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방법 논문

저산소증은 마우스에서 자폐증 스펙트럼 장애의 비멘델 유전과 관련된 miRNA 수준을 변경합니다.

41.2K 조회수

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DOI:

10.3791/68435

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2025년 7월 11일

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1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

이 논문에서

요약

여기에서는 신생아 마우스에서 다양한 산소 농도로 통제된 환경에서 투여하여 저산소증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 출생 시 산소 변화에 노출된 마우스 모델은 자폐증과 같은 행동 표현형 변화의 유도에 관여하는 miRNA의 발현을 지속적으로 변화시켰습니다.

초록

저산소증은 주산기 동안 다양한 이유로 다양한 정도로 발생할 수 있으며 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련된 신경퇴행성 태아 뇌 기능 장애와의 잠재적인 연관성에 초점을 맞춰 마우스에서 경증에서 중증의 신생아 저산소증의 결과를 조사하는 것을 목표로 합니다.

우리는 신생아 마우스에서 다양한 산소 농도로 통제된 환경에서 투여하여 저산소증을 유도했습니다. 그 결과, 대뇌 피질과 해마에서 HIF-1α(저산소증의 지표) 수치가 높아졌을 뿐만 아니라 이 부위의 신경 퇴행이 증가한 것으로 나타났습니다. 또한, 저산소군에서 ASD 관련 miRNA(miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p 및 miR-499a-5p)의 발현 변화를 관찰했으며, 이는 ASD의 인간 및 동물 모델에서 얻은 이전 결과와 일치합니다. 이러한 분자 변화는 움직임, 속도, 사회적 상호 작용 감소 및 반복적인 행동과 같은 행동 변화뿐만 아니라 저산소 상태에 노출된 쥐에서 모서리 탐색 행동을 나타내는 경향 증가를 동반했습니다. 12% O2 그룹(경증 저산소증)에서 행동 및 분자 변화가 감지되었지만, 가장 뚜렷한 변화는 10% O2 및 8% O2로 더 심각한 저산소증 그룹에서 관찰되었습니다.

전반적으로, 이 결과는 신생아 저산소증이 행동적 결과를 동반하는 신경퇴행성 질환과 관련된 지속적인 분자 변화를 유도할 수 있음을 시사합니다. 더욱이, 정상 출산에서도 초기 발달 단계에서 저산소증에 노출되면 기억력과 학습력이 손상될 수 있습니다. 이 결과는 장기적인 신경학적 문제를 예방하기 위해 저산소증에 노출된 신생아의 조기 발견 및 개입의 필요성을 강조합니다. miRNA 수준은 발달 과정에서 조절되며, 조직, 특히 생식 세포의 변형은 다음 세대의 위험 요소를 구성합니다. 이 분석은 저산소증 하에서 기능적 및 행동적 변화에 영향을 미치는 조절 경로를 연구하기 위한 기초를 제공합니다.

서론

산소 결핍 상태로 정의되는 저산소증은 다양한 병리학에서 그 역할을 이해하는 데 중요한 고유한 세포 및 분자 반응을 유도할 수 있습니다. İt는 발달 순서를 방해하여 분자, 세포 및 신경 변화와 손상을 유발할 수 있습니다. 또한, 저산소증에 일찍 노출되면 중추신경계(CNS) 발달이 저해되어 축삭 연결성과 시냅스 발달이 저해됩니다1.

또한, 저산소증이 중추신경계 발달에 악영향을 미치는 것으로 나타났지만, 배아 발생과 같은 특정 조건에서는 중요한 생리학적 역할을 할 수도 있습니다. 정상적인 생리적 저산소증은 배아 발달 과정에서 산소 수치가 자연적으로 낮은 상황을 말합니다. 이 과정은 배아 세포가 혐기성 대사를 촉진하여 에너지를 생산할 수 있도록 하고, 혈관화를 촉진하여 순환계의 발달을 지원하고, 심장과 뼈의 적절한 발달을 보장하고, 신경능선세포의 이동을 자극합니다2. 반대로, 생리학적 맥락을 벗어나 발생하는 저산소증은 배아 발달을 포함하여 발달 및 전반적인 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 이는 조산 또는 배아 치사로 이어질 수 있습니다1. 따라서 많은 신생아가 정상적인 분만 중에 저산소 상태를 경험하고 종종 간병인이나 의료진이 즉시 인식하지 못하기 때문에 주요 공중 보건 문제입니다3. 또한, 저산소증과 관련된 신경 연결성의 변화는 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 및 지적 장애를 포함한 신경 발달 장애와 관련이 있습니다1.

분자적 관점에서 저산소증은 시냅스 기능을 조절하는 유전자의 발현을 변화시켜 신경 발달에 영향을 미쳐 신경 발달에 영향을 미칠 수 있으며, 그로 인해 신경 발달 장애를 일으키고 신경 발달 장애의 발병에 기여할 수 있습니다4.

임상적으로, 신생아 저산소증은 호르몬 및 대사 경로를 통한 중추신경계 발달에 영향을 미친다1. 급성 저산소증에 대한 반응으로 시상하부는 부신피질자극호르몬 분비 호르몬과 아르기닌 바소프레신을 빠르게 분비하고, 이 호르몬은 뇌하수체 전엽에서 부신피질자극호르몬 분비를 유발한 후 태아 부신 피질에서 글루코코르티코이드 분비를 유발하며, 이 반응의 정도는 저산소증의 강도 및 지속 기간과 상관관계가 있습니다. 급성 스트레스에 대한 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축의 이러한 빠른 반응은 관련 유전자 발현, 단백질 합성 및 세포 대사에 영향을 미쳐 스트레스의 생리학적 영향을 제한하고 태아의 항상성을 유지하는 데 글루코코르티코이드의 중요한 역할을 강조합니다 5,6.

