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방법 논문

혈액 오염이 없는 Murine Nasal Lavage Fluid Collection

3.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68451

⸱

2025년 7월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 쥐 비강 세척액(NLF)의 혈액 오염을 방지하기 위한 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법은 혈액 오염 없이 NLF 수집을 보장하기 때문에 면역학적 성분과 다양한 호흡기 병원체를 보다 정확하게 검출할 수 있습니다.

초록

비강 세척액(NLF) 및 비강 면봉을 포함한 상기도 샘플은 호흡기 질환을 유발할 수 있는 바이러스 및 박테리아를 포함한 병원체를 검출하는 데 유용합니다. NLF는 호흡기 계통의 세포 및 체액성 구성 요소를 검사하는 데 사용되었으며, 예를 들어 점막 백신 접종 후 면역글로불린(Ig) A의 유도를 평가하는 데 사용되었습니다. 실험용 설치류에서 NLF 샘플은 경인두 또는 경기관 경로를 통해 수집할 수 있습니다. 경인두 경로가 경기관 경로보다 NLF 샘플을 수집하는 데 더 효율적인 것으로 보고되었지만, 경인두 경로에서 수집된 NLF 샘플은 종종 혈액으로 오염되어 원래 NLF 샘플의 세포 및 체액 함량 수준에 영향을 미쳤습니다. 따라서 본 연구는 혈액 오염을 최소화하기 위해 실험용 마우스에서 새로운 NLF 수집 방법을 확립하는 것을 목표로 했습니다. 간단히 말해서, 쥐의 아래턱을 분리하기 전에 피를 흡수하기 위해 면봉을 입에 넣었습니다. 출혈이 멈췄을 때, 마이크로피펫을 choana에 삽입하고 200μL의 인산염 완충 식염수로 2회 플러시하여 NLF 샘플을 수집했습니다(최종 부피: 400μL/마우스). 혈액 오염을 검출하기 위해 헤모글로빈을 검출하는 간단하고 민감한 법의학 루미놀 테스트를 사용했습니다. 루미놀 테스트는 기존 방법(면봉 없이)으로 수확한 NLF 샘플에서 혈액 오염이 검출될 수 있음을 보여주었지만 새로운 방법(면봉 사용)으로 수확한 샘플에서는 검출되지 않았습니다. 혈액의 오염으로 인해 NLF 샘플의 총 IgA 및 IgG 농도는 새로운 방법보다 기존 방법에서 더 높았습니다. 혈액에는 NLF보다 훨씬 더 높은 수준의 IgA와 IgG가 포함되어 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 이 독특한 방법은 혈액 오염을 방지하기 위해 실험용 마우스에서 NLF 샘플을 수집하는 간단하고 민감한 방법으로 사용할 수 있습니다.

서론

임상 및 기초 연구 모두에서 적절한 검체 채취 방법은 결과를 평가하는 데 가장 중요합니다. 비강 세척은 호흡기의 세포 및 체액성 구성 요소를 분석하는 데 사용되는 세척 기술입니다 1,2,3. 임상적으로 비강 세척액(NLF)은 바이오마커 발견을 위한 효과적인 비침습적 샘플로 사용되어 왔으며, 여러 연구에서 부비동염, 낭포성 섬유증 및 일반 호흡기 질환을 포함한 다양한 호흡기 질환에 대한 사용을 뒷받침하고 있습니다 4,5,6,7. 실험 동물에서 NLF는 인플루엔자, 코로나바이러스 질병-2019(COVID-19) 및 알레르기 질환 3,8,9를 포함한 호흡기 질환 모델을 연구하는 데에도 사용되었습니다. 이 방법은 다형성 핵 세포 및 사이토카인과 같은 주요 염증성 바이오마커를 결정하는 데 널리 사용되며, 이는 종종 알레르겐, 천식 및 호흡기 감염에 대한 반응의 지표로 검사됩니다 10,11,12. 최근에는 잠재적인 비강 내 백신 후보의 효능과 안전성을 조사하기 위해 종종 실험 동물에서 NLF 샘플을 채취하고 있으며, NLF 샘플의 병원체 및 면역글로불린(Ig) 수치를 지표로 정량화했습니다13.

