x g 의 속도로 30분 동안 균질화합니다.
      참고: 불충분하게 희석된 골격근 조직 균질화는 지나치게 점성이 있고 젤 모양이 됩니다. 이것은 원심분리 후에 가장 잘 볼 수 있습니다.
    11. 상층액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C의 온도를 유지하면서 17,000 x g 에서 10분 동안 상층액을 원심분리합니다.
    12. 상층액 분취액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 샘플을 얼음 위에 보관합니다.
      참고: 250μL의 상등액을 아세틸화하여 성공적인 결과를 얻었습니다. 프로토콜을 일시 중지하려면 이러한 샘플을 -80°C에서 동결하고 최대 48시간 동안 보관하십시오. 아세틸화 공정을 위한 상등액의 부피는 아세틸화 당일에 측정하는 것이 좋습니다.

2. 표준 준비

참고: ELISA 마이크로플레이트 준비 당일에 표준물질을 준비합니다.

  1. ELISA 완충액 준비
    1. 해동된 10x ELISA 완충액 농축액을 초순수 90mL가 담긴 유리병에 넣습니다.
      알림: 준비된 ELISA 버퍼로 잔여 10x ELISA 버퍼 농축액을 헹구고 버퍼를 유리병에 다시 넣도록 주의하십시오. 4°C에서 최대 2개월까지 보관하십시오.
  2. 표준 재고 준비
    1. 표준 바이알에 ELISA 완충액 1mL를 넣고 흔들어 녹입니다.
      참고: 4°C에서 최대 6주 동안 보관하십시오.
  3. 표준 연속 희석
    1. 튜브 표준 B와 9개의 튜브 표준 0에서 표준 8까지 레이블을 지정합니다.
    2. standard B라고 표시된 튜브에 9.9mL의 ELISA 완충액을 추가합니다.
    3. 100 μL의 표준 스톡(300 pmol/mL의 cGMP)을 표준 B 튜브로 옮기고 완전히 와류시킵니다.
    4. 표준 B 튜브에 있는 용액 1,000μL를 표준 튜브 1개로 옮깁니다.
    5. standard 0으로 표시된 튜브와 standard 2 - standard 8로 표시된 튜브에 500μL의 ELISA 버퍼를 추가합니다.
    6. Vortex standard 1을 사용한 다음 standard 1에서 standard 2로 500μL의 용액을 전송합니다.
    7. Vortex standard 2를 사용한 다음 standard 2에서 standard 3으로 500μL의 용액을 전송합니다.
    8. 500 μL를 표준물질 n-1에서 표준물질 n으로 계속 전환하고, 각 첨가 후에 표준물질을 철저히 와류로 전환하십시오.
    9. 표준물질 8에서 500μL의 용액을 폐기합니다.
      참고: 최적의 표준 곡선을 위해 지정된 곳에서 표준을 와류로 처리해야 합니다. 표준물질 0 - 8은 500 μL의 부피입니다. 사용할 때까지 표준물질을 4°C에서 보관하십시오. 희석 당일에 표준을 사용하십시오.

3. 아세틸화

참고: 아세틸화 반응 중에 cGMP 분자의 2' 수산기에 아세틸기가 추가되어 cGMP의 구조를 수정하고 항체의 결합 친화도를 증가시켜 분석 감도를 ~10배 향상시킵니다. 1.0 pmol/mL 이상의 cGMP를 함유한 샘플에서는 아세틸화 없이 측정할 수 있으며 이 단계를 생략할 수 있습니다. 아세틸화의 필요성은 사례별로 실험적으로 결정되어야 합니다.