정상 산소 수치가 감소하면 저산소증에 대한 다양한 반응이 활성화되며, 대부분은 전사 인자(transcription factor), 저산소증 유도 인자(HIF) 및 프롤릴 하이드록실라제(PHD)와 같은 세포 산소 센서에 의해 조절됩니다1. in vitro studies7에서 나타난 바와 같이 O2 항상성의 조절자인 HIF-1은 HIF-1α 및 HIF-1β8로 구성된 이종이량체입니다. 저산소 조건에서는 수소 원자가 복합체의 수산기로 대체되는 것이 감소하여 HIF-1α가 축적된 다음 HIF-1β로 이합체화됩니다. 그 결과, HIF-1 이량체는 핵으로 전위되어 수백 개의 유전자1의 전사를 활성화합니다.

뉴런의 산소 의존적 특성으로 인해 뉴런은 저산소 스트레스에 특히 취약합니다. 따라서 저산소증은 뇌 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 축삭 경로 찾기와 시냅스 발달을 저해하여 신경 기능에 장기적으로 영향을 미칠 수 있다9. 이러한 신경 세포의 변화는 ASD 및 지적 장애와 같은 다양한 신경 발달 장애를 유발할 수 있습니다 9,10.

주산기 질식은 분만 중 산소 결핍으로 정의되며 산모-태아 출혈, 탯줄 압박, 태반 합병증, 자궁 파열, 어깨 난산 또는 신생아가 첫 숨을 쉬지 못하는 것과 같은 주산기 사건의 결과로 발생할 수 있습니다. 이 심각한 사건은 매년 전 세계적으로 약 400만 명의 신생아에게 영향을 미치며 100만 명의 신생아 사망 11,12,13을 초래합니다. 대부분의 유아는 저산소증 에피소드에서 살아남지만 일부 환자는 저산소성 허혈성 뇌병증을 앓게 되어 발작 장애, 뇌성 마비, 인지 지연 및 운동 장애와 같은 영구적인 신경학적 문제로 이어질 수 있습니다. 또한 질식과 허혈은 중추신경계(28%), 심혈관계(25%), 신장(50%), 폐(23%)와 같은 다양한 장기 및 시스템의 기능 장애를 유발할 수 있습니다11.

또한, 대뇌 혈관 구조의 미성숙과 열악한 자기 조절은 신생아를 허혈 위험에 취약하게 만드는 요인입니다. 이러한 과정에서 염증과 산화 스트레스는 신생아 저산소성 허혈성 손상 및 관련 세포 사멸 메커니즘의 주요 매개체입니다. 비정상적인 세포사멸은 발달 중인 뇌를 운동 및 인지 장애의 위험에 노출시킬 수 있다14.

ASD의 복잡성을 감안할 때, 다원적 구조를 가지고 있는 것으로 보이는 근본적인 유전학과 그 발달을 결정하는 환경적 요인을 이해하는 것이 중요합니다. 특히, ASD의 다원적 기반은 유전적 소인이 저산소증을 포함한 외부 요인과 상호 작용하는 다인자 병인을 의미합니다. 일란성 쌍둥이에서 관찰된 60%-92%의 일치는 유전적 영향의 중요성을 강조하는 반면, 불일치는 환경적 요인도 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 자폐증의 유병률은 10,000명 중 13명으로 추산되며, 이 비율은 최근 몇 년 동안 증가한 것으로 여겨진다15. 임신 중 환경적 요인에 대한 노출이 자폐증의 위험을 증가시킬 수 있다는 가설을 뒷받침하는 연구가 있지만, 진단 기준, 비교 그룹, 표본 크기 및 노출 평가 방법의 차이로 인해 이러한 연구의 결과는 종종 일관성이 없습니다15,16.

뚜렷한 신경병리학적 소견은 불분명하지만, 연구에 따르면 뇌의 미시적 및 기능적 이상이 드러납니다. 이러한 이상은 병인학적으로 관련된 시기가 자궁 내에 있을 수 있으며, 발병기전이 태아기에 시작될 수 있음을 시사한다15. 임신 중 노출은 자폐증의 잠재적 위험 요인에 대한 역학 연구의 주요 초점입니다. 특히, 산과적 합병증이 ASD의 위험을 증가시킬 수 있다는 가설은 많은 연구에서 뒷받침되고 있지만, 이러한 영향의 규모와 결과는 연구마다 다르다17.

유전적 요인 외에도 후성유전학적 메커니즘은 저산소 조건에서 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 특히, miRNA는 HIF에 미치는 영향과 같이 저산소증에 대한 세포 반응에서 핵심 조절 메커니즘을 나타냅니다. 저산소증의 초기 단계에서 miRNA 수치의 특정 변화는 HIF-1의 축적과 HIF-2 및 HIF-3의 안정적인 수준 유지에 기여할 수 있습니다18. 많은 miRNAs의 표정 프로파일은 저산소성 및 허혈 조건 하에서 변화되지만, 제한된 수의 저산소증 관련 miRNAs가 기능적 역할을 하고 HIF 발현에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이는 조직 특이적 miRNA 발현으로 인해 저산소 반응에서 서로 다른 인간 조직이 다른 이유를 설명합니다18.

새로운 데이터는 또한 특정 miRNA가 ASD 병리학에 연루되어 있음을 나타냅니다. 이전 연구에서는 암에서 세포 생존, 분화 및 스트레스 반응을 조절하는 것으로 알려진 miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p 및 miR-499a-5p가 ASD 환자에서 비정상적인 발현을 나타내어 신경 발달 결과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있음을 입증했습니다. 그런 다음 ASD의 마우스 모델에서 채취한 혈액, 시상하부, 정자 샘플에서 이러한 발견을 확인했으며, 이는 유전자 조절 변화와 ASD의 일관된 연관성을 보여주었습니다19. 이러한 결과는 성장과 발달의 중요한 단계에서 이러한 miRNA의 하향 조절이 ASD와 같은 질병의 발병에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다. 이것은 또한 신생아 저산소증이 분자 및 행동 특성에 미치는 깊은 영향을 보여줍니다.

