여기에서는 표준 설치류 모델에서 기술적으로 어려운 Daurian 땅다람쥐(DGS)에서 장기 간 냉장 보관 및 이식 모델을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
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여기에서는 표준 설치류 모델에서 기술적으로 어려운 Daurian 땅다람쥐(DGS)에서 장기 간 냉장 보관 및 이식 모델을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
간 이식에서 장기간 냉장 보관 후 기증자 이식편의 기능적 회복은 주요 과제입니다. 동일한 장애물이 잘 확립된 수술 프로토콜에도 불구하고 간 이식을 위한 표준 설치류 모델(예: 생쥐 및 쥐)에 적용되어 이식 후 기능 회복 및 숙주 이식 면역 적합성과 같은 주요 주제에 대한 연구를 제한합니다. 여기에서 우리는 절대적 동면기인 Daurian 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus)는 매우 깊은 저체온증-재온화 및 허혈-재관류 전환에 대한 내재적 적응을 보여줍니다. 우리 손에서 24시간 냉장 보관 후 간 이식을 이식한 결과 DGS 수혜자는 7일 관찰 기간 내에 100% 생존한 반면, Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 동일한 절차는 수술 후 24시간 동안 0%의 생존율을 보였습니다. 따라서 DGS 및 기타 추위 적응 포유류 모델은 장기 저온 적응 및 이식 내성의 기저에 있는 메커니즘을 조사할 수 있는 독특하고 강력한 플랫폼을 제공하며, 이는 이식 의학 분야에서 새로운 치료 또는 수술 전략의 개발을 지원할 수 있습니다.
냉간 재가온 및 허혈 재관류는 간 이식 손상의 중요한 원인이며 조기 동종 이식 기능 장애의 위험을 증가시킵니다. 생쥐 및 쥐와 같은 표준 설치류 유기체에 대한 간 이식이성공적으로 확립되었지만1,2, 이러한 추위에 대한 내성이 없는 종에 대한 연구가 추위 적응 메커니즘에 대한 제한된 통찰력을 제공하기 때문에 장기 보존 및 이식 의학의 발전은 방해를 받았습니다.
적절한 추위 적응 종에서 이식 연구 모델을 개발하면 이러한 격차를 메울 수 있습니다. 예를 들어, 포유류 동면동물은 낮은 주변 온도 및/또는 식량 부족의 오랜 기간 동안 생존하기 위해 진화했습니다 3,4. 동면 동안, 그들의 생리학적 변화는 삐죽삐죽 각성 상태와 간헐적 각성 상태의 주기로 전환되어 낮은 심부 체온을 유지하고 빠른 재온난과 혈액 재관류를 견디는 데 잘 적응합니다. 놀랍게도, 동면을 할 수 있는 땅다람쥐는 활동적인 진열 상태에서도 허혈-재관류 손상에 대해 쥐보다 더 많은 회복력을 보여줍니다 5,6. 최근 몇 년 동안 동면기에서 영감을 받은 연구는 냉장 보관으로 인한 부상을 크게 완화하고 동면하지 않는 종에서 분리된 조직 및 장기의 기능 회복을 개선하기 위해 조절할 수 있는 몇 가지 냉기 적응 메커니즘과 약물 투여 가능한 표적을 공개했습니다 7,8,9,10,11.
쥐 12,13,14의 간 이식을 위해 개발된 프로토콜에서 채택된 여기에서는 Daurian 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus)는 중국 북부에 서식하는 동면 설치류 종입니다. 우리 손에서 DGS 이식 수혜자는 위스콘신 대학교(UW) 용액에서 24시간 동안 4°C에서 보관된 진온(활성) 또는 저체온(토르피드) 기증자의 이식편으로 이식 후 100% 생존을 가졌습니다. 이와는 대조적으로, 동일한 워크플로우를 적용한 Sprague-Dawley(SD) 쥐의 생존율은 0%였으며, 이는 DGS 간 이식 모델의 이점을 명확하게 보여줍니다. DGS 또는 13줄의 땅다람쥐(Ictidomys tridecemlineatus) 및 시리아 햄스터(Mesocricetus auratus)와 같은 다른 실험실에서 사육된 추위에 적응한 종의 다른 장기의 장기 냉장 보관 및 이식도 가능할 것으로 기대되며, 이를 통해 연구자들은 장기적인 이식 기능 회복 및 숙주-이식 호환성을 연구하고 신약을 테스트할 수 있는 독특한 기회를 얻을 수 있습니다.