  1. 수산화칼륨 제제
    1. 수산화칼륨 병에 초순수 10mL를 추가하여 4M 용액을 만듭니다.
      알림: 수산화칼륨이 녹을 때 병을 뚜껑을 닫지 마십시오. 실온에서 몇 달 동안 보관하십시오.
  2. 조직 시료 아세틸화
    1. 샘플의 250μL 분취액에 4M 수산화칼륨 50μL(5:1)를 첨가하고 무수아세트산 12.5μL(20:1)를 빠르게 첨가합니다.
    2. 15초 동안 소용돌이.
    3. 12.5μL의 4M 수산화칼륨을 샘플에 추가하고 간단히 와류를 일으킵니다.
    4. 선택 사항: 골격근 샘플이 아세틸화 단계에 따라 응고되면 17,000 x g 에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.
  3. 표준물질의 아세틸화
    1. 표준 0으로 표시된 튜브에 100μL의 4M 수산화칼륨을 첨가한 다음 바로 25μL의 무수아세트산을 첨가합니다.
    2. 소용돌이는 15 s를 위한 기준입니다.
    3. 25μL의 4M 수산화칼륨을 표준물질에 첨가하고 간단히 와류를 유발합니다.
    4. 번호가 매겨진 나머지 표준에 대해 이 단계를 반복합니다.
      참고: 일관된 결과를 보장하기 위해 동일한 기간 동안 모든 샘플과 표준물질을 소용돌이치십시오.

4. 조직 샘플 희석

  1. 미리 결정된 비율의 ELISA 완충액과 아세틸화된 시료의 분취액을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
    참고: 각 샘플에 대해 두 가지 다른 희석이 필요합니다. 측정된 cGMP 농도가 표준 곡선에 떨어지게 하는 희석 비율은 시행착오를 통해 발견됩니다. 희 figure-protocol-2 석률이 20%에서 80% 사이로 떨어지기 위해서는 각 유형의 조직에 대해 희석을 실험적으로 결정해야 합니다. 간 조직을 측정하는 이전 실험에서는 1:2 및 1:3의 희석 비율로 적절한 퍼센트 figure-protocol-3 값을 가진 성공적인 결과를 얻을 수 있었습니다. 이러한 비율은 골격근에도 성공적인 결과를 가져왔습니다. 그러나 골격근 조직의 변화로 인해 더 많은 희석된 샘플이 필요할 수 있습니다.
  2. 선택 사항: 조직 샘플을 ELISA 버퍼에 추가할 때 침전물이 형성되면 17,000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.