이 연구에서는 경증에서 중등도의 신생아 저산소증이 성인기의 자폐증 발병 위험에 미치는 영향을 테스트했습니다. 이를 위해 신생아 마우스는 다양한 수준의 저산소증에 노출되었습니다. 실제로, 태어날 때 저산소증을 경험한 쥐는 성인이 되어서도 행동 변화를 보이며, 더 중요하게는 분자 수준에서 ASD와 관련된 변화를 보입니다. 따라서 본 연구의 결과는 저산소증의 장기적인 영향에 대한 귀중한 정보를 제공했다.

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프로토콜

모든 실험 프로토콜은 Erciyes University(HAYDEK)의 지역 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았으며 라이선스 번호 21/216에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 과목

참고: 이 연구는 Erciyes 대학의 Betül-Ziya EREN 게놈 및 줄기 세포 센터(GENKÖK)의 형질전환 단위의 Balb/c 마우스를 대상으로 했습니다.

  1. 평균 무게가 18-25g인 2개월 된 Balb/c 마우스를 사용하십시오. 마우스를 20시간 라이트/다크 주기(2-12시간)에서 2± 2°C, 습도 52 ± 3%로 유지합니다.
  2. 생쥐에게 표준 마우스 펠릿을 먹이고 매주 침구를 교체하고 음식과 물을 무제한으로 이용할 수 있도록 합니다.
    참고: 분자 연구는 GENKÖK의 유전체학 및 저산소증 실험실과 Bozok 대학의 조직학 및 발생학 실험실에서 수행되었습니다. 'STOP point'는 지정된 온도에서 작업을 일시 중지하고 보존할 수 있는 위치를 나타냅니다.

2. 저산소증 모델 구축

  1. 3개의 저산소 통제 그룹과 1개의 가짜 대조군을 포함하여 4개의 그룹을 포함하도록 실험을 설계합니다.
  2. 건강한 암컷 마우스와 건강한 수컷 마우스를 짝지어 건강한 임신한 암컷 마우스를 형성하면 결국 중증 저산소증(8% O2)(n = 4), 중등도 저산소증(10% O2)(n = 4), 경증 저산소증(12% O2)(n = 4) 및 정상 산소증(21% O2)이 가짜 대조군(n = 4)으로 분류됩니다.
  3. 저산소증을 유발하려면 임신한 마우스를 저산소증 실험실로 옮기고 E21.5일 72시간 전에 모니터링을 시작합니다.
  4. 저산소증 그룹에서 임신한 마우스의 분만 지점을 감지하고 즉시 저산소증 챔버에 배치합니다. 각 그룹에 대해 설명된 대로 각 챔버의 산소 수준을 조정합니다(2.2단계 참조).
  5. 신생아를 저산소 상태로 5분 동안만 유지한 다음 즉시 정상적인 주거 상태로 옮기십시오.
    참고: 피험자를 저산소 상태에 장기간 두면 치사율이 발생할 수 있습니다.
  6. 각 그룹에서 2명의 신생아(무작위로 선택)를 사용하여 저산소증으로 인한 손상을 확인하고 성별을 확인합니다. 성인기 단계를 위한 추가 분자 및 행동 테스트를 위해 수유 기간이 끝날 때까지 나머지 새끼를 정상적인 주거 조건에서 어미 옆에 두십시오( 보충 그림 1의 실험 설계 참조).

3. 신생아 단계에서 성별 간 저산소 효과의 잠재적 차이를 평가하기 위한 성별 결정

  1. 각 마우스(무작위로 선택됨(x2/그룹))의 무게를 개별적으로 측정하여 필요한 마취제 투여량을 계산합니다. 케타민을 100mg/kg으로, 자일라진을 10mg/kg으로 복강내로 투여합니다.
  2. 마우스가 완전히 마취되면 경추 탈구를 통해 안락사를 진행하고 즉시 멸균 라벨이 부착된 1.5mL 튜브(STOP point, -80°C)에서 꼬리 조직을 수집합니다.
  3. 추가 분석을 위해 모든 뇌 조직을 즉시 채취하여 10% 포름알데히드가 포함된 원심분리 튜브(STOP point, 25°C)로 옮깁니다.
  4. DNA 추출을 위한 조직을 준비합니다.
    1. 꼬리 샘플을 준비하고 25°C에서 해동합니다(필요한 경우). 1M Tris, 0.5M EDTA, 4% SDS, dH2O및 proteinase K를 포함하는 300μL의 용해 완충액을 샘플에 추가합니다.
  5. 샘플을 균질화합니다.
    1. 볼텍싱으로 샘플을 철저히 혼합하고 55°C에서 밤새 배양합니다.
    2. 다음날 아세트산 암모늄 100μL를 넣고 볼텍싱으로 간단히 혼합합니다. 12,000g의 원심분리기, 25°C에서 20분간
  6. 상 분리를 수행합니다.
    1. 투명 수성상을 1.5mL 튜브로 표시된 새로운 멸균 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    2. 500μL의 이소프로판올을 첨가하고 25°C(STOP point, -20°C)에서 5분 동안 배양합니다. 12,000g의 원심분리기, 25°C에서 10분간
  7. DNA 펠릿을 씻으십시오.
    1. 튜브 바닥의 펠릿을 검사한 후 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    2. 1000μL의 70% 에탄올을 넣고 튜브를 가볍게 두드려 펠릿을 띄웁니다. 7500g의 원심분리기, 25°C에서 10분간
  8. DNA를 정제합니다.
    1. 튜브 바닥의 펠릿을 검사한 후 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
    2. 10μL 마이크로피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거하고 완전히 건조시킵니다.
    3. 100μL의 뉴클레아제가 없는 물(NFW)을 첨가하여 펠릿을 재현탁합니다. +4 °C에서 10-15분 동안 배양합니다.
  9. DNA를 정량화하고 저장합니다.
    1. 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. DNA 샘플은 나중에 사용할 때까지 +4 °C에서 보관하십시오. (STOP POINT)를 클릭합니다.
  10. 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행합니다.
    1. SRY-F, SRY-R 및 간접 PAX6-F, PAX6-R 프라이머를 설계합니다(보충 표 1 참조).
    2. PCR 혼합물을 다음과 같이 준비합니다(샘플당): PCR 완충액 5μL(10x), MgCl 2 4μL, dNTP 4μL, 4개의 프라이머 각 0.5μL, dH2O31μL 및 Taq 중합효소 0.5μL.
      참고: Taq 중합효소는 최적의 증폭을 보장하기 위해 사용 직전과 마지막 복용 직전에 첨가해야 합니다.
    3. 라벨이 부착된 PCR 튜브를 준비하고 +4°C 냉각 랙에 놓습니다. 혼합물 45μL를 튜브에 분배합니다.
    4. PCR 혼합물 방울이 튜브 바닥에 있는지 확인하기 위해 블록을 부드럽게 두드립니다.
    5. 5 μL의 DNA 샘플을 추가하고 간단히 피펫을 넣으십시오. Vortex를 잠시 한 다음 튜브를 원심 분리합니다.
    6. PCR 기계에 튜브를 넣고 프로그램을 다음 조건으로 설정하십시오 : 처음에는 95 ° C에서 5 분 동안 배양, 94 ° C에서 1 분 동안 변성 40 사이클, 57 ° C에서 45 초 동안 어닐링, 72 ° C에서 1 분 동안 연장. 사이클 후 72°C에서 10분 동안 최종 연장한 다음 40°C에서 무기한 유지합니다.
  11. 2% 아가로스 젤 전기영동을 사용하여 결과 샘플을 시각화합니다.
    참고: 두 개의 밴드를 보여주는 샘플은 수컷이고 하나의 밴드만 있는 샘플은 암컷입니다.