실험용 마우스에서 NLF는 트랜스인두 또는 트랜스 기관 방법을 사용하여 수집 할 수 있습니다. 트랜스인두법(trans-pharyngeal method)에서는 구개인두(palatopharyngeal region)를 포함한 쥐 머리를 후두에서 분리한 다음, 인두 개구부를 통해 카테터를 후두에 삽입하여 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입하고 콧구멍에서 NLF를 채취한다14. 경기관법은 머리를 절단하지 않고 기관을 통해 호흡기로 접근할 수 있었고, 콧구멍에서 NLF를 채취하여 혈액 오염의 위험을 최소화했습니다. 이 두 가지 주요 방법은 실험용 마우스의 NLF 수집에 사용되었지만 두 가지 기존 방법 모두 고유한 한계가 있습니다. 경기관 세척 방법은 경기관 세척액이 구강으로 누출되기 때문에 경인두 방법보다 NLF의 양이 적은 것으로 입증되었습니다. 이전 연구에서는 PBS 주입 후 NLF에서 회수된 체액량은 경기관 및 경인두법에서 각각 70%-80% 및 90%-100%인 것으로 나타났습니다14. 경인두법이 경기관법보다 NLF가 많을 때 더 나은 것으로 간주될 수 있지만, 시술 중 혈액 오염은 어느 정도 불가피했다14,15. 마찬가지로, 여러 연구에서 NLF 샘플이 종종 높은 수준의 혈청 단백질로 오염되었다고 보고했습니다 16,17,18. 이는 호흡기 질환에 대한 NLF 특이적 바이오마커의 검출 및 정량화를 방해할 수 있다19. 이는 또한 혈액이 NLF보다 더 많은 양의 IgA와 IgG를 함유하고 있기 때문에 NLF 샘플의 Ig, 특히 IgA 및 IgG의 농도에 영향을 미칠 수 있습니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 본 연구는 실험용 마우스에서 NLF 샘플을 수집하고 샘플 수율을 극대화하며 혈액 오염을 최소화하기 위한 독특하고 간단하며 신뢰할 수 있는 경인두 방법을 확립하는 것을 목표로 했습니다. 실험 과정에서 혈액 오염을 억제하기 위해 솜뭉치를 쥐의 입에 넣은 다음 PBS를 주입하여 콧구멍에서 NLF 샘플을 채취했습니다. NLF의 혈액 오염 수준은 NLF 샘플에서 헤모글로빈(Hb) 수치를 반정량화할 수 있는 법의학 기술인 루미놀 기반 화학발광을 사용하여 측정되었습니다. 새로운 방법으로 수집된 NLF의 루미놀 반응은 음성이었습니다. 따라서 현재의 새로운 방법은 항체 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 사이토카인 프로필, 면역학 및 의료 바이오마커 결정, 쥐 호흡기 질환 모델과 같은 다양한 생물학적 실험에서 NLF 샘플 품질을 향상시킬 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 킨다이 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(NIH)20에서 제시한 기준에 따라 수행되었습니다. 이 연구에는 4개월 된 수컷 C57BL/6 마우스가 사용되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. NLF 수집

  1. 기관에서 승인된 프로토콜에 따라 5% isoflurane21 로 마우스를 안락사합니다.
  2. 수술 플레이트에 마우스를 등을 대고 놓고 네 팔다리를 모두 고정하여 고정합니다.
  3. 1mL 주사기를 사용하여 심장에서 혈액을 채취합니다.
  4. 가위를 사용하여 복강을 열어 내장 기관과 횡격막을 노출시킵니다.
  5. 가위를 사용하여 횡격막과 갈비뼈를 절개하여 오른쪽 심방이 보이도록 합니다.
  6. 가위를 사용하여 오른쪽 심방에 구멍을 뚫어 혈액을 더 제거합니다.
  7. 혀를 당기면서 동물의 입에 솜뭉치 3개를 넣습니다.
  8. 아래턱을 가위로 분리하면서 머리를 올리면서(코를 위로 올리는 위치) NLF의 혈액 오염을 억제합니다.
  9. 혈액 오염을 방지하기 위해 면봉을 새 것으로 교체하십시오.
  10. 출혈이 멈춘 후 200μL의 멸균 PBS를 choana에 주입하고 콧구멍에서 배출된 NLF를 1.5mL 튜브에 모읍니다.
  11. 1.10단계를 한 번 더 반복합니다.