5. ELISA 마이크로플레이트 준비

  1. 아세틸콜린에스테라제(AChE) 추적자 준비
    1. AChE 트레이서 바이알에 ELISA 완충액 6mL를 넣고 부드럽게 흔들어 녹입니다.
      알림: 샘플을 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오. 소용돌이치지 마십시오.
  2. 안티세럼 제제
    1. ELISA 완충액 6mL를 안티세럼 바이알에 넣고 부드럽게 흔들어 녹입니다.
      알림: 최소 4주 동안 4°C에서 보관하십시오. 소용돌이치지 마십시오.
  3. 시료 및 표준 배양
    1. 와류 표준 0.
    2. ELISA 마이크로플레이트에 표준 0 - 5웰(NSB 및 B0; 그림 2).
    3. 두 개의 우물(NSB; 그림 2) 표준물질 0을 함유하고 50μL의 ELISA 완충액을 추가합니다.
    4. 하나의 피펫 팁을 사용하여 표준물질 1 - 8의 분취량 50μL를 ELISA 마이크로플레이트에 복제하여 추가합니다. 가장 희석된 표준물질(표준 8)부터 시작하여 모든 표준물질이 추가될 때까지 다음으로 가장 희석된 표준물질로 진행합니다.
      참고: 웰에 추가하기 전에 각 표준물질을 여러 번 흡입하고 분주합니다. 와류 표준물질을 우물에 추가하기 전에.
    5. 웰에 50μL 분취량을 추가하기 전에 각 샘플을 중복 또는 삼중으로 와류시킵니다.
    6. 각 NSB, B0, 표준물질 및 샘플 웰에 50μL의 AChE 트레이서를 추가합니다(그림 2).
    7. 각B0, 표준물질 및 샘플 웰에 50μL의 항혈청을 추가합니다(그림 2).
    8. ELISA 마이크로플레이트를 덮고 4°C에서 18시간 동안 배양합니다.
      알림: 일관된 결과를 생성하도록 지시할 때마다 소용돌이를 일으키십시오.
  4. 세척 완충액 준비
    1. 유리병에 초순수 200mL와 400x 세척 완충액 농축액 500μL를 추가합니다.
    2. 주사기를 사용하여 유리병에 폴리소르베이트 20 100μL를 첨가합니다.
    3. 병을 부드럽게 흔들어 섞습니다.
      알림: 세탁 버퍼는 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오. 초순수 부피를 두 배로 늘리고, 400x 세척 완충액 농축액 및 폴리소르베이트 20을 사용하여 전체 96웰 마이크로플레이트의 시료를 만들 수 있습니다.
    4. 사용하기 전에 세척 버퍼를 세척 병에 옮기십시오.
  5. Ellman의 시약 준비
    참고: ELISA 마이크로플레이트 개발일을 준비합니다.
    1. 빛 보호 용기에 초순수 20mL를 추가합니다.
    2. 초순수의 분취액을 사용하여 Ellman의 시약을 용해시킵니다.
    3. Ellman의 시약을 빛으로 보호된 용기로 옮깁니다.
    4. Ellman의 시약을 사용하여 그것이 들어있던 병을 헹굽니다.
    5. 피펫을 사용하여 모든 용액을 빛 보호 용기에 다시 옮깁니다.
  6. ELISA 마이크로플레이트 워시
    1. ELISA 마이크로플레이트의 내용물을 뒤집어서 폐기하십시오. 종이 타월에 거꾸로 된 ELISA 마이크로플레이트를 두드려 웰이 비워졌는지 확인합니다.
    2. 세척 병을 사용하여 세척 버퍼로 우물을 채웁니다.
    3. ELISA 마이크로플레이트를 5초 동안 부드럽게 저어준 다음 세척 버퍼를 버리고 종이 타월에 남아 있는 액체를 두드립니다.
    4. ELISA 마이크로플레이트에 세척액을 채우고 ELISA 마이크로플레이트를 30초 동안 부드럽게 교반한 다음 내용물을 버립니다. 이 작업을 네 번 반복하여 각 덤프 후에 종이 타월에 ELISA 마이크로플레이트를 두드려 남아 있는 액체를 제거합니다.
      알림: ELISA 마이크로플레이트를 철저히 세척하여 부정확한 흡광도 판독값을 방지하십시오.
  7. ELISA 마이크로플레이트 개발 및 판독
    1. Ellman의 시약을 저장소로 옮깁니다.
    2. 신속하게 작업하기 위해 멀티채널 피펫을 사용하여 200 μL의 Ellman 시약을 블랭크, NSB, B0, TA, 표준물질 및 샘플 웰로 분주합니다.
    3. TA 웰에 5μL의 AChE 트레이서를 추가합니다.
    4. ELISA 마이크로플레이트를 파라필름으로 덮고 빛 방지 용기에 넣은 다음 교반하면서 실온에서 60-90분 동안 배양합니다.
      알림: B0 웰을 적절한 배양 시간의 지표로 사용합니다. 이상적인 B0 웰은 눈에 띄게 노란색으로 보이지만 어둡지는 않습니다.
    5. 파라핀 필름을 제거하고 412nm의 광학 밀도에서 ELISA 마이크로플레이트를 판독합니다.
      참고: 흡광도가 0.3AU에서 1.0AU 사이인 B0 웰에서 블랭크를 뺀 것은 ELISA 마이크로플레이트가 적절하게 개발되었음을 나타냅니다.
    6. 선택적: ELISA 마이크로플레이트가 충분히 개발되지 않은 경우 파라핀 필름을 교체하고 추가 기간 동안 빛 보호 용기에서 배양합니다. ELISA 마이크로플레이트가 과도하게 개발된 경우 Ellman의 시약을 버리고 세척 버퍼로 한 번 헹구고 Ellman의 시약으로 ELISA 마이크로플레이트를 다시 현상합니다.

figure-protocol-4
그림 2: 마이크로플레이트 레이아웃. 경쟁사 ELISA를 위한 마이크로플레이트 레이아웃의 예. NSB는 비특이적 결합 웰을 나타냅니다. B0 는 최대 결합 웰을 나타냅니다. TA는 전체 활동을 잘 나타냅니다. Std. 해당 번호와 함께 표준 우물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 집중으로의 전환