4. 신생아 마우스의 저산소증 손상 확인

  1. 제물을 바친 쥐에서 채취한 뇌 조직을 현미경으로 평가하여 저산소 손상을 확인하고 면역조직화학적으로 검사하여 HIF-1α를 검사합니다.
    1. 조직을 고정하고 파라핀으로 삽입합니다.
      1. 포름알데히드에 조직을 12시간 동안 보존한 다음 6시간 동안 물로 씻습니다.
      2. 각 농도에 대해 1일 동안 에틸 알코올 시리즈에서 탈수하여 조직을 고정합니다: 100% 에틸 알코올에서 70%, 80%, 90%, 3시간 동안. 티슈를 자일렌에 15분 동안 넣어 깨끗이 씻어냅니다.
      3. 조직을 파라핀 시리즈 I, II 및 III에 각각 1시간 동안 옮깁니다. 세 번째 시간이 지나면 뇌 샘플의 방향을 적절하게 잡고 깨끗한 파라핀에 삽입하십시오.
      4. 회전식 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록에서 5μm 두께의 절편을 자릅니다.
    2. 슬라이드를 준비합니다.
      1. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색의 경우 일반 유리 슬라이드에 절편을 배치합니다.
      2. 면역조직화학을 위해 양전하를 띤 유리 슬라이드에 절편을 배치합니다.
        참고: (STOP POINT), 추가 평가 및 작업을 위해 이 단계에서 슬라이드를 보관할 수 있습니다.
    3. HE 염색을 수행합니다.
      1. 샘플을 Xylene I 용액에 10분 동안 담그십시오.
      2. 샘플을 Xylene II 용액에 10분 더 담급니다.
      3. 샘플을 각각 1분(100%, 96% 및 80%) 동안 일련의 감소하는 알코올 농도로 옮깁니다.
      4. 증류수로 샘플을 2분 동안 세척합니다.
      5. 샘플을 헤마톡실린에 8분 동안 담근 다음 증류수에서 2분 동안 세척합니다.
      6. 세척 후 샘플을 산성 알코올로 1초 동안 처리한 다음 1분 동안 세척합니다.
      7. 샘플을 암모니아 물에 10초 동안 넣은 다음 1분 세척을 반복합니다.
      8. 샘플을 70% 알코올에 30초 동안 넣습니다.
      9. 샘플을 eosin에 10분 동안 담그십시오.
      10. 알코올 농도를 각각 1분씩(96%, 96%, 100%) 증가시켜 샘플을 점차적으로 옮깁니다.
      11. 샘플을 Xylene I, Xylene II 및 Xylene III 용액에 각각 1분 동안 담그십시오.
      12. 커버 슬립으로 덮으십시오.
    4. 현미경을 사용하여 검사합니다.
      1. HE 염색 후 광학 현미경으로 각 그룹의 전체 뇌 조직을 검사합니다.
      2. 해마 및 피질 영역에서 신경 변성 및 세포 주위/혈관 주위 부종을 평가합니다.
  2. HIF-1α 염색을 수행합니다.
    1. 양전하를 띤 슬라이드의 샘플을 67°C의 인큐베이터에서 밤새 배양하여 적절한 고정을 보장합니다.
    2. xylene I 및 xylene II 용액을 통해 절편을 통과시켜 완전한 탈파라핀화를 수행합니다.
    3. 100%, 96%, 80%, 70% 에탄올 용액에 각각 5분 동안 순차적으로 배치하여 섹션을 재수화한 다음 증류수로 5분 동안 헹굽니다.
    4. 665W에서 0.01M 구연산(pH 6.0)의 절편을 5분 주기 2회 동안 전자레인지에 돌려 에피토프의 가면을 벗깁니다.
    5. 섹션을 실온(RT)에서 20분 동안 냉각합니다.
    6. 소수성 펜으로 섹션의 둘레를 그린 다음 PBS에서 각각 3분 동안 섹션을 5회 세척합니다.
    7. 내인성 과산화효소 활성을 차단하기 위해 메탄올 중 3% 과산화수소 절편을 10분 동안 배양합니다.
    8. PBS에서 매번 3분 동안 섹션을 다시 5회 세척합니다.
    9. 비특이적 면역글로불린 결합을 방지하려면 UV 차단 시약으로 절편을 7분 동안 배양합니다.
    10. 항-HIF-1α 1차 항체(1:200 희석)로 4°C에서 밤새 절편을 배양합니다.
    11. PBS에서 매번 3분 동안 섹션을 5회 세척합니다.
    12. 절편에 비오틴화된 2차 항체를 적용하고 RT에서 40분 동안 배양합니다.
    13. PBS에서 매번 3분 동안 섹션을 다시 5회 세척합니다.
    14. 스트렙타비딘 용액을 절편에 도포하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
    15. 매번 3분 동안 PBS에서 섹션을 5회 세척합니다.
    16. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 적용하고 광학 현미경으로 관찰하여 염색 반응을 현상합니다.
    17. 변형된 Gill II hematoxylin 용액으로 절편을 대조염색하여 핵을 염색합니다.
    18. 증가하는 농도의 에탄올(70%, 80%, 96% 및 100% 에탄올)을 통과시켜 섹션을 탈수합니다.
    19. Xylene I 및 Xylene II 용액에서 각각 10분 동안 배양하여 섹션을 제거합니다.
    20. 장착 매체와 커버슬립이 있는 장착 섹션.
    21. 광학 현미경으로 장착된 부분을 검사하고 해마와 전전두엽 피질 영역을 평가합니다.
    22. 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 면역 반응 수준을 측정합니다.

