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방법 논문

단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 Daurian 땅다람쥐의 간 이식 후 관리 및 표본 수집

581 조회수

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DOI:

10.3791/68443

⸱

2025년 9월 16일

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Daurian 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus), 전형적인 계절 동면자입니다. 여기에는 예후 평가를 위해 간 이식편과 혈액 샘플을 채취하고 단일 세포 기반 연구를 위해 처리하는 방법이 포함됩니다.

초록

이식편 기능 회복 및 이식편-숙주 면역적합성은 간 이식 후 주요 예후 문제를 나타냅니다. 결정적으로, 쥐나 생쥐를 사용하는 기존의 설치류 모델은 보존 중 저체온증으로 인한 이식편 손상의 메커니즘에 대한 제한된 통찰력을 제공합니다. 이러한 격차는 대체 모델의 필요성을 강조합니다. 추위에 적응하는 다우리안 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus)는 장기간 냉기 보존을 유지할 수 있으므로 이식 후 DGS에서 높은 생존율을 지원하므로 이 프로토콜은 이식된 DGS 피험자에게 필요한 필수 수술 후 동물 관리 및 생리학적 모니터링을 자세히 설명합니다. 또한 전사체 프로파일링 및 조직병리학적 검사를 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 포함하여 다운스트림 분석 기술을 위한 고품질 간 이식편 샘플을 준비하기 위한 표준화된 절차를 제공합니다. 잘 준비된 DGS 이식편 표본을 성공적으로 생성하는 것은 이 틀에 얽매이지 않으면서도 관련성이 높은 모델을 연구하기 위해 전통적 방법론과 최첨단 방법론을 모두 적용하는 중요한 초기 단계입니다. 이 프로토콜은 DGS에 대한 다중 오믹 정보를 처리하여 동면 설치류뿐만 아니라 다른 특수 유기체에서도 외과적 개입 및 질병 모델링에 대한 향후 연구를 용이하게 합니다.

서론

지난 20년 동안 점점 더 많은 연구자들이 동면 종의 우수한 적응 능력이 생물학적 적응의 새로운 메커니즘을 발견할 수 있는 귀중한 기회를 제공하고 장기 보존 및 대사 재활과 같은 다양한 의료 분야에서 돌파구를 불러일으킬 수 있음을 인식했습니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 간 장기간 냉기 보존 및 동면 자식자인 다우리안 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus)가 최근에 설립되었습니다. 분명히 DGS의 저온 적응 특성은 기증자 이식편의 장기간 냉장 보관과 수혜 동물의 높은 이식 후 생존율을 가능하게 합니다. 따라서 수술 후 동물 회복을 모니터링하고 다양한 조직병리학적 및 오믹스 연구를 위한 샘플을 준비하기 위한 후속 프로토콜이 필요합니다.

DGS와 표준 설치류 모델 사이의 상당한 생리학적 차이와 수혜 동물의 복잡하고 역동적인 간 이식 후 생리학적 변화를 감안할 때, DGS로부터 고품질 샘플을 얻는 것은 다운스트림 분석에 매우 중요하므로 이식 후 이식편-숙주 생리학에 대한 이해에 중요합니다. 기존 방법으로 혈액 및 간 조직 샘플을 조달, 처리 및 검사하는 것 외에도 간세포인 간 실질 세포와 내피 세포, 성상 세포, Kupffer 세포 및 기타 면역 세포를 포함하는 비실질 세포(NPC)를 성공적으로 해리하면 빠르게 발전하는 단일 세포 기반 다중 오믹스와 복잡한 수술 후 세포 및 분자 상호 작용을 밝힐 수 있습니다. 이를 위해 고전적인 콜라게나제 관류 기반 방법은 1950년대 초반부터 개발되어 왔으며 지속적으로 개선되었습니다 9,10,11. 그럼에도 불구하고 DGS 간의 뚜렷한 해부학적 구조, 혈관 재건으로 인한 수술 후 유착 및 간 이식편의 수술로 인한 생리학적 변화는 모두 발치 조건의 미세 조정을 요구합니다.

