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방법 논문

Real-Time Fluorescence PCR을 통한 Mycobacterium tuberculosis 감염 및 약물 내성의 신속한 진단

781 조회수

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DOI:

10.3791/68445

⸱

2025년 7월 15일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 실시간 형광 정량 PCR(qPCR) 기술을 사용하여 결핵 균 및 약물 내성을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

결핵(TB)은 취약 계층에 불균형적으로 영향을 미치는 주요 건강 문제입니다. 약물 내성 결핵의 출현과 확산은 전 세계 공중 보건에 심각한 위협이 되고 있습니다. 도말 현미경 검사 및 배양과 같은 결핵균(MTB )에 대한 기존의 진단 방법은 상당한 한계가 있으며 종종 임상 치료가 지연되는 결과를 초래합니다. 이 문제를 해결하기 위해 실시간 형광 PCR을 기반으로 하는 효율적인 진단 체계가 개발되었습니다. 테스트 샘플에서 고품질 MTB 핵산을 추출할 수 있으며 주요 내성 부위에서 내성 상태를 식별할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 접근 방식은 검출 시간을 단 몇 시간으로 크게 줄여 환자의 최초 방문 직후 감염 및 내성 상태를 확인할 수 있습니다. 검출 민감도는 85%를 초과하고 특이도는 95%에 이릅니다. 이 비침습적 기술은 환자의 불편함을 최소화할 뿐만 아니라 저렴한 비용과 높은 효율성으로 인해 풀뿌리 의료기관에서 정확한 진단을 지원합니다. 전반적으로 이 접근 방식은 결핵 진단의 상당한 개선을 나타냅니다.

서론

결핵(TB)은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis , MTB)에 의해 발생하는 만성 감염병으로, 전 세계 10대 사망 원인 중 하나입니다1. 약물 내성 결핵(DR-TB)은 결핵 통제 노력에 중대한 도전이 되고 있습니다. 중국질병통제예방센터(China CDC)가 발행한 결핵 없는 지역사회 구축을 위한 실행 계획(2022-2027)은 세균학적으로 확진된 모든 폐결핵 환자에 대한 조기 약물 내성 검사의 필요성을 강조한다2. 이 보고서는 DR-TB 검출 능력을 강화하고, 진단 일정을 단축하고, DR-TB 사례 식별을 극대화하고, 표준화된 치료 및 관리를 보장하고, 필요한 감염 통제 조치를 구현하기 위해 새로운 분자 진단 기술의 채택을 지지합니다3. 또한, DR-TB 예방 및 통제 강화에 관한 고시(2023년 제4호)는 첨단 진단 기술의 전국적 홍보를 의무화하고 있습니다. 이 보고서는 세균학적으로 확진된 모든 결핵 환자에 대해 시기적절한 내성 검사를 통해 보편적인 선별 검사를 달성하고, 진단 표준화를 개선하며, 의료 접근성을 높일 것을 촉구한다4.

DR-TB는 하나 이상의 항결핵제에 내성이 있는 결핵 환자를 말합니다. 현재 분류에는 리팜피신 내성(RR), 단내성, 다제내성, 다제내성(MDR), 전방적 약물 내성(pre-XDR) 및 광범위 약물 내성(XDR) 결핵이 포함됩니다. DR-TB 역학에 대한 글로벌 메타 분석에 따르면 MDR-TB 11.6%, 이소니아지드 내성 15.7%, 리팜피신 내성 9.4%, 단내성 11.8%로 놀라운 내성률이 나타났습니다. 이러한 데이터는 DR-TB5의 심각성과 복잡성을 강조합니다.