5. 행동 실험

  1. 저산소증이 확인된 후 나머지 쥐가 어미와 함께 수유 기간을 마칠 수 있도록 합니다.
  2. 출생 후 21일째에 항문 생식기 거리에 따라 성별 결정을 수행한 다음 동물을 성별에 따라 다른 우리에 수용합니다. 저산소 대조군과 가짜 대조군에 속한 쥐가 생후 2개월이 되면 행동 실험을 실시한다.
  3. 행동 테스트를 수행하기 전에 테스트 전에 15-30분 동안 피험자를 테스트 환경에 적응시킵니다.
  4. 피험자와 실험 사이의 모든 장치/기구를 70% 에탄올을 사용하여 소독해야 합니다.
  5. NOR(Novel Object Recognition) 테스트를 수행합니다.
    1. 피사체를 명확하게 볼 수 있고 모니터링할 수 있는 위치에 카메라를 설정하십시오.
    2. 적절한 비디오 추적 소프트웨어를 설치합니다.
    3. 마우스보다 크지 않은 두 개의 물체로 테스트 경기장(60cm × 60cm ×cm × 40cm 상자)을 준비합니다. 두 물체가 크기와 모양이 비슷하고 쉽게 접근할 수 있는지(벽에서 10cm × 10cm 떨어져 있고 평행한지) 확인하십시오.
    4. 1일차: 익숙화 단계:
      1. 두 개의 동일한 개체가 있는 경기장에 마우스를 놓습니다. 마우스가 설정된 시간(예: 10분) 동안 개체를 자유롭게 탐색할 수 있도록 합니다.
      2. 이 세션 동안 마우스가 각 객체와 함께 보낸 시간을 관찰하고 기록합니다. 또한 마우스가 각 물체를 향해 회전하거나 상호 작용한 횟수를 기록합니다
    5. 2일차: 소설 개체 소개:
      1. 1일차에 사용했던 익숙한 물건 중 하나를 새로운 물건(모양, 질감 또는 모양이 다름)으로 교체합니다.
      2. 마우스를 경기장으로 되돌려 첫 번째 세션과 동일한 시간 동안 다시 자유롭게 탐색할 수 있습니다.
    6. 마우스가 익숙한 개체(1일차부터)와 새로운 개체와 함께 보낸 총 시간을 기록합니다. 마우스가 각 개체 쪽으로 향하거나 각 개체와 상호 작용한 횟수를 기록합니다.
    7. 다음 공식을 사용하여 마우스의 기억력과 학습을 평가하기 위해 DI(Discrimination Index)를 계산합니다.
      변별 지수(DI) = {(새로운 개체에 소요된 시간 - 친숙한 개체에 소요된 시간)/(두 개체에 소요된 총 시간)} × 100.
      참고: DI가 높을수록 새로운 개체에 대한 관심이 더 크다는 것을 나타내며 기억력과 학습 능력이 더 우수함을 나타냅니다. DI가 0에 가까우면 선호가 없음을 나타내며, 이는 친숙한 개체에 대한 관심이 같거나 기억력이 좋지 않음을 나타냅니다.
    8. DI를 사용하여 마우스의 타고난 호기심과 친숙한 물체와 새로운 물체를 인식하고 구별하는 능력을 기반으로 마우스의 학습 및 기억 능력을 객관적으로 평가합니다.
  6. 테일 서스펜션 테스트(TST) 수행
    1. 마우스가 명확하게 보이고 모니터링할 수 있는 위치에 카메라를 설치하십시오. 적절한 비디오 추적 소프트웨어를 설치합니다.
    2. 3마리의 마우스를 동시에 수용할 수 있는 공간이 있는 실험 설정을 준비합니다.
    3. 20cm 간격의 25cm 높이의 판지 패널을 사용하여 쥐를 격리하여 테스트 중에 서로 볼 수 없도록 합니다.
    4. 12cm 길이의 테이프 스트립을 잘라 각 마우스의 꼬리에 조심스럽게 부착하여 꼬리가 손상되지 않고 단단히 부착되도록 합니다. 마우스가 다치지 않고 매달릴 수 있도록 꼬리 끝(2cm)에 테이프를 놓습니다.
    5. 마우스가 매달려 있는 동안 6분 동안 마우스를 기록합니다.
    6. 지속 시간이 끝나면 녹음을 중지하고 마우스를 제거한 다음 하우징 케이지로 되돌립니다. 비디오를 분석하여 활동적인 움직임의 지속 시간과 부동성의 지속 시간을 확인합니다.
      참고: 부동성은 종종 학습된 무력감 또는 스트레스 상태를 나타내기 때문에 이것은 스트레스 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 부동성의 정도는 일반적으로 생쥐의 행동 절망 또는 스트레스 반응을 측정하는 데 사용되며, 이는 스트레스 또는 우울 상태의 영향과 관련이 있을 수 있습니다.
    7. 관찰된 움직임과 부동성 패턴을 기반으로 강제 중단에 대한 반응으로 마우스의 감정 상태와 스트레스 대처 메커니즘을 평가합니다.
  7. 대리석 매몰 테스트 수행
    1. 빈 케이지(20cm × 35cm × 15cm)에 5cm 높이의 옥수수 속대를 채웁니다. 20개의 구슬을 각각 4개의 구슬이 있는 5줄로 배열합니다. 구슬이 표면에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
    2. 피험자를 새장 구석에 놓아 전체 새장에 자유롭게 접근할 수 있도록 합니다.
    3. 마우스가 케이지를 탐색할 수 있도록 20분을 줍니다. 이 기간 동안 쥐는 옥수수 속대로 구슬을 덮으려고 하는 약간의 묻기 행동을 보일 수 있습니다. 20분 후 케이지에서 마우스를 꺼냅니다.
    4. 20분 동안 마우스가 옥수수 속대 아래에 묻은 구슬의 총 수를 세십시오. 묻힌 구슬의 총 수를 기록하십시오. 이것이 행동의 핵심 척도이므로 기록하십시오.
