이 프로토콜은 6-8시간 이내에 충분한 일차 연골 세포를 분리할 수 있게 하여 연골 생물학 및 연골 질환 메커니즘에 대한 추가 심층 조사를 용이하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
관절 연골 파괴는 골관절염(OA) 및 류마티스 관절염(RA)을 포함한 다양한 연골 질환의 주요 원인 인자인 연골 세포 활동의 변화로 이어집니다. 연골에서 가장 풍부한 세포 유형인 연골세포의 생물학적 특성에 대한 심층 연구는 효과적인 질병 치료 전략 개발에 필수적입니다. 일차 연골세포의 분리 및 배양은 연골 질환 조사에 중요한 실험 자료를 제공하고 연골 손상 및 복구 메커니즘을 밝히는 데 기여합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 유래한 일차 연골 세포에 대한 시험관 내 분리 및 배양 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 최적화된 콜라게나제 II 프로토콜을 사용하여 신생아 마우스 무릎 관절 연골 표본에 대해 연골 세포 분리를 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 세포 수율은 연골 조직의 약 1-2 × 10³ 세포/mg이며, 조직의 신선도 및 초기 세포 밀도에 따라 다릅니다. 분리된 세포는 >90%의 생존율을 나타냅니다. 이 프로토콜은 마우스 일차 연골 세포를 예로 사용하여 분리 후 1, 2 및 5일 동안 배양된 세포의 형태학적 특성 및 접착 상태를 보여줍니다. 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 및 웨스턴 블로팅은 인터루킨-1β(IL-1β) 처리가 콜라겐 II형 알파 1(Col2a1)을 감소시키고 매트릭스 메탈로펩티다제 13(Mmp13) 발현을 증가시켜 분리된 연골 세포가 염증 자극에 반응한다는 것을 확인했습니다. 기존 방법과 비교하여 이 프로토콜은 더 높은 콜라게나제 농도를 사용하여 장기간의 분리 시간이 세포 생존율에 미치는 영향을 줄이는 동시에 트립신 처리로 인한 잠재적인 세포 손상을 방지합니다. 얻은 일차 연골세포는 순수하고 생존 가능하며 연골 손상 관련 메커니즘에 대한 심층 연구에 적합하며 이는 체외 연구 및 연골 질환의 임상 치료에 중요한 의미를 갖습니다.
서론
관절 연골 파괴는 OA 및 RA와 같은 다양한 연골 질환의 주요 원인입니다 1,2. 연골의 주요 세포 유형인 연골세포는 항상성을 유지하고 손상에 대한 반응으로 복구를 촉진하는 데 필수적입니다3. 연골 세포 활동의 변화는 연골의 구조적 완전성에 영향을 미칠 뿐만 아니라 염증 반응과 진행성 조직 변성을 유도합니다4. 따라서 연골세포의 생물학적 특성에 대한 심층적인 조사는 이러한 질병의 병인을 밝히는 데 중요합니다.
최근 몇 년 동안 염증 반응에서 연골 세포의 역할이 점점 더 주목을 받고 있습니다. 연구에 따르면 IL-1β 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 염증성 사이토카인은 연골 세포의 대사 과정을 크게 손상시켜 기질 분해 효소의 발현을 증가시키고 기질 합성을 감소시키는 것으로 나타났습니다 5,6,7. 이러한 변화는 궁극적으로 연골의 점진적인 퇴화와 관절 기능 장애로 이어집니다. 따라서 시험관 내 모델 내에서 병리학적 조건에서 연골세포의 생물학적 변화를 조사하는 것이 특히 중요해졌습니다. 전통적인 2차원(2D) 단층 배양을 기반으로 3차원(3D) 연골 세포 배양 및 오가노이드 기술의 최근 발전이 연골 관련 연구에 점점 더 많이 채택되고 있습니다. 이러한 정제된 시스템은 보다 생리학적으로 관련성이 높은 미세 환경을 제공하고 질병 맥락에서 연골 세포 행동에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다8.
세포 공급원의 선택은 시험관 내 소견이 관절의 병태생리학을 정확하게 요약하는지 여부를 결정합니다. 불멸화된 연골 세포 계통 또는 연골 외식편과 달리 일차 연골 세포는 관절 연골의 천연 유전적 배경, 기계에 민감한 칼슘 신호 전달 경로 및 표현형 안정성을 유지하므로 상주 연골 세포의 능력을 보다 밀접하게 반영하는 우수한 연골 형성 능력 및 생물학적 행동을 나타냅니다9. 칼슘 신호 전달 소스와 주요 이온 채널 및 다운스트림 경로의 체계적인 차이는 일차 연골 세포와 ATDC5 세포주 사이에 문서화되었습니다10. 따라서 관절 생리학이나 병리학을 조사할 때 일차 연골세포를 우선시해야 합니다. 따라서 일차 연골 세포의 분리 및 배양을 최적화하는 것은 질병 관련 생물학을 정확하게 모델링하고 잠재적인 치료 약물을 탐색하는 데 필수적입니다 11,12,13,14,15. 그럼에도 불구하고 기존 방법은 장기간의 소화로 인해 세포 생존력 또는 표현형 무결성을 손상시킵니다16,17.