리팜피신(Rifampicin)과 이소니아지드(isoniazid)는 결핵 치료의 초석 약물입니다. 그러나 세계보건기구(WHO)는 리팜피신 내성에 대한 신속한 진단 기술을 사용할 수 있지만 이소니아지드 내성에 대한 유사한 도구는 부족하다고 지적합니다. 이러한 격차는 다제내성 결핵(MDR-TB)의 적시 진단을 방해합니다. "리팜피신 내성 결핵"의 잠정적인 정의는 이러한 진단의 한계를 반영하며, 다른 약물에 대한 내성을 신속하게 검출할 수 있는 능력이 부족하다는 점을 강조합니다 6,7. WHO는 이소니아지드 내성 결핵 사례가 리팜피신 내성 사례보다 두 배 더 흔한 것으로 추정합니다. 리팜피신 내성 검사에 대한 배타적 의존은 이소니아지드 단일내성 결핵(Hr-TB)을 간과할 위험이 있습니다8. 표준 요법으로 치료받은 발견되지 않은 Hr-TB 환자는 치료 실패, 재발 및 MDR-TB9로의 진행 위험이 높습니다. 에탐부톨 내성도 우려됩니다. 중국의 2017년 DR-TB 기준선 조사에서 결핵 및 MDR-TB 치료에 중요한 약물인 에탐부톨 내성률은 신규 사례에서 4.9%, 재치료 사례에서 17.2%로 보고되었습니다10.

현재 잔류 결핵의 약물 내성 검출을 위해 일부 실험실에서는 여전히 인공 배양이 선호되는 방법이지만, 결핵의 약물 내성을 검출하는 데는 실시간 형광 PCR 기술이 기존 방법보다 우수합니다. : 검출 및 정량화: 실시간 형광 PCR은 형광 신호의 실시간 모니터링을 통해 정확한 정량 분석을 제공하지만 기존 방법은 이러한 정확도가 부족합니다. 전통적인 실험 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며, 훈련된 인력이 필요하고, 매우 주관적입니다. 반대로 Real-Time PCR은 컴퓨터로 형광 프로브와 신호를 캡처하여 인적 오류를 최소화합니다. 기존의 데이터 분석 방법은 보다 주관적인 반면, Real-Time PCR은 증폭 곡선, 표준 곡선 및 기타 분석 방법을 통해 정확하고 객관적인 분석을 수행합니다. 이러한 발전으로 인해 Real-Time 형광 PCR은 결핵11의 약물 내성을 검출하는 데 선호되는 방법이 되었습니다.

요약하자면, 약제내성결핵(DR-TB)은 전 세계적인 위기로 부상하고 있습니다. 주요 약물인 이소니아지드(isoniazid), 리팜피신(rifampicin), 에탐부톨(ethambutol)에 대한 내성은 결핵 통제 노력을 더욱 복잡하게 만들고 있다. 약물 내성을 시기적절하고 정확하게 검출하는 것은 맞춤형 치료 요법을 안내하고, 치료 성공을 개선하고, DR-TB 위협을 완화하는 데 매우 중요합니다.

진단의 난제를 해결하기 위해 이 연구에서는 객담 샘플을 사용하여 결핵균을 식별하고 3.5시간 이내에 약물 내성 돌연변이를 검출할 수 있는 키트를 활용했습니다. 이는 실시간 형광 qPCR의 지원으로 달성되었습니다. 이 방법은 간단하고 비용 효율적이며 정확하여 DR-TB와의 싸움에서 유용한 도구입니다.

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프로토콜

이 연구는 신장 생산 및 건설 군단의 제 5 사단 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 윤리 번호는 LLWYH2025001이며 윤리적 충돌이 없습니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 샘플 수집

  1. 세계보건기구(WHO)에서 권장하는 국제 규격의 스크류 캡 가래 병 또는 밀봉된 플라스틱 상자 및 왁스 종이 상자를 사용하여 가래 샘플을 수집합니다.
  2. 가래 용기에 환자의 이름, 번호(신규 환자의 경우 외래 환자 순서 번호 또는 후속 환자의 경우 등록 번호), 검사 항목 및 용기 순서 번호 1, 2, 3(1 = 당일 즉석 가래, 2 = 야간 가래, 3 = 다음날 아침 가래)을 표시합니다. 가래가 없는 환자의 경우, 에어로졸 유도 가래 채취를 통해 검체를 채취합니다.
    참고: 직원은 수집된 가래 샘플의 품질을 평가해야 합니다. 샘플 부피는 일반적으로 3-5mL로 유지해야 합니다. 적격 샘플에는 건조 가래, 갈색 혈액으로 얼룩진 가래, 소량의 신선한 혈액이 포함된 가래 또는 점액 가래가 포함됩니다. 타액과 같은 자격이 없는 샘플은 추가 지침 후 검사를 위해 다시 제출해야 합니다.