      참고: 묻힌 구슬의 수는 일반적으로 설치류의 불안, 강박 행동 또는 신공포증의 지표로 사용됩니다. 묻힌 대리석의 수가 많을수록 종종 더 높은 수준의 불안이나 강박 경향과 관련이 있습니다.
    5. 묻힌 구슬의 총 수를 기반으로 마우스의 불안 관련 행동 및 강박 경향을 평가하여 치료 또는 실험 조건의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
  8. 사회적 상호 작용 테스트를 수행합니다.
    1. 마우스가 명확하게 보이고 모니터링할 수 있는 위치에 카메라를 설치하십시오.
    2. 카메라를 컴퓨터에 연결하고 적절한 비디오 추적 소프트웨어를 설정합니다. 두 개의 벽(40cm × 25cm)이 있는 직사각형 상자(60cm × 40cm × 25cm)와 두 개의 문(8cm)을 설정하여 세 개의 방을 분리합니다.
    3. 실험 대상자에게 익숙한 쥐가 들어 있는 우리(15cm × 10cm)와 실험 대상자와 이전에 상호 작용한 적이 없는 쥐가 들어 있는 또 다른 우리(15cm × 10cm)를 놓습니다.
    4. 녹음을 시작하고 피사체를 중간 칸에 놓습니다.
      참고: 실험 동물 이외의 이 실험에 사용된 마우스는 성별이 같고 건강해야 합니다.
    5. 피사체를 5분 동안 모니터링하고 비디오 카메라로 녹화합니다. 지속 시간이 끝나면 녹음을 중지하고 마우스를 제거한 다음 하우징 케이지로 되돌립니다.
    6. SIT 소프트웨어를 사용하여 생쥐의 사회적 상호 작용 시간 및 사회적 참신함 경향을 분석하고 이를 가짜 대조군과 비교합니다.
      참고: 사회적 행동(예: 그루밍 또는 킁킁거림)에 더 많은 시간을 할애하고 공격성을 피하거나 표시하는 데 더 적은 시간을 소비하는 것은 높은 사교성을 보여주는 것으로 해석될 수 있습니다. 상호 작용을 피하거나, 고립된 시간을 더 많이 보내거나, 공격성이 증가하면 불안, 사회적 위축 또는 사회적 상호 작용 능력 저하를 암시할 수 있습니다.
  9. 오픈 필드 테스트를 수행합니다.
    1. 마우스를 명확하게 볼 수 있고 모니터링할 수 있는 곳에 카메라를 배치합니다. 카메라를 컴퓨터에 연결하고 적절한 비디오 추적 소프트웨어를 설정합니다.
    2. 테스트 경기장(60cm × 60cm × 40cm 상자)을 설정하고 상자를 가상의 선으로 나누어 16개의 사각형을 만듭니다.
    3. 녹음을 시작하고 마우스를 경기장 중앙에 조심스럽게 놓습니다. 5분 동안 마우스의 동작을 관찰하고 기록합니다.
    4. 지속 시간이 끝나면 녹음을 중지하고 마우스를 제거한 다음 하우징 케이지로 되돌립니다.
    5. 추적 소프트웨어를 사용하여 걷기, 등반, 탈출, 몸단장, 부동성, 총 횡단, 배변 및 배뇨와 같은 외부 및 내부 행동을 측정하여 피험자의 불안, 운동 능력, 탐구 및 정서적 활동 수준을 평가합니다.
  10. Morris 물 미로(MWM) 테스트를 수행합니다.
    1. 지름 120cm, 깊이 60cm의 수중 미로를 23± 1°C의 행동 실험실에서 안정된 위치에 준비합니다.
    2. 미로를 4개의 가상 사분면으로 나누고 바닥에서 약 20cm 떨어진 미로 벽의 각 사분면 중앙에 서로 다른 시각적 신호(모양 및 색상)를 매달아 놓습니다. 길이 17cm, 지름 10cm의 플랫폼을 벽에서 20cm 떨어진 곳에 배치합니다.
      참고: 미로, 신호 및 플랫폼은 마우스가 기억을 정확하게 훈련할 수 있도록 위치나 위치를 변경해서는 안 됩니다.
    3. 미로를 플랫폼 아래 21cm까지 26-1°C의 물로 채우고 검은색 다중 표면 아크릴 염료로 염색합니다.
      참고 : 다른 종류의 마우스를 사용하는 경우, 물은 마우스의 대비 색상으로 착색되어야하며 마우스 를 모니터링 할 수 있어야합니다.
    4. 전체 이미지를 캡처할 수 있는 위치에 카메라를 놓고 컴퓨터의 MWM 소프트웨어에 연결합니다.
      참고: 플랫폼 자리는 5일차 시험에 대한 프로그램에서 할당되어야 합니다.
    5. 테스트는 각각 4번의 시도로 5일 동안 지속됩니다. 처음 4일 동안은 녹음을 시작하고 피험자를 매일 다른 사분면에 조심스럽게 배치하고 얼굴이 탱크 벽을 향하도록 하여 실험을 시작합니다.
    6. 5일차 테스트 일정에서 플랫폼 위치를 할당합니다.
      참고: 이것은 피험자가 연상 기억을 형성하는 것을 방지합니다. 외부 스트레스가 추가되지 않도록 피사체를 물 속에 조심스럽게 배치하고 올바른 온도를 유지하는 것이 필수적입니다. 평가판은 5분 동안 지속되며 (i) 플랫폼에 도달하고 (ii) 5분 시간 제한이 만료되면 자동으로 종료됩니다. 며칠에 걸쳐, 피험자들은 플랫폼의 위치를 알아내고 더 짧은 시간 안에 그것을 찾아야 한다.
    7. 다섯째 날에는 플랫폼을 제거하고 앞에서 설명한 대로 미로의 사각형에 쥐를 조심스럽게 놓습니다.
      참고: 평가판은 (i) 마우스가 플랫폼을 찾아 밟을 때, (ii) 5분 시간 제한이 만료되면 자동으로 종료됩니다. 건강한 피험자는 이전 플랫폼의 위치를 찾아야 합니다. 이 소프트웨어는 각 시험에서 마우스가 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간을 자동으로 계산하고 피험자의 단기 및 장기 기억 및 학습 능력을 평가하는 데 도움을 줍니다.