  1. 바운드 AChE 트레이서 계산
    1. 두 블랭크의 흡광도를 평균하고 모든 우물의 흡광도에서 평균을 뺍니다.
      참고: 나머지 계산에는 공백에서 뺀 흡광도를 사용합니다.
    2. NSB, B0 및 블랭크 웰의 평균 흡광도를 계산합니다.
    3. 다음 방정식을 사용하여 수정된 B0 흡광도를 계산합니다.
      figure-protocol-5
      참고: Corr.는 corrected, Abs.는 흡광도, Avg.는 평균을 나타냅니다. 블랭크 웰의 평균 흡광도(블랭크 평균을 뺀 값)가 음수인 경우 계산에 0을 사용합니다.
    4. 다음 방정식을 figure-protocol-6 사용하여 각 표준물질 및 표본에 대한 비율을 계산합니다.
      figure-protocol-7
    5. 각 샘플의 비율에 figure-protocol-8 100을 곱하여 백분율 figure-protocol-9 을 계산합니다.
      참고: 20%에서 80% 사이의 샘플은 표준 곡선에 속합니다.
  2. 표준 곡선 계산
    1. 각 표준물질의 중복 웰 비율(1 - 8)의 평균을 구합니다 figure-protocol-10 .
    2. 다음 방정식을 사용하여 각 표준의 평균 figure-protocol-11 비율의 로짓을 계산합니다.
      figure-protocol-12
    3. 각 표준물질의 알려진 농도(표 1)를 X-값으로, 각 표준물질의 로짓 figure-protocol-13 을 Y-값으로 사용하여 기울기와 Y-절편을 계산합니다.
    4. 알려진 cGMP 표준물질 농도의 log10 을 X-값으로 사용하고 각 표준물질의 로짓figure-protocol-14 을 Y-값으로 사용하여 측정 계수를 계산합니다.
      참고: 결정 계수가 1에 가까운지 확인합니다.
  3. cGMP 농도 계산(pmol/mL)
    1. 다음 방정식을 사용하여 각 표본의 로짓 figure-protocol-15 을 계산합니다.
      figure-protocol-16
    2. 각 샘플의 cGMP 농도를 계산하려면(샘플 밀리리터당 cGMP 피코몰 단위) 다음 방정식을 사용하십시오.
      figure-protocol-17
      참고: DR은 DILUTION RATIO의 약자입니다. 염산의 1:5 희석 비율로 희석된 간 샘플에 대한 균질화 DR 합계는 6과 같습니다. ELISA 완충액의 1:2 희석 비율로 희석된 간 샘플에 대한 완충액 DR 합계는 3입니다. 따라서 대괄호로 그룹화된 용어에 18을 곱합니다.
  4. cGMP 농도 계산(nmol/g)
    1. 다음 방정식을 사용하여 웰당 cGMP의 나노몰을 계산합니다.
      figure-protocol-18
    2. 다음 방정식을 사용하여 각 아세틸화된 샘플의 조직 그램을 계산합니다.
      figure-protocol-19
      참고: "조직의 mg"은 균질화 튜브에 추가된 조직의 질량(밀리그램)입니다. "사용된 HCl의 부피"는 균질화를 위해 샘플을 희석하는 데 사용되는 0.1N 염산의 부피입니다.
    3. 다음 방정식을 사용하여 ELISA 버퍼로 희석된 각 샘플의 조직 그램을 계산합니다.
      figure-protocol-20
      참고: "volume of sample diluted"는 ELISA 버퍼에 의해 희석된 샘플의 부피입니다. "250 μL"은 아세틸화된 샘플의 부피입니다. 언급된 "시약"은 아세틸화 시약 4M KOH 및 무수아세트산이다.
    4. 다음 방정식을 사용하여 웰당 조직의 그램을 계산합니다.
      figure-protocol-21
      참고: "부피 완충액"은 샘플을 웰에 추가하기 전에 조직 샘플을 희석하는 데 사용되는 ELISA 완충액의 부피입니다.
    5. 웰당 cGMP의 나노몰을 웰당 조직의 그램으로 나누어 cGMP의 농도를 nmol/g 단위로 계산합니다.
규격 번호cGMP 농도 (pmol/mL)
기준 13.0
기준 21.5
기준 30.75
기준 40.375
기준 50.1875
기준 60.09375
기준 70.046875
기준 80.0234375