이 프로토콜은 간 이식 후 DGS의 수술 후 관리 및 샘플 수집에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 높은 수율 및 세포 생존력으로 간 이식편에서 간세포를 분리할 수 있게 하며, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 위한 분리된 간세포의 후속 처리를 자세히 설명합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 북경대학교 동물 관리 및 사용 기관 위원회(LSC-WangSQ-2)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 DGS는 장자커우시 초원에서 포획된 임신한 여성 DGS에 의해 실험실에서 생산되었습니다. 실험 당시 동물의 나이는 약 1-2세였습니다. 남성과 여성 모두 무게가 180g에서 400g 사이인 DGS가 기증자 및 수혜자로 활용되었습니다. 수혜자의 체중은 기증자의 체중보다 약간 더 컸으며 그 차이는 50g 미만이었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 이식 후 관리

  1. 간 이식 후 DGS를 12:12 명암 주기의 따뜻하고 깨끗한 환경에 보관하고 표준 실험실 차우와 물을 자유롭게 제공합니다.
  2. 매일 체중을 모니터링하고, 출혈 여부를 평가하고, 수뇌부의 정신 상태와 활동 수준을 관찰합니다.
  3. 수술 직후 3일 동안 12시간마다 세푸록심(16mg/kg)과 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 피하주사한다.
  4. 조직 수확 24시간 전까지 매일 타크로리무스(1mg/kg)를 근육 주사합니다.
    참고: DGS는 주로 자연에서 잡은 것에서 파생되기 때문에 이식 면역학적 요인은 무시할 수 없습니다. DGS 간의 이식은 동종 이식(동계 이식이 아님)으로 간주됩니다. 연구에서 거부반응과 같은 면역학적 요인을 배제해야 하는 경우 수술 후 기간에 타크로리무스가 표준화되었는지 확인하십시오.

