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방법 논문

Liver Cold Storage and Transplantation in the Cold Adaptive Daurian 땅다람쥐

1.4K 조회수

DOI:

10.3791/68444

2025년 7월 3일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 표준 설치류 모델에서 기술적으로 어려운 Daurian 땅다람쥐(DGS)에서 장기 간 냉장 보관 및 이식 모델을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

간 이식에서 장기간 냉장 보관 후 기증자 이식편의 기능적 회복은 주요 과제입니다. 동일한 장애물이 잘 확립된 수술 프로토콜에도 불구하고 간 이식을 위한 표준 설치류 모델(예: 생쥐 및 쥐)에 적용되어 이식 후 기능 회복 및 숙주 이식 면역 적합성과 같은 주요 주제에 대한 연구를 제한합니다. 여기에서 우리는 절대적 동면기인 Daurian 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus)는 매우 깊은 저체온증-재온화 및 허혈-재관류 전환에 대한 내재적 적응을 보여줍니다. 우리 손에서 24시간 냉장 보관 후 간 이식을 이식한 결과 DGS 수혜자는 7일 관찰 기간 내에 100% 생존한 반면, Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 동일한 절차는 수술 후 24시간 동안 0%의 생존율을 보였습니다. 따라서 DGS 및 기타 추위 적응 포유류 모델은 장기 저온 적응 및 이식 내성의 기저에 있는 메커니즘을 조사할 수 있는 독특하고 강력한 플랫폼을 제공하며, 이는 이식 의학 분야에서 새로운 치료 또는 수술 전략의 개발을 지원할 수 있습니다.

서론

냉간 재가온 및 허혈 재관류는 간 이식 손상의 중요한 원인이며 조기 동종 이식 기능 장애의 위험을 증가시킵니다. 생쥐 및 쥐와 같은 표준 설치류 유기체에 대한 간 이식이성공적으로 확립되었지만1,2, 이러한 추위에 대한 내성이 없는 종에 대한 연구가 추위 적응 메커니즘에 대한 제한된 통찰력을 제공하기 때문에 장기 보존 및 이식 의학의 발전은 방해를 받았습니다.

적절한 추위 적응 종에서 이식 연구 모델을 개발하면 이러한 격차를 메울 수 있습니다. 예를 들어, 포유류 동면동물은 낮은 주변 온도 및/또는 식량 부족의 오랜 기간 동안 생존하기 위해 진화했습니다 3,4. 동면 동안, 그들의 생리학적 변화는 삐죽삐죽 각성 상태와 간헐적 각성 상태의 주기로 전환되어 낮은 심부 체온을 유지하고 빠른 재온난과 혈액 재관류를 견디는 데 잘 적응합니다. 놀랍게도, 동면을 할 수 있는 땅다람쥐는 활동적인 진열 상태에서도 허혈-재관류 손상에 대해 쥐보다 더 많은 회복력을 보여줍니다 5,6. 최근 몇 년 동안 동면기에서 영감을 받은 연구는 냉장 보관으로 인한 부상을 크게 완화하고 동면하지 않는 종에서 분리된 조직 및 장기의 기능 회복을 개선하기 위해 조절할 수 있는 몇 가지 냉기 적응 메커니즘과 약물 투여 가능한 표적을 공개했습니다 7,8,9,10,11.