표 1: 표준 농도. 표준 1 - 8의 알려진 농도.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식이 염화나트륨(0.15mmol/kg) 또는 15N-표지 질산염(0.15mmol/kg)으로 처리된 요크셔 국내 돼지를 차우의 볼루스로 5일 연속 하루에 한 번 투여하고 조직 채취 전에 헤파린 나트륨(0.9% 염화나트륨) 용액을 관류했습니다. 컬렉션에 대한 모든 세부 사항은 이전에 발표되었습니다19. 요크셔 사육 돼지 4마리의 둔근 및 간에서의 cGMP 농도는 설명된 ELISA 프로토콜에 따라 측정되었습니다. 간 조직은 1:5 희석 비율로, 둔근은 1:10 희석 비율로 0.1N 염산(HCl)을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. HCl-희석된 균질산염을 아세틸화한 다음 간 및 둔근 샘플 모두에 대해 1:2 및 1:3 희석 비율로 ELISA 완충액으로 희석했습니다. cGMP 농도는 상기와 같이 측정하였다. 흡광도는 상기 프로토콜에 명시된 바와 같이 준비된 샘플의 밀리리터당 cGMP의 피코몰로 전환된 다음 조직 그램당 cGMP의 나노몰(nmol/g)로 전환되었습니다.

간 조직에서 측정된 cGMP 농도는 위의 조건에서 최적의 실험 결과를 도출했습니다. 돼지 간에서 질산염 처리된 대조군과 대조군의 cGMP 농도는 각각 0.0202 nmol/g ± 0.003 nmol/g 및 0.0364 nmol/g ± 0.011 nmol/g의 조직입니다(그림 3). 몇 가지 값은 결과의 신뢰성을 확인합니다. 0.466 - 0.475 범위의 블랭크를 뺀B0 웰의 흡광도는 0.3 AU - 1.0 AU 범위에 속하며, 이는 Ellman의 시약으로 충분한 마이크로플레이트 개발을 검증합니다. 표준 곡선의 높은 품질은 표준 1에서 표준 8까지 흡광도의 점진적 증가와 0.99의 결정 계수로 검증된 표준 곡선의 선형성에 의해 나타납니다. 측정된 모든 유정(31.5%-71.2%)의 백분율 figure-results-1 은 20%에서 80% 사이이며, 이는 모든 샘플이 표준 곡선에 속한다는 것을 입증합니다. 명시된 특성을 가진 샘플은 해석에 적합합니다.

둔근 조직에서 측정된 cGMP 농도는 차선의 실험 결과를 산출했습니다. 둔근 웰의 백분율 figure-results-2 값(3.69%-27.3%)이 대부분 20% 미만으로 떨어졌기 때문에 최적이 아닌 레이블이 대둔근 결과에 할당되며, 이는 흡광도가 표준 곡선에 떨어지기 위해 더 많은 희석 샘플이 필요함을 나타냅니다. 돼지 둔근에서 대조군과 질산염 처리된 그룹의 cGMP 농도는 각각 조직 1.22 nmol/g ± 0.49 nmol/g 및 조직 0.732 nmol/g ± 0.18 nmol/g입니다(그래프는 표시되지 않음). 둔근 샘플은 간 샘플의 B0 웰 및 표준물질의 흡광도를 공유합니다. 이러한 차선의 표본을 사용하면 잘못된 결론을 내릴 수 있습니다. 따라서 더 많은 희석 샘플을 준비하고 cGMP 농도를 재측정해야 합니다.

figure-results-3
그림 3: 간 조직의 cGMP 농도. 조직의 nmol/g에서 염화나트륨(0.15mmol/kg) 또는 15N 표지 질산염(0.15mmol/kg)으로 처리된 돼지 간의 평균 cGMP 농도. n = 4; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 데이터는 Welch의 t-test에 의해 분석되었습니다. ns는 무의미(no significance)를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 경쟁력 있는 ELISA를 사용하여 고형 조직의 cGMP 농도를 측정하는 데 필요한 단계에 대한 지침을 제공합니다. cGMP 농도의 변화는 조직 내 NO 함량의 차이를 나타낼 수 있습니다. 고형 조직의 이러한 차이를 조사함으로써 다양한 장기에서 NO에 대한 정보를 설명할 수 있습니다.