2. 가래 전처리

  1. 수집된 가래의 부피를 기준으로 4% NaOH 용액의 부피의 1-2배를 가래 용기에 첨가합니다. 흔들어 내용물을 2분 동안 섞습니다.
  2. 용기를 실온의 생물 안전 캐비닛에 15분 동안 놓고 이 기간 동안 여러 번 흔들어 가래가 완전히 액화되도록 합니다.
    알림: NaOH는 부식성이므로 주의해서 다루십시오. 가래가 완전히 액화되지 않으면 쉐이킹 시간을 늘리십시오. 이 단계는 실험 전반에 걸쳐 특히 중요합니다.

3. 시약 준비(pre-PCR 영역)

  1. 시약 준비: 지정된 pre-PCR 영역에서 시약을 준비합니다. 얼린 시약을 실온으로 해동합니다. 5-10초 동안 소용돌이. 실온에서 3000× g에서 5-10초 동안 원심분리기.
    참고: 이 시약은 이중 시스템(A/B)이므로 별도로 준비해야 합니다.
  2. PCR 마스터 믹스 준비
    1. 혼합 A: 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 (n + 3) × 19.6μL의 RIF PCR 혼합 A와 (n + 3) × 0.4μL의 결핵 효소를 결합합니다. 5-10초 동안 소용돌이. 실온에서 5-10 초 동안 3000×g에서 원심분리기(PCR Mix A: 60μL).
    2. 혼합 B: 다른 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 (n + 3) × 19.6μL의 RIF PCR 혼합 B와 (n + 3) × 0.4μL의 결핵 효소를 결합합니다. 위와 같이 와류 및 원심분리기(PCR Mix B: 60 μL).
  3. 보관 및 사용: 준비된 마스터 믹스를 ≤-18°C에서 보관하십시오. 즉시 사용하지 않을 경우 4시간 이내에 사용하십시오.
    참고: EMB 및 INH 시약에도 동일한 프로토콜이 적용됩니다.
  4. PCR 마스터 믹스 분주량: 20μL의 PCR Mix A 및 Mix B를 별도의 PCR 박막 반응 튜브에 분주합니다. 분주된 튜브를 밀봉된 백에 넣어 추출 영역으로 옮깁니다.

4. 핵산 적출과 표본 선적 (적출 지역)

  1. 완전 액화 가래 1.2mL를 실온에서 15,058×g으로 5 분 동안 원 심분리기합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 유지하십시오. 선택 사항: 장비가 허용하는 경우 분해된 전체 샘플을 원심분리합니다.
  2. 펠릿을 1.2mL 식염수, 와류 및 원심분리기에 15,058 × g 으로 실온에서 5분 동안 재현탁합니다. 이 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
  3. 펠릿에 250μL TB 추출 버퍼를 추가합니다. 소용돌이를 일으키고 99°C에서 10분 동안 열 분해를 수행합니다. 실온으로 식히십시오. 실온에서 15,058 × g에서 1 분간 원심분리기를 하고 상등액(추출된 시료)을 채취합니다.
    참고: 점성 샘플의 경우 액화 버퍼의 부피를 늘리거나 와류 시간을 연장하십시오. 샘플이 DNA 추출에만 사용되는 경우 완전한 분해를 보장하기 위해 액화 시간을 연장하십시오.
  4. 마이크로피펫을 사용하여 추출된 샘플 5μL 또는 음성/양성 대조군을 각 PCR 박벽 반응 튜브에 추가합니다. 튜브를 즉시 밀봉하고 적절하게 라벨을 부착하십시오.
  5. Vortex는 PCR 튜브를 5-10초 동안 로드하고 원심분리기를 짧게(5-10초) 로드했습니다. 튜브를 PCR 증폭 영역으로 옮깁니다.

5. PCR 증폭 (증폭 영역)

참고: 리팜피신, 에탐부톨 및 이소니아지드 내성 검출을 위한 프로그램은 Hongshi 열 순환기에 설정되었습니다(표 1, 표 2 및 표 3). 사이클링 조건이 포함되어 있습니다.