12,13,14의 간 이식을 위해 개발된 프로토콜에서 채택된 여기에서는 Daurian 땅다람쥐(DGS; Spermophilus dauricus)는 중국 북부에 서식하는 동면 설치류 종입니다. 우리 손에서 DGS 이식 수혜자는 위스콘신 대학교(UW) 용액에서 24시간 동안 4°C에서 보관된 진온(활성) 또는 저체온(토르피드) 기증자의 이식편으로 이식 후 100% 생존을 가졌습니다. 이와는 대조적으로, 동일한 워크플로우를 적용한 Sprague-Dawley(SD) 쥐의 생존율은 0%였으며, 이는 DGS 간 이식 모델의 이점을 명확하게 보여줍니다. DGS 또는 13줄의 땅다람쥐(Ictidomys tridecemlineatus) 및 시리아 햄스터(Mesocricetus auratus)와 같은 다른 실험실에서 사육된 추위에 적응한 종의 다른 장기의 장기 냉장 보관 및 이식도 가능할 것으로 기대되며, 이를 통해 연구자들은 장기적인 이식 기능 회복 및 숙주-이식 호환성을 연구하고 신약을 테스트할 수 있는 독특한 기회를 얻을 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 베이징 대학교 동물 관리 및 사용 기관 위원회(LSC-WangSQ-2)의 승인을 받았습니다. 연구에 사용된 적절한 도구는 재료 표에 나열되어 있으며 그림 1에 나와 있습니다.

참고 : 실험실 환경에서 13 줄 지어 있는 땅 다람쥐와 같은 야생 포획 동면 설치류 종의 취급 및 번식이 설명되었습니다15,16. 이 연구에 사용된 DGS는 장자커우(Zhangjiakou)시의 초원에서 포획된 암컷 임산부 DGS에 의해 실험실에서 생산되었습니다. 실험 당시 그들은 약 1-2살이었습니다. 원래 임신한 암컷 DGS의 경우, 동물이 실험실에 도착하기 전에 기생충이 추방되었습니다. 동물이 도착하자마자 일반적인 바이러스에 대한 검역 및 검사가 이루어졌으며, 검사 결과가 음성인 동물은 시설에서 사육했습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 실험 동물
    1. 체중이 180g에서 400g 사이인 1-2세의 남녀 성인 DGS를 기증자 및 수혜자로 사용하십시오. 수혜자의 체중은 기증자의 체중보다 약간 더 컸으며, 그 차이는 50g 미만이었다.
    2. 체중이 200-300g인 수컷과 암컷 모두 8-10주인 성인 SD 쥐를 대조군의 기증자 및 수혜자로 사용하십시오. 전체 실험 과정에서 수술용 마스크, 실험실 가운, 니트릴 장갑을 착용하고 DGS 동물을 취급하고 이송하는 동안 매우 무거운 가죽 장갑을 착용하십시오.
  2. 각각 6 F 및 8 F 도입 외피를 사용하여 문맥 (PV) 및 간하 하대정맥 (IHIVC)에 대한 커프를 만듭니다. 각 커프는 본체와 2mm 길이의 확장부로 구성되었습니다. 모기집게로 부드럽게 조여 커프 둘레에 여러 개의 홈을 만듭니다(그림 2).
    알림: PV 및 IHIVC의 직경은 DGS의 크기와 성별에 따라 크게 다릅니다. 따라서 적절한 선택을 위해 수술 전에 5-F, 6-F, 7-F 및 8-F 커프를 준비하는 것이 좋습니다. 일반적으로 5-F 또는 6-F 커프는 PV에 적합하고 7-F 또는 8-F 커프는 IHIVC에 적합합니다.
  3. 메스를 사용하여 22G 및 24G 정맥 주사 카테터를 양면 비스듬한 튜브로 절단하여 담관(3mm)과 간동맥(2mm)에 스텐트를 만듭니다.
    참고: 스텐트에 과도한 압력을 가하면 내강이 좁아지거나 폐색되어 수혜자의 생존을 위태롭게 할 수 있으므로 피하십시오.