프로토콜에서 조직 샘플은 ELISA를 준비하기 위해 먼저 균질화되었습니다. 이것은 고체 조직 덩어리를 급속 냉동한 다음 분쇄하는 것으로 시작되었습니다. 균질화 단계 전에 조직을 분해하는 것은 비드 균질화가 세포를 용해하는 데 도움이 됩니다. 조직은 단백질을 침전시키기 위해 0.1 N 염산에서 균질화되었으며, 이는 다른 방법20,21에서 사용되는 기술입니다. 마지막으로, 고체와 침전물은 원심분리를 통해 용해성 성분으로부터 분리되었습니다. 표준 곡선을 만들기 위해 cGMP(cGMP/mL 300pmol) 재고를 연속적으로 희석하여 8개의 서로 다른 표준을 만들었습니다. 표준물질 및 샘플은 0.1 pmol의 cGMP/mL 농도를 검출하여 분석의 감도를 개선하기 위해 아세틸화되었습니다. 이러한 민감도 증가는 아세틸기가 cGMP와 결합을 형성하여 각 항체(항혈청에 존재)가 아세틸화된 cGMP18에 결합하는 능력을 향상시킬 때 이루어집니다. 표준물질과 시료 모두를 아세틸화하면 웰 간 cGMP 결합의 균일성이 보장됩니다. 마이크로플레이트 웰의 cGMP 농도가 1.0 pmol/mL18을 초과할 것으로 예상되는 경우 표준물질과 샘플 모두에 대해 아세틸화 단계를 생략할 수 있습니다.

웰에 샘플을 추가하기 위한 준비로, 샘플을 ELISA 완충액으로 더 희석했습니다. 추가 희석을 통해 샘플이 표준 곡선에 떨어지고 NSB, B0 및 표준 웰의 함량과 더 유사하여 균일성을 생성할 수 있었습니다. 샘플 및 표준물질과 함께 몇 가지 다른 용액이 우물에서 혼합됩니다. NSB 웰에서 ELISA 완충액(아세틸화 시약 유무에 관계없이)이 추가되고 항혈청은 보류됩니다. 이는 항혈청을 구성하는 특이적 항체가 없는 상태에서 웰에 부착된 마우스 IgG에 결합하는 AChE 추적자(cGMP에 결합된 아세틸콜린에스테라제)의 양을 결정하기 위한 것입니다. B0 웰에는 ELISA 완충액(아세틸화 시약 포함), AChE 추적자 및 항혈청이 포함되어 있습니다. 그러므로,B0 웰은 cGMP의 경쟁 없이 AChE 추적자의 결합 능력을 나타낸다. 모든 웰이 적절하게 채워진 후 마이크로플레이트를 배양한 다음 세척합니다. 엘먼의 시약이 우물에 첨가되었다. 마지막으로, Ellman의 시약이 추가된 후 AChE 추적자를 TA에 추가했습니다. 이는 항체에 의해 얼마나 많은 추적자가 마이크로플레이트에 결합되었는지에 관계없이 AChE 추적자의 촉매 활성을 잘 나타냅니다. 마이크로플레이트는 실온에서 개발되어 AChE 추적자가 비색 반응을 촉매할 수 있도록 합니다.

프로토콜의 여러 단계에 따라 분석 결과가 변경될 수 있습니다. 최적의 결과를 위해 다음 단계를 수행할 때 각별한 주의가 필요합니다. 균질화 단계와 아세틸화 후 각 조직 유형에 대한 적절한 희석액을 식별하여 샘플이 표준 곡선에 속하도록 보장하는 데 필요합니다. 표준물질을 준비할 때, 부분 표본을 제거하기 전에 또는 부분 표본을 추가한 후에 용액을 완전히 와류화하거나 혼합해야 합니다. 이 단계는 각 표준물질의 예상 cGMP 농도에 도달하는 데 중요합니다. 아세틸화 단계 동안 각 표준물질과 샘플은 일관된 흡광도 판독값을 얻기 위해 동일한 기간 동안 볼텍싱되어야 합니다. 또한 표준물질과 샘플은 적절한 웰에 부분 표본을 추가하기 직전에 볼텍싱해야 합니다. 이를 통해 보다 정확한 cGMP 농도를 얻을 수 있습니다. 또한 마이크로플레이트를 철저히 세척하면 웰에서 결합되지 않은 모든 AChE 트레이서를 제거하므로 흡광도 값의 정확도가 향상됩니다. Ellman의 시약을 첨가한 후, 마이크로플레이트가 발달할 수 있도록 충분한 시간을 허용해야 하며, 색상과 가장 중요한B0 웰의 흡광도에 주의를 기울여야 합니다. 중복 또는 삼중 사이의 cGMP 농도는 농도가 높은 샘플에 비해 cGMP 수준이 낮은 샘플에서 더 다를 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다. 보다 농축된 샘플을 측정하면 이 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 마이크로플레이트 간의 변동성을 설명하기 위해 가능한 한 동일한 플레이트에서 동일한 조직 유형의 샘플을 측정해야 합니다. 이러한 지침을 따르면 분석 결과 데이터의 품질이 향상될 것으로 예상됩니다.