6. 성체 마우스의 저산소증 손상 확인

  1. 행동 테스트가 완료된 후, 경추 탈구로 피험자를 희생시킨다.
  2. 분자 분석을 위해 가짜 대조군을 포함한 각 그룹의 6마리 마우스에서 해마 조직과 혈액 샘플을 수집합니다(섹션 7).
  3. 나머지 4마리의 쥐의 뇌를 10% 포름알데히드 용액에 넣어 신생아 기간 동안 저산소증 노출이 성인 뇌 형태에 미치는 영향을 조사합니다.
  4. 섹션 4에서 앞서 설명한 것과 동일한 기술을 사용하여 성인 쥐의 뇌에 대한 조직학적 분석을 수행합니다.

7. 성체 상 샘플에서 총 RNA 분리

  1. 각 조직 샘플에 500μL의 트리졸과 500μL의 혈액을 추가합니다.
  2. 뇌 조직의 경우 주사기를 사용하여 샘플을 균질화합니다.
  3. RT에서 혼합물을 5분 동안 배양합니다.
  4. 각 튜브에 클로로포름 200μL를 추가하고 RT에서 추가로 5분 동안 배양합니다.
  5. +4 °C에서 20분 동안 12,000g의 원심분리기.
  6. 수성상(RNA)을 새 멸균 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
  7. 이소프로판올(수성상과 1:1 비율)을 첨가하고 혼합물을 밤새 배양합니다. (정지 점/ -20 °C).
  8. 다음날 12,000g에서 +4°C에서 10분 동안 원심분리기합니다.
  9. 상등액을 조심스럽게 버리고 펠릿에 1000μL의 75% 에탄올을 첨가합니다.
  10. +4 °C에서 5분 동안 7,500 × g 의 원심분리기.
  11. 에탄올 세척 단계를 두 번 반복합니다.
    알림: 펠릿이 너무 작으면 한 번만 씻으면 됩니다.
  12. 상등액을 버리고 펠릿을 RT에서 자연 건조시킵니다.
  13. 완전히 건조되면 펠릿을 50μL의 NFW로 재현탁하고 +4°C의 얼음에서 10-15분 동안 배양합니다.
  14. 분광광도계법으로 RNA 농도를 측정합니다.
  15. 추가 분석이 있을 때까지 RNA 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.

8. 상보적 DNA(cDNA) 합성

  1. 냉각 +4 °C 랙에서 작업하여 혈액 및 뇌 조직에서 분리된 RNA 샘플을 준비합니다.
  2. 라벨링된 PCR 튜브를 준비합니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트 시약을 혼합합니다.
  4. 각 샘플에 대해 총 14 μL의 반응 혼합물을 준비하고 튜브에 분배합니다.
  5. 6μL의 RNA 샘플을 혼합물에 추가합니다.
  6. 제조업체가 지정한 온도 및 시간 조건에 따라 PCR 장치에서 cDNA 합성을 수행합니다.
    주: 이 단계에서 종합된 cDNA는 더 사용까지 -80 °C에 저장될 수 있습니다.
  7. 합성된 cDNA를 1:5의 비율로 희석합니다.
  8. 향후 qPCR 분석을 위해 희석된 cDNA를 -80°C에 보관합니다.

9. miRNA(miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p, U6 small nuclear RNA) 발현을 위한 정량적 real-time PCR

  1. 각 miRNA에 대한 프라이머를 설계합니다(염기서열에 대한 보충 표 2 참조).
  2. 제조업체의 지침에 따라 PCR 반응 혼합물을 준비합니다.
  3. 14μL의 반응 혼합물을 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다.
  4. 20 μL의 총 반응 부피를 위해 각 웰에 6 μL의 1:5 희석된 cDNA를 추가합니다.
  5. 이 프로그램을 따라서 변이를 극소화하기 위하여 각 견본을 위한 중복에 있는 PCR를 실행하십시오: 120 s 동안 95 °C에 처음 변성, 10 s 동안 95 °C에 변성의 45 주기, 60 s 동안 56 °C에 어닐링 및 확대, 및 15 s를 위한 60 °C에 60 °C에 녹는 곡선 분석, 그 후에 95 °C에.
  6. Ct(주기 임계값) 값을 사용하여 결과를 분석하고 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터를 정규화합니다.