2. 기부자 운영

  1. 초기 단계
    1. 마취를 유도하려면 1L/분의 기류 속도에서 5% 이소플루란 농도를 사용하고 유지 보수를 위해 1L/분에서 2% 농도를 사용합니다.
    2. DGS를 보드의 누운 위치에 배치합니다. 복부의 털을 면도하고 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 사용하여 피부를 살균합니다.
  2. 관류 전 간 격리
    1. xiphoid process에서 치골 symphysis까지, 그리고 측면으로 중간 겨드랑이 라인까지 십자형 절개를 만듭니다. 모기 집게를 사용하여 xiphoid 프로세스를 철회하고 등 아래에 5mL 주사기를 지지대로 놓습니다.
    2. falciform 인대를 절제합니다. 좌측 횡격막 정맥을 간상하 하대정맥(SHIVC)에서 분리하고 7-0 봉합사로 접합합니다. 간-비장 인대를 소작합니다.
    3. 면봉을 사용하여 오른쪽 신장 정맥 위의 IHIVC를 주변 조직으로부터 조심스럽게 제거합니다. 간 근처의 IHIVC로 배출되는 오른쪽 부신 및 요추 정맥을 7-0 봉합사로 결찰합니다.
    4. 총담관(CBD)의 전벽을 작게 절개합니다. 담관 스텐트를 삽입하고 7-0 실크 봉합사로 고정합니다. 수혜자의 CBD로 나중에 문합을 용이하게 하기 위해 봉합사의 한쪽 끝을 약 5mm 길이로 두십시오.
    5. 적절한 간 동맥(PHA), 위십이지장 동맥(GDA) 및 총간 동맥(CHA)을 주변 조직과 분리합니다.
    6. 1.5mL의 헤파린 식염수(300IU/mL)를 음경 정맥(남성 기증자) 또는 IHIVC(여성 기증자)에 투여합니다.
  3. 간 관류
    1. 왼쪽 신장 정맥 아래의 복부 대동맥을 분리합니다. 7G의 정맥 주사 바늘을 대동맥에 삽입하고 클램프로 고정합니다.
    2. 횡격막을 절개하고 흉부 대동맥에 혈관 클램프를 놓습니다.
    3. 주입 펌프를 사용하여 180-210mL/h의 속도로 20-30mL의 차가운 UW 용액을 대동맥 캐뉼라를 통해 간을 관류합니다. 흉곽내 대정맥과 IHIVC를 오른쪽 신장 정맥 위로 절개하여 관류물이 유출될 수 있도록 합니다.
      알림: 균일한 관류를 보장하기 위해 면봉을 사용하여 간엽의 위치를 조정하고 특히 중간 및 오른쪽 엽에 주의를 기울입니다. 관류는 간 전체가 균일한 창백함을 보일 때 완료됩니다.
    4. 관류 중에는 담낭을 절제하십시오.
      참고: 쥐와 달리 DGS는 담낭을 가지고 있습니다. 담낭을 제거하고 UW 용액으로 담관을 씻어내는 것은 담즙 응고로 인한 수술 후 담즙 폐색을 예방하는 데 필수적입니다.
  4. 간 이식 수확 후 관류
    1. 마이크로 집게를 사용하여 PV를 주변 결합 조직으로부터 분리합니다. 7-0 봉합사로 유문 정맥을 접합하고 횡단합니다. 비장 정맥 수준에서 PV 트렁크를 횡단합니다.
    2. GDA를 원위부로 접합하고 횡단합니다. CHA의 전벽에 작은 절개를 만듭니다. 간동맥 스텐트를 CHA에 삽입하고 7-0 실크 봉합사로 고정하고 한쪽 끝을 약 5mm 길이로 남겨 두어 나중에 수혜자의 CHA로 문합을 용이하게 합니다.
    3. SHIVC를 가능한 한 다이어프램에 가깝게 해부합니다.
    4. 미상엽과 위 사이의 부착물을 해부합니다. 등인대를 절단한 후 간을 완전히 가동합니다.
    5. 차가운 UW 용액이 담긴 7cm 강철 그릇에 간을 넣습니다. 보존을 위해 그릇을 4°C 냉장고에 옮깁니다.
      주: 24 h를 초과하는 간 감기 보전을 위해, 감염의 위험을 감소시키기 위하여 UW 해결책에 항생제를 추가하십시오; UW 솔루션을 24시간마다 교체하는 것이 좋습니다.

3. 생체 외 이식편 준비

알림: 열린 얼음 용기를 준비합니다. 뒷 테이블 전체가 얼음 위에서 준비되었습니다.