위의 프로토콜은 다른 부드럽고 단단한 조직으로 외삽할 수 있습니다. 상기 프로토콜의 조직 제제 하위 섹션의 추가 개발은 뼈를 포함한 경조직을 처리하는데 적합한 방법을 초래할 수 있으며, 이는 이의 혈관성으로 인해 흥미로울 수 있다. 이 기술의 지속적인 개발은 다양한 고체 조직에서 cGMP 농도를 측정하는 데 적합한 방법을 만들 수 있으며, 그 결과 거의 모든 조직에서 NO의 농도에 대한 추가 정보를 수집하는 유용한 방법이 될 수 있습니다. 위에서 언급한 경쟁력 있는 ELISA 프로토콜은 cGMP를 측정하고 NO의 함량을 추정하는 데 유용한 기술이지만 두 가지 주목할 만한 제한 사항이 있습니다. (1) 이 분석은 용해성 guanylyl cyclase에 의해 합성된 cGMP와 미립자 guanylyl cyclase(pGC)에 의해 합성된 cGMP를 구별하지 않습니다. 나트륨 이뇨 펩티드는 pGC 활성을 자극하고(22 ), 따라서 이 경로를 통한 cGMP의 변화는 NO의 풍부도에 대한 변화를 나타내지 않습니다. (2) 또한 포스포디에스터라제(PDE) 효소는 ELISA 분석 결과에 영향을 미칩니다. 여러 PDE는 cGMP를 가수분해하여 NO23에 의한 sGC 자극 후 농도를 감소시킵니다. 따라서 PDE의 촉매 활성은 cGMP 농도와 NO 농도 사이의 연결을 모호하게 할 수 있습니다. cGMP 손실을 방지하기 위해 실데나필(sildenafil)과 같은 PDE5 억제제를 추가하는 것은 cGMP 농도의 추세를 관찰하기 위한 측정값을 얻는 것과는 대조적으로 정확한 cGMP 농도를 얻는 데 주로 초점을 맞춘 실험에 권장됩니다. PDE5 억제제는 검체 채취 약 1시간 전에 동물에게 실데나필로 투여할 수 있으며(효과는 최대 4시간24일까지 지속됨) 이러한 투여가 불가능한 경우 채취한 검체에 실데나필을 첨가할 수 있습니다. 조직 채취 후 PDE를 억제할 때 0.1N 염산에 실데나필을 첨가하여 실데나필이 있는 상태에서 조직이 균질화되도록 합니다. 실데나필의 유무에 관계없이 측정은 동물 처리와 실데나필 사이에 혼선이 없는지 확인하기 위해 수행해야 합니다.