2. luminol chemiluminescence에 의한 혈액 오염 검출

  1. 1.5mL 튜브를 사용하여 1ml의 멸균수에 1mg의 루미놀과 5mg의 과산화나트륨(Na2O2)을 녹여 원액을 만듭니다.
    참고 : 최종 농도는 1mg / mL 루미놀 및 5mg / mL Na2O2 입니다.
  2. 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
  3. 원액을 탈이온수로 10배 희석하여 작동하는 용액을 만듭니다.
    참고 : 최종 농도는 0.1 mg / mL 루미놀 및 0.5 mg / mL Na2O2 입니다.
  4. NLF 샘플 2 μL를 96웰 플레이트의 웰에 피펫팅합니다.
  5. 각 웰에 희석된 루미놀 용액 100μL를 추가합니다.
  6. 96웰 플레이트를 짧게 흔들어 샘플을 루미놀 용액과 혼합합니다.
  7. 어둠 속에서 루미놀 화학발광을 직접 관찰하십시오.
  8. 필요한 경우 광도계를 사용하여 Hb 농도를 반정량화합니다.

3. ELISA에 의한 IgA 및 IgG 정량화

  1. 96웰 플레이트의 웰을 100μL/웰의 총 안티 마우스 IgA(20ng/well, 200ng/mL) 또는 IgG(10ng/well, 100ng/mL) 항체로 코팅합니다( 재료 표 참조).
  2. 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  3. 매번 PBS에서 0.05% Tween 20이 포함된 세척 버퍼의 300μL/웰로 플레이트를 세 번 세척한 다음 종이 타월로 플레이트를 닦아냅니다.
  4. 각 웰에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 0.2% Tween 20 in PBS를 함유한 분석 희석제 200μL를 추가합니다.
  5. 플레이트를 실온(RT)에서 60분 동안 배양합니다.
  6. 분석 희석제를 흡입한 다음 종이 타월로 플레이트를 닦아냅니다.
  7. 분석 희석제로 100ng/mL의 마우스 IgA 또는 IgG 표준물질을 준비하고 50ng/mL, 25ng/mL, 12.5ng/mL, 6.25ng/mL, 3.13ng/mL, 1.56ng/mL 및 0.78ng/mL의 2배 연속 희석을 만듭니다.
    참고: 각 표준물질의 요구 부피는 웰당 100μL입니다.
  8. 혈청(104 - 106), NLF(10, 50, 200 및 500) 및 BALF(101 - 104)의 적절한 희석액으로 샘플을 희석합니다.
    참고: 각 샘플의 필요한 부피는 웰당 100μL입니다.
  9. 100μL의 IgA 또는 IgG 표준물질과 샘플을 적절한 웰에 추가합니다.
  10. 75분 동안 RT에서 플레이트를 배양합니다.
  11. 매번 300μL/웰의 세척 버퍼로 플레이트를 세 번 세척한 다음 종이 타월로 플레이트를 닦아냅니다.
  12. 과산화효소 접합 항 마우스 F(ab')2 항체( 재료 표 참조)를 적절한 희석액인 104배 희석액으로 분석 희석액으로 희석합니다.
    참고: 필요한 부피는 웰당 100μL입니다.
  13. 각 웰에 희석된 과산화효소 접합 항-마우스 F(ab')2 항체 100μL를 추가합니다.
  14. 75분 동안 RT에서 플레이트를 배양합니다.
  15. 매번 300μL/웰의 세척 버퍼로 플레이트를 5회 세척한 다음 종이 타워에서 플레이트를 닦아냅니다.
  16. 테트라메틸벤지딘(TMB)과 과산화수소를 함유한 기질 용액 100μL를 각 웰에 추가합니다.
  17. RT에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다.
  18. 각 웰에 50μL의 정지 용액, 2N 황산(2N H2SO4)을 추가합니다.
  19. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.
  20. 표준 곡선을 활용하여 각 샘플의 IgA 및 IgG 농도를 측정합니다.

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결과

기존 방법 또는 새로운 방법을 사용하여 C57BL/6 마우스에서 경인두 경로를 통해 NLF 샘플을 수집했습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 기존 방법으로 수집된 NLF 샘플은 약간 분홍색을 띠었습니다(그림 1A). 새로운 방법으로 수집된 NLF 샘플은 명확했습니다(그림 1B). 이러한 차이는 기존 방법에 의한 NLF 샘플의 혈액 오염으로 인한 것으로 보였기 때문에 NLF 샘플의 혈액 오염을 루미놀 반응을 사용하여 검사했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 기존 방법으로 수집된 NLF 샘플의 화학발광은 양성이었으며 이는 혈액 오염을 나타냅니다(그림 2A). 반면에, 새로운 방법으로 수집된 NLF 샘플의 화학발광은 음성이었습니다(그...