  1. PV 커프의 손잡이를 혈관 cl로 고정합니다.amp 모기집게를 사용하여 고정합니다. 커프를 통해 PV를 부드럽게 끼워 넣어 꼬임이 발생하지 않도록 합니다. PV를 커프 위로 접고 7-0 봉합사로 고정합니다(그림 3).
  2. IHIVC 커프에 대해 위의 절차(3.1단계)를 반복합니다.
  3. 낭포성 관을 통해 담관에 UW 용액 2mL를 관류합니다. 그런 다음 낭포성 관을 접합합니다.
  4. PV 커프를 통해 8-10mL의 찬 식염수로 간 이식편을 세척하여 냉장 보관 후 잔류 UW 용액을 제거합니다.
  5. 부착된 커프와 간의 오른쪽 하엽 사이의 IHIVC 주위에 단일 7-0 실크 봉합사를 놓습니다.
  6. 간을 회전시켜 우수한 측면을 드러냅니다. 8-0 위 SHIVC의 양쪽 측면 모서리에 봉합사를 유지하여 외부에서 내부로 삽입합니다.

4. 수신자 작업

  1. 초기 단계는 기부자 작업 프로토콜을 참조하고 2.1단계를 반복합니다.
  2. 수혜자 간 격리
    1. xiphoid process에서 치골 symphysis까지 정중선 절개를 수행합니다. 모기 겸자를 사용하여 두개골적으로 xiphoid 프로세스를 후퇴시키고 아래에 5mL 주사기를 배치하여 SHIVC를 들어 올립니다. 양측 늑골궁을 측면으로 후퇴시킵니다.
    2. 2.2.2단계에 설명된 대로 인대 및 혈관 관리를 수행합니다.
    3. 2.2.3단계에 설명된 대로 IHIVC를 분리합니다.
    4. 간과 후복막 사이의 인대 부착을 절단합니다. 뭉툭한 집게를 SHIVC 뒤에 조심스럽게 통과시키고 그 주위에 7-0 실크 봉합사를 놓습니다.
    5. CBD를 7-0 실크 봉합사로 근접하게 접합하고 합자 위로 횡단합니다. 면 팁을 사용하여 PV에서 담관을 부드럽게 분리합니다.
    6. GDA와 PHA를 결찰 사이에 transection합니다. CHA 끝에 Y자형 분기점을 만듭니다. 나중에 사용할 수 있도록 PHA 합자에 2cm 길이의 봉합사를 남겨 두십시오.
    7. PV의 오른쪽 및 왼쪽 분기를 해제합니다. 후속 조작을 위해 각 분기에 5cm, 7-0 stay 봉합사를 놓습니다.
  3. 이식자 간 제거
    1. 0.5L/min의 공기 흐름으로 이소플루란 농도를 0.5%로 줄입니다.
      알림: 이소플루란 기화기를 조정하여 초당 약 1회 호흡의 호흡수를 유지하십시오. 호흡 억제로 이어지는 수술 중 인식 또는 과도한 마취를 방지하기 위해 무간 단계 전반에 걸쳐 마취 깊이를 지속적으로 평가합니다.
    2. IHIVC를 오른쪽 신장 정맥 위에 고정한 다음 PV를 유문 정맥 위에 고정합니다. 간에서 혈액을 씻어내기 위해 2mL 주사기를 사용하여 10초 후에 1.5mL의 식염수를 오른쪽 PV에 주입합니다.
    3. SHIVC 주위에 배치된 7-0 실크 봉합사를 당겨 다이어프램을 부드럽게 집어넣은 다음 다이어프램의 일부를 포함하여 SHIVC에 불독 클램프를 적용합니다.
    4. 간 바로 위의 SHIVC를 절제합니다. 두 PV 분기에 7-0 스테이 봉합사를 고정하고 이 합자 위로 PV를 교차합니다. IHIVC를 간 실질(liver parenchyma)에 가깝게 transection합니다. 남아 있는 인대 부착물을 절단하여 간을 즉시 제거하십시오.
