이 프로토콜은 6-8시간 이내에 충분한 일차 연골 세포를 분리할 수 있게 하여 연골 생물학 및 연골 질환 메커니즘에 대한 추가 심층 조사를 용이하게 합니다.
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이 프로토콜은 6-8시간 이내에 충분한 일차 연골 세포를 분리할 수 있게 하여 연골 생물학 및 연골 질환 메커니즘에 대한 추가 심층 조사를 용이하게 합니다.
관절 연골 파괴는 골관절염(OA) 및 류마티스 관절염(RA)을 포함한 다양한 연골 질환의 주요 원인 인자인 연골 세포 활동의 변화로 이어집니다. 연골에서 가장 풍부한 세포 유형인 연골세포의 생물학적 특성에 대한 심층 연구는 효과적인 질병 치료 전략 개발에 필수적입니다. 일차 연골세포의 분리 및 배양은 연골 질환 조사에 중요한 실험 자료를 제공하고 연골 손상 및 복구 메커니즘을 밝히는 데 기여합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 유래한 일차 연골 세포에 대한 시험관 내 분리 및 배양 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 최적화된 콜라게나제 II 프로토콜을 사용하여 신생아 마우스 무릎 관절 연골 표본에 대해 연골 세포 분리를 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 세포 수율은 연골 조직의 약 1-2 × 10³ 세포/mg이며, 조직의 신선도 및 초기 세포 밀도에 따라 다릅니다. 분리된 세포는 >90%의 생존율을 나타냅니다. 이 프로토콜은 마우스 일차 연골 세포를 예로 사용하여 분리 후 1, 2 및 5일 동안 배양된 세포의 형태학적 특성 및 접착 상태를 보여줍니다. 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 및 웨스턴 블로팅은 인터루킨-1β(IL-1β) 처리가 콜라겐 II형 알파 1(Col2a1)을 감소시키고 매트릭스 메탈로펩티다제 13(Mmp13) 발현을 증가시켜 분리된 연골 세포가 염증 자극에 반응한다는 것을 확인했습니다. 기존 방법과 비교하여 이 프로토콜은 더 높은 콜라게나제 농도를 사용하여 장기간의 분리 시간이 세포 생존율에 미치는 영향을 줄이는 동시에 트립신 처리로 인한 잠재적인 세포 손상을 방지합니다. 얻은 일차 연골세포는 순수하고 생존 가능하며 연골 손상 관련 메커니즘에 대한 심층 연구에 적합하며 이는 체외 연구 및 연골 질환의 임상 치료에 중요한 의미를 갖습니다.
관절 연골 파괴는 OA 및 RA와 같은 다양한 연골 질환의 주요 원인입니다 1,2. 연골의 주요 세포 유형인 연골세포는 항상성을 유지하고 손상에 대한 반응으로 복구를 촉진하는 데 필수적입니다3. 연골 세포 활동의 변화는 연골의 구조적 완전성에 영향을 미칠 뿐만 아니라 염증 반응과 진행성 조직 변성을 유도합니다4. 따라서 연골세포의 생물학적 특성에 대한 심층적인 조사는 이러한 질병의 병인을 밝히는 데 중요합니다.
최근 몇 년 동안 염증 반응에서 연골 세포의 역할이 점점 더 주목을 받고 있습니다. 연구에 따르면 IL-1β 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 염증성 사이토카인은 연골 세포의 대사 과정을 크게 손상시켜 기질 분해 효소의 발현을 증가시키고 기질 합성을 감소시키는 것으로 나타났습니다 5,6,7. 이러한 변화는 궁극적으....
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모든 동물 실험은 시안 홍후이 병원 윤리위원회(제202309009호)의 승인을 받았으며, 실험 절차는 동물 실험을 위한 교체, 감소 및 개선의 3R 원칙을 엄격히 준수했습니다.
그림 1A 는 시약 및 장비 준비의 개략도를 보여줍니다. 재료 표 에는 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 장비에 대한 정보가 포함되어 있습니다.
1. 실험용 마우스
참고: 이 연구에는 4마리의 3일 된 야생형 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다.
2. ....
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그림 1, 그림 2 및 그림 3에 설명된 바와 같이, 우리는 프로토콜을 수행하고 마우스 무릎 관절에서 일차 연골 세포를 성공적으로 분리했습니다. 약 10mg의 신생아 마우스 연골에서 생존율이 >90%인 약 1× 104개의 세포를 얻었습니다. 시험관 내 배양 첫날, 일차 마우스 연골 세포는 둥근 형태를 보였으며 대부분의 세포는 현탁액에 있고 아직 배양 접시 바닥에 완전히 부착되지 않았습니다. 2일째에 일부 세포는 배양 접시에 부착되기 시작했고 점차 시험관 내 환경에 적응했습니다. 5일째에 DMEM/F12 배지의 세포는 거의 모든 세포가 부착되고 정상적인 증식을 보이며 강력한 성장을 보였습니다(그림 4A). 약 3일마다 세포는 한 번의 증식 주기를 완.......
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일차 연골 세포의 분리 및 배양은 연골 질환의 병태생리학을 밝히는 데 필수적입니다22. 일차 연골세포 배양에서 콜라게나제 농도와 소화 시간을 최적화하는 것은 잠재적인 세포 손상을 줄이면서 세포외 기질의 분해 균형을 맞추기 때문에 매우 중요합니다17. 본원에서, 우리는 마우스 연골 조직으로부터 일차 연골 세포를 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 마우스 연골 조직 1mg당 10 3개의연골 세포 × 약 1-2개를 얻을 수 있습니다. 이 접근법은 충분한 수의 일차 연골 세포를 신속하게 분리할 수 있으며 재현성이 높고 실용적입니다. 분리된 연골세포는 시험관 내에서 전형적인 형태와 기능적 특성을 유지하므로 연골세포 유전자 발현의 변화를 쉽게 조사하고 연골 대사와 관련된 기능적 분석을 수행할 수 있습니다. 또한, 이러한 세포는 3D 연골 배양 실험과 같은 고급 응용 분야에 .......
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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
이 작업은 중국 국가자연과학재단(제82370909호)의 지원을 받았습니다. 그림 1, 그림 2 및 그림 3 은 Figdraw를 사용하여 작성되었습니다.
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| 100 & 뮤; M 셀 체 | 상곤바이오텍 | F613463-0001 | |
| 15mL 원추형 원심분리기 튜브(멸균, 효소 없음) | 서비스바이오 | EP-1501-J | |
| 50mL 원추형 원심분리기 튜브(멸균, 효소 없음) | 서비스바이오 | EP-5001-J | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | 서비스바이오 | CCP-6H | |
| 항-COL2A1 토끼 다클론 항체 | 면역웨이 | YT1022 시리즈 | 1차 항체; WB: 1/500 |
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| 콜라게나제 II | 솔라바이오 | C8150 | |
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