2. 간 이식편 샘플 준비

  1. 용액 및 기기 준비
    1. 500 μM EGTA와 함께 50 mL의 HBSS를 준비합니다(Ca2+- 및 Mg2+ 없음, pH 7.4). 사용하기 전에 40°C 수조에서 예열하십시오.
    2. 콜라게나제 IV(0.4mg/mL)를 50mL의 HBSS(Ca2+ 및 Mg2+ 포함)에 용해시키고 40°C 수조에서 30분 동안 배양합니다.
    3. Percoll 용액: Percoll을 10× PBS와 9:1(v/v) 비율로 혼합하고 1× PBS로 9:1(v/v) 비율로 희석하여 15mL 튜브에 넣습니다. 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: DGS당 5mL 90% Percoll 용액으로 충분합니다.
    4. 사용하기 전에 수술 기구를 70% 에탄올에 30분 동안 담그십시오.
    5. 속도 조절이 가능한 연동 펌프, 실라스틱 튜브 및 수조로 구성된 관류 시스템을 조립합니다. 따뜻한 식염수로 튜브를 세척하여 기포를 제거하고 멸균 0.22μm 필터를 튜브 배출구에 부착합니다.
      참고: 기포를 퍼지하기 전에 70% 에탄올을 15분 동안 완전히 실행하여 재사용된 튜브를 헹구고 잔류 에탄올을 제거하기 위해 ddH2O로 15분 동안 완전히 헹구어야 합니다.
  2. 동물 시술
    1. 1mL/100g 체중의 용량으로 2.5% 트리브로모에탄올을 복강내 주사 하여 이식 후 DGS를 마취합니다. 완전한 마취를 보장하기 위해 발가락 꼬집기에 대한 반응과 같은 반사 상실 테스트를 수행합니다.
    2. 복부 털을 면도하고 복부가 위를 향하도록 수술판에 DGS를 고정합니다.
    3. 동물의 복부에 70% 에탄올을 뿌린 다음 날카로운 가위와 톱니 집게로 피부와 복막을 크게 십자형으로 절개하여 복강을 엽니다.
    4. 간 이식편, 문맥(PV) 및 하대정맥(IVC)이 명확하게 노출될 때까지 면봉으로 장을 복강 바깥쪽으로 부드럽게 움직입니다(그림 1A).
      참고: 간 이식 후 복강의 수술 후 유착으로 인해 젖은 면봉을 사용하여 유착을 부드럽게 해부합니다.
    5. 문합 장루 아래 IVC에 5mL 주사기를 삽입하여 1-2mL의 혈액을 채취하고, 혈관에서 바늘을 빼낸 후 즉시 마른 면봉으로 천자 부위에 가벼운 압력을 가하여 지혈을 얻습니다(그림 1B).
      참고: 출혈을 최소화하기 위해 바늘을 약 30G인 1mL 주사기의 바늘로 교체할 수 있습니다.
    6. 베벨업 방향으로 22G 카테터를 사용하여 혈관 표면에 대해 15° 각도로 PV를 부드럽게 구멍을 뚫은 다음 카테터의 바늘을 집어넣습니다. 성공적인 천자가 확인되면 캐뉼라를 혈관을 통해 1-1.5cm 더 부드럽게 전진시킵니다. 혈관 클램프를 사용하여 캐뉼라의 위치를 고정합니다(그림 1C).
      알림: 캐뉼라가 올바르게 배치되면 혈액의 역류가 보입니다. PV 캐뉼라 삽입이 실패하거나 기술적인 문제가 발생하면 간하 IVC 캐뉼라 삽입으로 전환하고 PV를 관류액 유출 경로로 지정하십시오.
    7. 따뜻한 식염수로 6-8mL/min으로 관류 펌프를 시작한 다음 위에서 언급한 0.22μm 필터를 캐뉼라에 연결합니다.
    8. PV 를 통한 관류가 시작되면 IVC를 절개하여 혈액 배출을 허용합니다. 적절한 관류를 위해서는 50-80mL의 식염수가 필요합니다(그림 1D).
      참고: 성공적인 관류는 이 과정에서 이식된 간이 옅은 황백색으로 전환될 때 확인됩니다. 일부 짙은 빨간색 울혈 부위는 간 표면에 남아 완전히 제거되지 않을 수 있으며, 이는 허혈-재관류 손상과 같은 수술 중 간 외상으로 인해 발생할 수 있습니다.
    9. 50-80mL의 따뜻한 식염수로 적절한 관류를 한 후 펌프를 일시 중지합니다.
    10. 2-0 실크 봉합사를 사용하여 기저부에서 왼쪽 외측엽을 결찰한 다음 결찰 부위의 원위 엽을 절제합니다. 유사하게, 정중엽은 기저부에서 결찰되고 동일한 방법을 사용하여 절제됩니다(그림 1E,F).
      참고: 부분 간 절제술은 여러 실험 목적으로 이식된 간의 활용을 극대화하고 간의 철저한 소화를 촉진하면서 콜라게나제 완충액의 소비를 줄이기 위해 수행됩니다.
    11. 절제된 간 조직을 여러 조각으로 나눕니다: 한 부분은 NPC 분리에 사용된 다음 scRNA-seq에 사용되고, 다른 부분은 조직학적 절편을 위해 4% 파라포름알데히드에 고정되거나 다른 실험을 위해 액체 질소에서 급속 동결됩니다.
      알림: 2.2.11단계는 시간 절약을 위해 다음 단계와 동시에 다른 사람이 수행할 수 있습니다.
    12. NPC의 분리. RPMI-1640 배지에서 조직을 약 1-2mm3 조각으로 자르고 제조업체의 지침에 따라 gentleMACS로 효소 분해합니다( 재료 표 참조). 세포 생존율과 세포 농도는 자동 세포 계수기를 사용하여 결정되었습니다.