한계가 있음에도 불구하고 이 분석은 NO 신호의 다운스트림 전송에 대한 유익한 통찰력으로 사용됩니다. 결론적으로, 고형 조직의 cGMP 농도 측정을 다른 NO 측정 방법과 결합하면 장기에 대한 NO의 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 교내 NIDDK/NIH가 Alan N. Schechter에게 수여한 보조금 1ZIADK025104-18의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL BD 투명 경구 주사기벡턴 디킨슨50382903052177
14 mL 둥근 바닥 시험관송골매352059
2.0ml 마이크로튜브, 모듬올림푸스 플라스틱24-283A
30-300 & 마이크로; L 다중 채널 피펫 에펜도르프3125000052
무수아세트산(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사40003198% 순수
Hazard: 가연성, 부식성: 심하게 피부 화상, 눈 손상, 급성 독소
안전한 취급: 발화원에서 멀리 보관하고, 통풍이 잘되는 곳에서 작업하고, 장갑을 착용하십시오.
cGMP 아세틸콜린에스테라아제 추적자(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사481020인산이염기성 칼륨, 염화나트륨,  인산일염기성 칼륨, 소 알부민, 아지드화나트륨, EDTA, cGMP AChE 추적자
Hazard: 건강 위험: 반복 노출로 인한 장기 독성,
부식성: 눈 손상,
피부 및 호흡기 자극제
안전한 취급: 환기가 잘되는 곳에서 작업, 장갑 착용
cGMP ELISA 항혈청(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사481022인산이염기성 칼륨, 염화나트륨,  인산칼륨 일염기성, 소 알부민,  아지드나트륨, EDTA, 토끼 항-cGMP 다클론 항혈청
Hazard: 건강 위험: 반복 노출로 인한 장기 독성,
부식성: 눈 손상,
피부 및 호흡기 자극제, 급성 독성
안전한 취급: 환기가 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
cGMP ELISA 표준물질(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사481024인산이염기성 칼륨, 염화나트륨,  인산칼륨 일염기성, 소 알부민,  아지드나트륨, EDTA, cGMP 표준
Hazard: 건강 위험: 반복 노출로 인한 장기 독성,
부식성: 눈 손상,
피부 및 호흡기 자극제
안전한 취급: 환기가 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
순환 GMP ELISA 키트케이맨 화학 회사581021
ELISA 완충액 농축액 10X(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사4000601 M 인산염, 1% BSA, 4 M 염화나트륨, 10 mM EDTA, 0.1% 아지드화나트륨
Hazard: 건강 위험: 반복 노출로 인한 장기 독성,
부식성: 눈 손상,
피부 및 호흡기 자극제
안전한 취급: 통풍이 잘되는 곳에서 작업하고 뚜껑을 닫을 수 있는 용기에 보관하고 장갑을 착용하십시오
ELISA 시약 저장소피어스(현 써모피셔 사이언티픽)15075
Ellman's Reagent(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사400050인산이염기성 칼륨, 염화나트륨, 인산일염기성 칼륨, 아세틸티오콜린(요오드화물), 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)
Hazard: 급성 독성, 건강 유해성: 장기 독성, 부식성: 눈 손상, 피부 자극제, 회복성 자극제
안전한 취급: 통풍이 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
염산시그마-알드리치320331<강함>유해성: 부식성: 금속을 부식시키고, 피부를 심하게 화상을 입히고, 눈 손상, 호흡기 자극성
<강함>강함안전한 취급: 통풍이 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
액체 질소로버트의 산소질소
Hazard: 압축 가스: 극저온 화상, 동상, 질식 위험
안전한 취급: 환기가 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
마우스 Anti-Rabbit IgG 코팅 플레이트(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사400006
위험: 없음
새로운 클래식 MF 밸런스메틀러 토레도
궤도 셰이커 Stovall Life Science Inc.(현 IBI Scientific)15-453-211 (다양함)
파라필름베미스 컴퍼니, Inc.3023-4526 (다양함)
폴리소르베이트 20(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사400035
위험: 없음
수산화칼륨(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사40002985% 순수
Hazard: 부식성: 금속 및 피부 부식,
눈 손상, 급성 독성
안전한 취급: 통풍이 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
Precellys Evolution 균질화기베르틴 테크놀로지스PE000062-PEVO0-A
Precellys 용해 키트 경조직 균질화베르틴 테크놀로지스P000911-LYSK0-A
Sense 마이크로플레이트 리더하이덱스425-301
Sorvall Legend Micro 17R 원심분리기써모 피셔 사이언티픽75002441
조직 분쇄기셀크러셔셀크러셔 키트
소용돌이 지니 2과학 산업 SI-0246
워시 병시그마-알드리치Z423092
세척 완충액 농축액 400X(cGMP 키트 포함)케이맨 화학 회사400062인산이염기성 칼륨, 인산일염기성 칼륨, 물
<강함>위험성: 부식성: 눈 손상, 급성 독성, 피부 자극성, 장기 독성
<강함>안전한 취급: 통풍이 잘되는 곳에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.

참고문헌

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