  4. SHIVC 재건
    1. 간 이식편을 복강 내에서 정형적으로 배치합니다. 첨부된 8-0 활용 수혜자의 SHIVC의 양쪽 모서리에 스테이 봉합사를 배치하기 위한 봉합사, 내부에서 외부로 삽입하고 매듭으로 고정합니다.
    2. 혈관 클립을 사용하여 오른쪽 봉합사의 느슨한 끝을 측면으로 부드럽게 당겨 SHIVC를 정렬합니다.
    3. 왼쪽 모서리에서 시작하여 8-10 개의 연속 스티치로 뒤쪽 벽을 봉합합니다. 10-12 바늘로 전벽을 닫고 동일한 봉합사를 사용하여 오른쪽에서 왼쪽으로 움직입니다. 전벽 봉합을 완료하기 전에 SHIVC 캐비티를 세척하여 공기를 배출하고 공기 색전증을 예방하십시오(그림 4).
  5. 태양광 재건
    1. 양쪽 분기점에 배치된 5cm 스테이 봉합사를 사용하여 PV를 올리고 용기 cl로 부드러운 상향 견인력을 적용합니다.amps. PV 가지의 중간 지점을 절개합니다.
    2. PV 루멘을 헤파린 식염수(300IU/mL)로 세척한 다음 커프를 PV에 삽입하고 7-0 실크 봉합사로 고정합니다.
    3. PV 및 SHIVC의 클램프를 순차적으로 해제하여 이식편 관류를 재설정하고 무간 단계를 종료합니다(그림 5).
  6. PV 절차와 유사하게 IHIVC 문합을 수행합니다. 먼저 기증자 측 주위의 7-0 봉합사를 풀고 수혜자 측에서 클램프를 제거합니다.
  7. 간동맥 재건술
    1. 미세혈관 클립을 적용하여 수혜자의 CHA에서 혈류를 차단합니다.
    2. 수혜자의 CHA 말단에서 Y-구성의 분기점에 작은 절개를 만듭니다. CHA 내강을 헤파린 식염수(300 IU/mL)로 세척한 다음 스텐트를 CHA에 삽입하고 7-0 실크 봉합사로 고정합니다.
    3. 스텐트 변위를 방지하기 위해 기증자와 수혜자 양쪽 모두에 스테이 봉합사를 묶습니다. 동맥 흐름을 복원하기 위해 미세혈관 클립을 방출합니다(그림 6).
  8. 담관 재건술:
    1. 수령인의 CBD의 전벽에 작은 절개를 만드십시오. 담관 스텐트를 수혜자의 CBD 내강에 삽입하고 7-0 실크 봉합사로 고정합니다.
    2. 스텐트 변위를 방지하기 위해 기증자와 수혜자 양쪽 모두에 스테이 봉합사를 묶습니다(그림 7).
  9. 재건 절차가 완료된 후 연속 3-0 봉합사를 사용하여 복부 절개 부위를 두 겹으로 봉합합니다(그림 8).

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결과

평균 수술 소요 시간은 다음과 같다: 기증자 수술 평균 24.8± 2.3분, 백테이블 수술 15.4± 1.3분, 수혜자 수술 52.7± 5.1분, 무간기 14.2± 1.5분이었다.

차가운 UW 용액에서 24시간 동안 보존된 간 이식 수혜자는 이식 전 동면 상태(n = 8) 또는 그렇지 않았는지(n = 4) 여부에 관계없이 이식 후 7일에 100% 생존율을 보였습니다(그림 9). 7일째에는 혈관 폐색이 관찰되지 않았다. 모든 간 동맥은 스텐트 기술에 의해 관류된 상태로 유지되었습니다. 대조적으로, 역시 저온 UW 용액에서 24시간 동안 보존된 다른 SD 쥐로부터 간 이식을 받은 모든 SD 쥐는 이식 후 12시간 이내에 굴복했습니다(n = 9).