  1. 증폭을 위해 로드된 PCR 얇은 벽 반응 튜브를 열 순환기에 넣습니다.
  2. cycler 인터페이스에 액세스합니다. Experiment Wizard 를 클릭하고 실험 유형을 Standard Melt Curve 로 선택합니다( 그림 1 참조).
  3. Plate Editor를 클릭하고, 인접한 두 개의 빈 웰을 수평으로 선택하고, 오른쪽 패널에서 해당 약물 템플릿을 할당하여 하나의 검체를 정의합니다(그림 2 참조).
  4. 음성/양성 대조군 및 샘플 정보를 구성합니다. 시작을 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 런타임은 2시간 22분입니다.
  5. 완료되면 PCR 얇은 벽 반응 튜브(밀봉된)를 밀봉된 백에 옮깁니다. 마개를 고정하고 생물학적 유해 폐기물로 처리하십시오.
  6. Thermal Cycler에서 Analyze (분석)를 클릭하여 데이터를 처리합니다.
    참고: 이 방법의 검출 한계는 다음과 같습니다: 복합 그룹: 10 bacteria/mL; 리팜피신: 20,000 bacteria/mL; 이소니아지드: 10,000 bacteria/mL; 에탐부톨: 10,000 bacteria/mL. (검출 한계(LoD) 데이터는 시약 사용 설명서에 제공된 765개의 임상 사례에 대한 통계 분석에서 파생되었습니다.)

6. 결과 해석

  1. 테스트 샘플과 양성 대조군 간의 용융 온도(Tm) 차이를 비교하여 돌연변이를 확인합니다.
    참고: 야생형(약물 민감성): 샘플의 Tm 값은 4개 채널 모두에서 양성 대조군과 일치합니다(편차 ≤1 °C). 돌연변이(약물 내성): 모든 채널의 Tm 값은 양성 대조군(ΔTm ≥2°C)보다 ≥2°C 낮습니다.

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결과

이 연구는 실시간 형광 PCR 및 용융 곡선 분석을 활용하여 17명의 결핵 환자의 가래 샘플을 테스트했습니다. 또한 30명의 환자가 리팜피신 내성 검사를 받았고, 20명은 이소니아지드 와 에탐부톨에 대한 내성 검사를 받았습니다. 실시간 형광 PCR 방법은 Mycobacterium tuberculosis complex에 대해 88.2%의 양성 검출률을 보여주었습니다.

내성률은 리팜피신이 13.3%, 이소니아지드가 15.0%로 일부 환자에서 약물 내성 가능성이 있음을 시사했다. 상당수의 샘플(리팜피신의 경우 26.7%, 이소니아지드의 경우 20.0%)이 검출되지 않았는데, 이는 낮은 박테리아 농도 또는 분석법 민감도 문제 때문일 수 있습니다. 에탐부톨 내성은 5.0%로 상대적으로 낮았지만...

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토론

약물 내성 결핵 복합체(MTBC) 균주가 전 세계적으로 출현하면서 결핵(TB) 환자의 치료가 크게 복잡해졌습니다. 특히, 다제내성(multidrug-resistant, MDR) 결핵과 광범위약물내성(endestively-drug-resistant, XDR) 결핵은 결핵 통제에 만만치 않은 도전을 제기한다12. 약물 내성을 신속하게 검출하는 것은 적절한 치료 요법을 설계하고, 치료 실패를 예방하며, 내성 균주의 추가 확산을 줄이는 데 매우 중요합니다13,14. 실시간 형광 PCR과 같은 핵산 증폭 기술(NAAT) 기반 검출 방법은 안정성이 우수하고 검출 시간이 짧기 때문에 결핵 진단에 널리 채택되고 있습니다15. 그러나 결핵 진단을 위한 검증된 NAAT 방법으로 인정...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 Corps Tuberculosis Project의 특별 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고속 원심분리기
용해 완충제Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24110701
Mycobacterium tuberculosis Ethambutol 내성 돌연변이 검출 키트Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24030801
Mycobacterium tuberculosis Isoniazid 내성 돌연변이 검출 키트Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24011101
Mycobacterium tuberculosis Rifampicin 내성 돌연변이 검출 KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24031001
SLAN-96P 실시간 PCR 시스템Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.SLAN-96P
가래 처리 솔루션Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24110701
TopPette 피펫

참고문헌

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