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모든 동물 실험은 베이징 대학교 동물 관리 및 사용 기관 위원회(LSC-WangSQ-2)의 승인을 받았습니다. 연구에 사용된 적절한 도구는 재료 표에 나열되어 있으며 그림 1에 나와 있습니다.
참고 : 실험실 환경에서 13 줄 지어 있는 땅 다람쥐와 같은 야생 포획 동면 설치류 종의 취급 및 번식이 설명되었습니다15,16. 이 연구에 사용된 DGS는 장자커우(Zhangjiakou)시의 초원에서 포획된 암컷 임산부 DGS에 의해 실험실에서 생산되었습니다. 실험 당시 그들은 약 1-2살이었습니다. 원래 임신한 암컷 DGS의 경우, 동물이 실험실에 도착하기 전에 기생충이 추방되었습니다. 동물이 도착하자마자 일반적인 바이러스에 대한 검역 및 검사가 이루어졌으며, 검사 결과가 음성인 동물은 시설에서 사육했습니다.
1. 수술 전 준비
2. 기부자 운영
3. 생체 외 이식편 준비
알림: 열린 얼음 용기를 준비합니다. 뒷 테이블 전체가 얼음 위에서 준비되었습니다.
4. 수신자 작업
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평균 수술 소요 시간은 다음과 같다: 기증자 수술 평균 24.8± 2.3분, 백테이블 수술 15.4± 1.3분, 수혜자 수술 52.7± 5.1분, 무간기 14.2± 1.5분이었다.
차가운 UW 용액에서 24시간 동안 보존된 간 이식 수혜자는 이식 전 동면 상태(n = 8) 또는 그렇지 않았는지(n = 4) 여부에 관계없이 이식 후 7일에 100% 생존율을 보였습니다(그림 9). 7일째에는 혈관 폐색이 관찰되지 않았다. 모든 간 동맥은 스텐트 기술에 의해 관류된 상태로 유지되었습니다. 대조적으로, 역시 저온 UW 용액에서 24시간 동안 보존된 다른 SD 쥐로부터 간 이식을 받은 모든 SD 쥐는 이식 후 12시간 이내에 굴복했습니다(n = 9).
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Kamada의 더블 커프 기법2를 기반으로 DGS에서 최초의 정소성 간 이식 모델을 성공적으로 확립했습니다. DGS와 전통적인 랫드 모델 간의 해부학적 차이로 인해 재료 준비, 수술 절차 및 수술 후 관리에 대한 특정 고려 사항이 필수적입니다.
동면 및 지방 비축량과 같은 요인은 150g에서 400g에 이르는 성인 DGS의 상당한 개별 체중 변화에 기여하며 남성과 여성 간에 현저한 차이가 있습니다. 따라서 기증자와 수혜자를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 이상적으로는 수혜자의 체중이 기증자보다 약간 더 나가야 하며 체중 차이가 50g을 넘지 않아야 합니다.
DGS의 혈관 직경은 크기와 성별에 따라 크게 다릅니다. PV 및 IHIVC 문합을 최적으로 선택하기 위해 5-F에서 8-F 범위의 커프를 수술 전 준비하는 것이 좋습니...
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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
이 연구는 비전염성 만성질환-국가과학기술전공프로젝트(2023ZD0507600)와 중국국가자연과학재단(82371794 및 82170671)의 지원을 받았다. 이 작업은 또한 Zhejiang University Education Foundation, Academician Shusen Lanjuan Talent Foundation의 후원을 받았습니다. 또한 위스콘신 대학교 오시코시 캠퍼스의 Dana K. Merriman 교수에게 13줄의 땅다람쥐를 사육하는 데 기여하고 실험실에서 동면 설치류 모델을 사육하는 데 도움이 되는 통찰력과 경험을 아낌없이 공유해 주신 것에 대해 감사드립니다.
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