10. 통계 분석

  1. . 히스토그램, Q-Q 도표 및 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 데이터의 정규성을 평가하고 miRNA 발현 데이터를 분석합니다.
    1. 데이터가 정규 분포를 따르는 경우 일원 분산 분석을 사용합니다.
    2. 데이터가 정규 분포를 따르지 않는 경우 Kruskal-Walli 검정, 스튜던트 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 적용합니다.
  2. 각 그룹 내의 성별 차이를 평가할 때는 데이터 분포에 따라 학생의 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 사용합니다. 통계적 유의성은 p-값 <0.05로 결정됩니다.
    참고: 모든 분석은 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 수행해야 합니다. 여기에서는 GraphPad Prism 8을 사용합니다.
  3. 히스토그램, Q-Q 도표 및 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 데이터의 정규성을 평가하고 행동 실험 결과를 분석합니다.
    1. 데이터가 정규 분포를 따르는 경우 Two-Way ANOVA를 사용합니다.
    2. 정규 분포를 따르지 않는 데이터의 경우 Kruskal-Walli 검정, 스튜던트 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 수행합니다.
    3. 데이터 분포에 따라 학생의 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 각 그룹 내의 성별 차이를 평가합니다. 다시 말하지만, p-값이 0.05< 경우 통계적으로 유의한 결과를 고려합니다.
  4. 면역조직화학 분석의 경우 Two-Way ANOVA를 사용한 다음 Tukey의 사후 검정을 사용하여 여성 그룹과 남성 그룹을 비교합니다.
  5. 각 저산소증 상태 내에서 여성과 남성 그룹을 비교하려면 Sidak의 사후 테스트를 사용하십시오. 통계적 유의성은 p-값이 0.05< 경우 결정됩니다.

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결과

본 연구에서는 임신한 Balb/c 마우스를 분만 중 8% O2 (중증), 10% O2 (중등도) 및 12% O2 (경증)의 저산소 상태에 노출시켰으며, 신생아 마우스를 이러한 저산소 상태에서 5분 동안 유지하여 경증, 중등도 및 중증 신생아 저산소증 모델을 확립했습니다. 가짜 대조군으로 지정된 그룹은 정상 산소(21% O2) 출생 조건을 거친 후 표준 보호 조건에서 살 수 있었습니다. 이는 다양한 산소 농도가 마우스에 미치는 실제 영향을 분리하여 실험 결과의 유효성을 보장하는 데 도움이 됩니다.

신생아 저산소증 모델을 확립한 후, 신생아 뇌에서 저산소 노출의 영향을 감지하기 위해 면역조직화학적 염색(HIF1α 및 H&E 염색)을 위해 신생아 마우스 그룹을 희생했습니다. 생후 2개월이 된 나머지 쥐에 대해 행동 테스트를 수행했습...

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토론

신생아의 주요 건강 문제인 주산기 저산소증은 중요한 발달 과정을 방해하여 분자, 세포 및 신경 변화를 유발할 수 있으며 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 비롯한 다양한 신경 발달 장애와 관련이 있습니다1. 중증 저산소증의 즉각적인 영향에 대해서는 널리 연구되어 왔지만, 주산기 기간 동안 경증에서 중등도의 저산소증의 장기적인 결과는 잘 알려져 있지 않습니다. 본 연구는 신생아 저산소증의 신경행동학적 및 분자적 결과를 조사하여 두 영역에서 유의미한 변화를 밝혀냄으로써 이러한 간극을 메우는 것을 목표로 했습니다. 이를 달성하기 위해 우리는 신생아 저산소증에 대한 다단계 마우스 모델을 수행한 후 포괄적인 조직병리학적, 행동적, 분자 분석을 수행했습니다. 이 프로토콜은 임상 환경에서 일반적으로 관찰되는 경증에서 중등도의 저산소 현상을 재현하도록 설계되었으며, 이는 덜 치명적이지만 여전히 장기적인 효과를 유발할 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 터키 과학기술연구위원회(TÜBİTAK)의 지원을 받았으며, 저자는 Celalettin Göktaş(유전자 변형 동물 시설)와 생물학자 Selda Taşdemir(행동 실험실)에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(-20 & deg; C) 냉동고지멘스 KD86NAWE0N
(+4 & deg; C) 블록안타젠 생명과학https://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 & deg; C) 냉장고지멘스 KD86NAWE0N
(-20 & deg; C) 블록클리버 사이엔티픽https://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
절대 에탄올머크1070172511
아세테이트 암모늄시그마238074-500G
분석 균형그리고 nbsp; 아담 장비LAB214i
클로로포름머크1024451000
구연산  머크100241
컴퓨터HPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
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엔텔란 머크107961
이오신머크109844
에펜도르프 (1.5 mL)?sollab078.03.021
에토비전 시스템놀두스https://noldus.com/ethovision-xt
에투브누브EN 400/500 해당 없음
팔콘 튜브 (15 mL)아이솔랩078.02.001
포름알데히드머크104002
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HIF-1&알파; 항체바이오스bs-20398R 
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등프로필머크1096342511
라이트 사이클러 480 II로슈5015278001
대리석 매장 시험의 케이지비슈누와 nbsp;https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)그라이너616201
마이크로피펫 팁 (100 및 마이크로; L)그라이너774353
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사회적 상호작용 테스트의 세 개의 챔버글로벌 바이오테크118
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주사기 (2 mL)바이비https://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
테일 서스펜션 테스트 설정Self Made, 하버드 어퍼러터스에서 비슷한 자료를 찾을 수 있습니다Self Made, 비슷한 사이트는 (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)에서 찾을 수 있습니다.
열믹서에펜도르프#5355
트리즈마 기지시그마1503-1KG
소용돌이하이돌프541-10000-00-1
자일렌 Isolab 9,90,01,92,501

참고문헌

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