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토론

비강 세척은 인플루엔자 및 COVID-19와 같은 호흡기 질환에서 생화학적, 세포학적, 생물학적 정보를 획득하는 데 유용한 기술입니다23. 다양한 침투 세포를 식별하는 것 외에도 ELISA, 면역블롯 및 정량적 중합효소 연쇄 반응 1,19,24와 같은 다양한 방법을 사용하여 NLF 샘플에서 호흡기의 비세포 구성을 검사할 수 있습니다. 여기에서는 기존 방법과 새로운 방법의 두 가지 다른 NLF 수집 방법을 사용하여 비교 연구를 수행했습니다. 이번 연구는 혈액 오염이 NLF의 IgA 및 IgG 농도에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다. 혈액 오염은 아래턱을 분리하는 동안 발생했을 가능성이 가장 높기 때문에 간단한 새로운 방법이 확립되었습니다. 쥐의 입에 3개의 ...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

Seiichi Omura, Ph.D., Cong Thanh Nguyen, M.D., Ph.D., Kota Moriguchi, M.D., Reona Shiro, M.D., Sandesh Rimal, M.S., Kindai University of Medicine 미생물학과, Hirotaka Ebina, Ph.D., Shinya Okamura, Ph.D., Yasuo Yoshioka, Ph.D., BIKEN Innovative Vaccine Research Alliance Laboratories, Research Institute for Microbial Diseases, 유용한 토론을 위한 오사카 대학. 또한, 킨다이대학교 생명과학연구소 회원들의 탁월한 기술 지원에 감사드립니다. 본 연구는 일본 문부과학성의 지원을 받아 몬부카가쿠쇼(문부과학성, 2021-2025) 장학금(I.A.), 일본과학진흥회(JSPS) JP23K06493(F.S.), JP21K07287/JP24K10500(A.-M.P.), JP22K18378/JP24K10163(I.T.), 킨다이대학 연구증진 보조금 KD2406(F.S.) 및 KD2506(I.T.)을 통해 이루어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
동물 고정 바늘Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, JapanKN-358-A동물 고정 바늘로 마우스를 고정했습니다. 스테인리스; 총 길이, 23mm; 바늘 끝, 15mm.
BD OptEIATM  TMB 기질 시약 세트BD Biosciences, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국555214100 &mu를 추가했습니다. 웰당 TMB 기질 용액의 L.
벨 항아리NANA 마취를 위해 벨 항아리를 사용했습니다.
투명 평평한 바닥 면역 비멸균 96웰 플레이트 ThermoFisher Scientific, Rochester, NY, USA442404효소 결합 면역흡착 분석을 위해 MaxiSorp 표면 처리가 적용된 투명 평평한 바닥 면역 비멸균 96웰 플레이트를 사용했습니다.
면봉Sansho Co., Ltd., 도쿄, 일본94-1951우리는 혈액 오염을 피하기 위해 면봉을 사용했습니다. 면봉의 직경은 7mm였습니다.
소 태아 혈청Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA172012-500 ML분석 희석제에 소 태아 혈청 10%를 첨가했습니다.
집게(연구 실험용 마이크로 핀셋, 곡선 팁)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japan91-1506우리는 집게를 사용하여 해부했습니다. 모델, HSC 551-10; 그리고 전체 길이, 105mm.
집게(정밀 핀셋)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japan91-2772우리는 해부에 집게를 사용했습니다. 모델, HSC 607-12; 전체 길이, 120mm; 팁 직경, 0.3mm.
염소 항마우스 IgA-UNLBSouthernBiotech, 버밍엄, 앨라배마, 미국1040-01우리는 100 &mu로 투명 평평한 바닥 면역 비멸균 96웰 플레이트를 코팅했습니다. 총 면역글로불린 A의 L/웰(20ng/웰).
이소플루란 Viatris Inc., Canonsburg, PA, USANA취를 위해 이소플루란을 사용했습니다.
루미놀 발사 시약 세트FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, 오사카, 일본124-06511NLF 샘플에서 헤모글로빈을 검출하기 위해 루미놀 반응 시약 세트를 사용했습니다.
MicrotubeWatson Co., Ltd., 도쿄, 일본131-7155CNLF 및 BALF 수집을 위해   마이크로튜브(잠금 캡이 있는 1.5mL 마이크로튜브, 둥근 바닥, 소프트 터치 캡)를 사용했습니다.