...

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토론

Kamada의 더블 커프 기법2를 기반으로 DGS에서 최초의 정소성 간 이식 모델을 성공적으로 확립했습니다. DGS와 전통적인 랫드 모델 간의 해부학적 차이로 인해 재료 준비, 수술 절차 및 수술 후 관리에 대한 특정 고려 사항이 필수적입니다.

동면 및 지방 비축량과 같은 요인은 150g에서 400g에 이르는 성인 DGS의 상당한 개별 체중 변화에 기여하며 남성과 여성 간에 현저한 차이가 있습니다. 따라서 기증자와 수혜자를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 이상적으로는 수혜자의 체중이 기증자보다 약간 더 나가야 하며 체중 차이가 50g을 넘지 않아야 합니다.

DGS의 혈관 직경은 크기와 성별에 따라 크게 다릅니다. PV 및 IHIVC 문합을 최적으로 선택하기 위해 5-F에서 8-F 범위의 커프를 수술 전 준비하는 것이 좋습니...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 비전염성 만성질환-국가과학기술전공프로젝트(2023ZD0507600)와 중국국가자연과학재단(82371794 및 82170671)의 지원을 받았다. 이 작업은 또한 Zhejiang University Education Foundation, Academician Shusen Lanjuan Talent Foundation의 후원을 받았습니다. 또한 위스콘신 대학교 오시코시 캠퍼스의 Dana K. Merriman 교수에게 13줄의 땅다람쥐를 사육하는 데 기여하고 실험실에서 동면 설치류 모델을 사육하는 데 도움이 되는 통찰력과 경험을 아낌없이 공유해 주신 것에 대해 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
바늘을 이용한 3-0 봉합사진환의료제품 유한회사R315피부 폐쇄를 위해
7-0 실크 봉합사브레인트리, 사이, 주식회사SUT-S103
7세 여자 인트로듀서 시스 베이징 데맥스 의료기술유한회사.DQ07083818SIHIVC용 커프스
8-0 바늘을 이용한 봉합사진환 의료제품유한회사.H821SHIVC 문합을 위해
8여년 도입부 시스와 nbsp;베이징 데맥스 의료기술유한회사.DQ08083818SIHIVC용 커프스
마취기RWD 생명과학 회사R500
혈액 차단 소작닝보 순예 의료유한회사.BDD-예-DT-1
불독 클램프 (약간 곡선)진중 의료제품 유한회사.XEC120시브
부프레노르핀톈진 제약연구소 제약유한회사H12020275진통제
세푸록심 나트륨에세티 파마세우티치 S.r.lH20160013항생제
면봉복칭 보건 및 통합 의료20230R
곡선 마이크로 겸자RWD 생명과학 회사F11031-11수술 도구
곡선 마이크로 가위66 비전 테크 주식회사54108B수술 도구
거즈 면봉유베이 의료소재 주식회사21080274
헤파린 나트륨 주사북중국제약유한회사(North China Pharmaceutical Co., LTD)2101131-2
주입 펌프호크메드 주식회사HK-400
이소플루란RWD 생명과학 회사21070201
마이크로 니들홀더월드 프리시전 인스트루먼트 주식회사555408NT수술 도구
마이크로 용기 클립RWD 생명과학 회사R31005-06PV와 IHIVC
마이크로 베슬 클립 어플리케이터RWD 생명과학 회사R34001-14수술 도구
바늘 홀더RWD 생명과학 회사F31025-13복부 폐쇄
생리식염수저장 톈루이 제약유한회사716092103
직선 마이크로 겸자RWD 생명과학 회사F11029-11수술 도구
외과용 현미경라이카M650
수술 플랫폼해당 없음해당 없음커스텀, 마그네틱
조직 겸자RWD 생명과학 회사F12002-12수술 도구
조직 가위RWD 생명과학 회사S12003-09수술 도구
UW 솔루션장기 회수 시스템SPS-1오르간 연출 및 보관  

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