      참고: 2.2.12단계와 2.2.13-2.3.5단계는 동시에 진행됩니다.
    13. 횡격막을 자르고 간상 IVC를 고정합니다(그림 1G).
    14. 입구 튜브를 예열된 EGTA 완충액으로 옮깁니다. 6-8mL/min의 속도로 펌프를 다시 시작합니다.
    15. 주기적으로 고정amp 간 실질 전체에 균일한 관류액 분포를 촉진하기 위해 5-10초 동안 IVC를 고정합니다. 간은 클램핑하는 동안 눈에 띄게 부풀어 오르고 풀리면 이완됩니다.
      참고: 장기간의 막힘은 간을 둘러싼 얇은 결합 조직을 파열시키고 간 모세혈관층의 관류 또는 유체 역학을 방해할 위험이 있으므로 장기간의 배액 중단을 피하는 것이 중요합니다. 또한, 지속적인 폐쇄는 기계적 힘에 대한 간세포 민감성으로 인해 세포 생존력을 손상시키고 수율을 감소시킬 수 있습니다.
    16. 40-50mL의 EGTA 용액으로 관류한 후, 8-10분 동안 4-6mL/min의 속도로 콜라게나제 완충액 관류를 시작합니다. 위의 단계와 같이 유출 혈관을 잠깐 고정합니다(그림 1H).
      참고: 콜라게나제 관류 5-6분 후 간이 눈에 띄게 부드러워지고 표면 균열이 나타납니다. 이러한 형태학적 변화가 없으면 관류 속도를 3-4mL/min으로 줄이고 총 소화 시간을 12-13분으로 연장합니다. 50mL 콜라게나제 관류가 완료되면 간은 부서지기 쉬운 두부 같은 일관성을 나타내며, 이는 충분한 소화의 지표입니다(그림 1I).
    17. 펌프를 멈추고 캐뉼라를 제거합니다. 몸에서 간을 잘라내고 얼음처럼 차가운 DMEM/F12 배지 10mL와 함께 5cm 접시에 넣습니다.
  3. 간세포 정제
    1. 간을 찢어 세포를 방출하고 세포 용액을 위에 70μm 필터를 놓은 50mL 원뿔형으로 옮깁니다.
    2. 세포 현탁액을 4°C에서 3분 동안 50 x g 로 원심분리한 후, 상청액을 버리고 펠릿을 20mL 1× PBS로 재현탁합니다. 이 단계를 3회 반복합니다. 마지막 원심분리 후 세포 펠릿을 5mL DMEM/F12 배지로 재현탁합니다.
    3. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 같은 부피의 90% Percoll 용액과 부드럽게 혼합합니다. 4°C에서 10분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다.
      참고: Percoll 원심분리 후, 혼합물은 세 개의 별개의 층으로 분리됩니다: 최상층(약 0.5-1mL)에는 죽은 세포가 포함되어 있고 생존 가능한 간세포는 최하층(약 0.5-0.8mL)에 농축됩니다(그림 2). 생존율이 >80%인 5-8 × 107개의 생존 가능한 간세포의 수율은 일반적으로 이 프로토콜로 얻어집니다. (그림 3A,B).
    4. 죽은 세포와 상청액을 조심스럽게 흡인하여 층의 격렬한 교란을 피하고 10mL DMEM/F12 배지로 생존 세포를 재현탁합니다. 4°C에서 5분 동안 50 x g 에서 원심분리합니다.
    5. 상청액을 버리고 정제된 간세포를 2% 소 태아 혈청으로 보충된 1-5mL 1× PBS로 최종 농도 500-1200 cells/μL로 재현탁합니다.
    6. 간세포와 NPC를 1:1의 양비율로 혼합하여, 10,000개의 간세포와 10,000개의 NPC를 혼합하여 세포 현탁액을 제조하였다.
  4. ScRNA-seq
    참고: 단계 2.4.1-2.4.3은 액적 기반 단일세포 3' 유전자 발현 라이브러리 준비 키트12의 사용자 가이드에 따라 수행되었다. 액적 기반 미세유체 단일 세포 분할 및 바코드 플랫폼이 사용되었으며, 이는 표준 프로토콜에 따른 겔 비드 인 에멀젼(GEM) 생성, cDNA 라이브러리 구성 및 Illumina 시퀀싱의 중요한 단계를 포함합니다.
    1. GEM 생성 및 바코드를 수행하려면 20,000개의 간세포와 NPC가 포함된 세포 현탁액을 사용하십시오. 세포 포획 효율은 60% 이상입니다.
    2. cDNA 증폭을 위해, 사용자 가이드12에 따라 포스트 GEM-RT 샘플을 세척한다.
    3. 도서관 구축
    4. 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 단일 세포 RNA 라이브러리를 시퀀싱하여 샘플당 150Gb의 깊이를 달성합니다. Cell Ranger(v8.0.0)를 사용하여 원시 기본 호출 파일을 FASTQ 파일로 역다중화합니다.
    5. 발현 정량화를 위해 FASTQ 파일을 Ictidomys tridecemlineatus 게놈(NCBI 가입: GCF_016881025.1)에 정렬하여 실험 워크플로를 완료합니다.