Milli-Q waterMerck KGaA, Darmstadt, GermanyMilli-Q Direct 8우리는 MilliQ 물을 사용하여 루미놀 정기 용액을 만들었습니다.
Mini-Shaker PSU-2TBiosan Ltd., Riga, LatviaPSU-2TMini-Shaler PSU-2T를 사용하여 96웰 플레이트를 쉐이크했습니다.
마우스 계통CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japan NA우리는 4개월 된 C57BL/6 수컷 마우스를 사용했습니다.
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta 처리, 평평한 바닥 마이크로플레이트Thermo Fisher Scientific Nunc A/S . Kamstrupvej, Roskilde, 덴마크136101루미놀 테스트에는 NuncTM MicroWellTM 96웰, Nunclon Delta 처리, 평평한 바닥 마이크로플레이트를 사용했습니다.
과산화효소 접합 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항마우스 IgG, F(ab')2 단편 특이적(인간, 소 및 말 혈청 단백질에 대한 최소 교차 반응)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA115-036-072100 &mu를 추가했습니다. L의 과산화효소 접합 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항마우스 IgG, F(ab')2 단편 특이적, 각 웰에 대한 검출 항체(10,000배 희석).
인산염 완충 식염수Sigma-Aldrich Co., 세인트루이스, 미주리, 미국D8537-500MLNLF 및 BALF 수집을 위해 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(염화칼슘 및 염화마그네슘 없이 변형, 액체, 멸균 여과, 세포 도형에 적합)를 사용했습니다.
피펫 Watson Co., Ltd., 도쿄, 일본NA우리는 200-&mu를 사용했습니다. 비강 세척용 L 피펫.
피펫 팁Watson Co., Ltd., 도쿄, 일본NA우리는 200-&mu를 사용했습니다. L 비강 세척을 위한 멀티핏 피펫 팁.
폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트(Tween 20)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan167-11515완충액에 Tween 20의 0.05%를, 분석 희석제에 Tween 20의 0.2%를 첨가했습니다.
정제된 염소 항마우스 IgG(최소 x-반응성) 항체BioLegend, San Diego, CA, USA405301Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-well Plates를 100 & mu로 코팅했습니다. L/웰(10ng/웰)의 총 면역글로불린 G.
작은 가위, 양뾰족Sansho Co., Ltd., 도쿄, 일본91-7005해부에는 가위를 사용했습니다. 모델, S-4A; 그리고 전체 길이, 115mm.
황산Wako Pure Chemical Industries, Ltd, 도쿄, 일본192-04755우리는 50 &mu를 추가했습니다. 반응을 멈추기 위해 각 웰에 L of 2 N 황산을
Surflo 정맥 카테터 Terumo Corporation, 도쿄, 일본 SR-FS2032기관지폐포 세척을 위해 surflo 정맥 카테터를 사용하고 기관에 PBS를 주입했습니다. 카테터, 20G; 카테터 길이, 32mm; 카테터 내경, 0.80mm; 카테터 외경, 1.1mm; 및 내부 바늘, 22G.
수술용 직선 가위Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japan91-7004해부에는 가위를 사용했습니다. 모델, S-3B; 그리고 전체 길이, 120mm.
Surgilcal 플레이트Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, JapanKN-321-B해부에는 코르크 보드를 사용했습니다. 깊이, 20cm; 너비, 15cm; 높이 3cm.
Synergy H1 하이브리드 다중 모드 마이크로플레이트 리더 Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USANASynergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader를 사용하여 450nm에서 샘플의 흡광도를 측정했습니다.
사기Terumo Corporation, 도쿄, 일본 SS-01T심장에서 채혈하기 위해 1mL 주사기를 사용했습니다.
스레드  Niccho Kogyo Co., Ltd. Tokyo JapanNA시술 중 올바른 위치를 보장하기 위해 카테터를 실로 묶었습니다.
마 세척 넣습니다.주

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