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결과

4°C에서 24시간 동안 보관하고 DGS에 이식한 이식편의 조직학적 검사에서 수술 후 3일과 6일에 염증, 괴사 또는 담즙정체의 징후가 최소화된 정상적인 간 소엽 구조가 가짜 수술 그룹과 비교할 수 있는 것으로 나타났습니다(그림 4A-C).

수술 후 DGS에서 일차 간세포를 분리하는 데는 약 1시간이 걸립니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 약 80%의 세포 생존율로 5 × 107개 이상의 간세포를 얻을 수 있습니다(그림 3A,B). 분리된 일차 간세포를 후속 scRNA-seq 분석을 위해 간 NPC와 혼합되었고 클러스터링 분석을 통해 12개의 세포 유형이 밝혀졌습니다(그림 5).

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토론

DGS에서 기증자 간 냉간 보존 및 이식을 설명하는 프로토콜에 따라 여기에 설명된 절차는 최소 24시간 동안 냉장 보관된 간과 함께 이식된 DGS의 수술 후 모니터링 및 맞춤형 약리학적 관리를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 이식 후 7일 이상 수혜자의 생존을 가능하게 하며, 표준 설치류 모델에 비해 장기 보존13,14 및 이식을 위한 연구 모델로서 동면자의 분명한 이점을 보여줍니다.

여기서, 2단계 콜라게나제 관류 절차는 고유한 DGS 간 질감 특성에 적응하도록 수정되었습니다(그림 6). 조정된 효소 농도(0.4mg/mL 콜라게나제) 및 소화 시간(8-10분)은 분리된 간세포의 생존율을 80% 이상으로 가져왔습니다. 이는 신뢰할 수 있는 전사체 프로파일링을 위...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 비전염성 만성질환-국가과학기술전공사업(2023ZD0507600), 국가자연과학재단 보조금(82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), 국가 R&D 프로그램(2024YFA0916804), 절강대학교 교육재단 학자 Shusen Lanjuan Talent Foundation.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1× PBS서비스바이오지4202
10× PBS서비스바이오지4207
4% 파라포름알데히드바이오샤프BL539A
부프레노르핀샤페이H12020276
캐뉼라 (22g)브브라운4254090B
세푸록심셀렉E4838
세포 배양 접시 (60mm)둥지705001
콜라게나제 IV시그마-알드리치C5138
원뿔형 튜브(15mL)둥지601052
원뿔형 튜브(50mL)둥지602052
면봉가정용품점
Countstar 자동 세포 계수루이유카운트스타 리겔 S2
DMEM/F12지비코C11330500BT
에그타시그마-알드리치E4378
FBS깁코10099-141
필터(0.22 & m)머크 밀리포어SLGP033RB
필터(70 & m)바이오로직스15-1070
젠틀맥스밀테니130-093-235
HBSS(Ca2+ 및 Mg2+ 포함)서비스바이오지4204
HBSS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)서비스바이오지4203
NPC 해리 키트밀테니130-096-730
퍼콜사이티바17-0891-09
연동 펌프유옌BT100 시리즈
RPMI-1640 시리즈지비코C11875500BT
생리SRBSRB009
시퀀서일루미나 노바시크 X 플러스
실라스틱 튜빙타이곤E-3603
실크 봉합사에티콘SA845G
주사기 (1mL)리게 사이언스LG05-124주사기 바늘만 필요합니다
주사기 (2mL)리게 사이언스LG05-124주사기 배럴만 필요합니다
타크로리무스셀렉S5003 시리즈
이송 피펫바이오로직스30-0138A1
트리브로모에틸알코올시그마-알드리치티48402
수조시SAP2

참고문헌

  1. Ou, J., et al. IPSCs from a hibernator provide a platform for studying cold adaptation and its potential medical applications. Cell. 173 (4), 851-863 (2018).
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  12. User guides. , X Genomics. https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1725314293/support-documents/CG000731_ChromiumGEM-X_SingleCell3v4_UserGuide_RevB.pdf (2024).
  13. Hadj-Moussa, H., Storey, K. B. Bringing nature back: Using hibernation to reboot organ preservation. FEBS J. 286 (6), 1094-1100 (2019).
  14. Ratigan, E. D., McKay, D. B. Exploring principles of hibernation for organ preservation. Transplant Rev (Orlando). 30 (1), 13-19 (2016).
  15. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  16. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).

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