여기에서는 충분한 세포를 빠르게 생산하는 마우스 연골 조직에서 유래한 일차 연골 세포의 시험관 내 분리 및 배양을 위한 프로토콜을 설명합니다. 기존의 낮은 효소 농도, 장기간 소화 프로토콜과 비교하여 이 연구는 효소 소화 조건 및 조직 전처리 단계를 최적화했습니다. 이 최적화는 트립신 처리로 인한 잠재적인 세포 손상을 피하면서 소화 시간을 6-8시간으로 크게 단축했습니다15,17. 이 방법을 사용하면 마우스 연골 조직의 각 mg에서 약 1-2 ×10 3개의 연골 세포를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 일차 연골세포를 분리하고 배양하기 위한 신뢰할 수 있는 가이드를 제공하여 연골 질환 연구를 위한 강력한 모델을 제공합니다.
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프로토콜
모든 동물 실험은 시안 홍후이 병원 윤리위원회(제202309009호)의 승인을 받았으며, 실험 절차는 동물 실험을 위한 교체, 감소 및 개선의 3R 원칙을 엄격히 준수했습니다.
그림 1A 는 시약 및 장비 준비의 개략도를 보여줍니다. 재료 표 에는 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 장비에 대한 정보가 포함되어 있습니다.
1. 실험용 마우스
참고: 이 연구에는 4마리의 3일 된 야생형 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다.
- 케이지를 25°C ± 2°C의 일정한 온도와 50%-60%의 습도에서 12시간/12시간의 빛/암흑 주기로 유지합니다. 특정 병원균 없음(SPF) 등급의 멸균 마우스 사료( 60Co 조사로 멸균) 및 멸균수를 자유롭게 제공합니다.
- 일차 연골 세포를 분리하기 위해 사 후 3일 된 4마리의 마우스로부터 무릎 관절 연골(~10mg/마우스)을 수집합니다.
2. 연골 표본 채취 및 가공
- 마우스 처리 및 조직 해부
- 신생아 마우스를 출생 후 3일 이내에 안락사시킵니다. 75% 의료용 알코올로 닦아 체표면을 살균합니다.
- 멸균 수술 기구로 마우스 무릎 관절을 분리합니다. 멸균 1x PBS에 넣습니다.
- 무균 수술 기구를 사용하여 무릎 관절을 둘러싼 근육, 뼈, 활막 및 기타 증식성 결합 조직을 조심스럽게 절제합니다. 무릎 관절의 연골 조직만 유지합니다.
- 멸균 1x PBS로 조직 표본을 3회 헹구십시오. 액체를 버리십시오.
참고: 그림 1B 는 연골 조직 획득 및 전처리의 단순화된 개략도를 보여줍니다.
그림 1: 재료 준비 및 연골 표본 처리의 단순화된 작업 흐름. (A) 시약, 소모품 및 주요 기기를 포함한 시약 및 장비 설정의 개략도. (B) 마우스 무릎 관절의 연골 조직을 처리하기 위한 단계별 프로토콜. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 일차 연골세포의 분리 및 배양
- 분리된 연골 조직을 새로운 6웰 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 멸균 11번 수술용 칼날을 사용하여 조직을 약 0.25mm3 크기의 작은 조각으로 다집니다. 미리 냉각된 멸균 1x PBS로 한 번 헹굽니다. 액체를 버리십시오.
- 고농도 콜라게나제 II(25mg/mL, 멸균 Dulbecco's Modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12[DMEM/F12] 기초 배지에 용해됨)를 함유한 예열된(37°C) 분해 용액 2mL를 추가하여 조직 블록을 덮습니다.
- 효소 소화를 위해 37°C에서 15분 동안 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 배양합니다. 배양 후 액체를 버립니다.
- 3.2 및 3.3단계를 반복합니다.
참고: 고농도 효소 소화는 예비 단계입니다. 조직을 사전 소화하고, 더 나은 후속 소화를 위해 구조를 부분적으로 분해하고, 조직 주변에서 절단하여 존재할 수 있는 기질 유착을 제거하는 것을 목표로 합니다. - 저농도 콜라게나제 II(5mg/mL, 멸균 DMEM/F12 기초 배지에 용해)를 함유한 예열된(37°C) 분해 용액 2mL를 첨가하여 조직 블록을 덮습니다.
- 소화를 위해 37°C에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 6-8시간 동안 배양하고 세포 분리의 진행을 관찰합니다. 때때로 느린 수평 쉐이킹(80-120rpm) 또는 부드러운 피펫팅을 수행하여 용해 효율을 높입니다.
참고: 신생아 마우스 조직의 경우, 세포 방출은 약 3시간 동안 볼 수 있으며 6시간에서 8시간 사이에 완전한 분리가 달성될 수 있습니다. 6-8시간 콜라게나제 II 치료 동안 매시간 용해를 관찰하고 육안으로 명백한 조직 덩어리가 보이지 않고 세포의 90%가 현미경으로 자유롭고 현탁 상태일 때 소화를 종료합니다. 소화 과정에서 액포 유사 연골 세포가 광학 현미경으로 연골 조직 덩어리에서 점차 분리되는 것을 관찰할 수 있습니다. 이 단계를 여러 번 반복하여 장기간의 소화로 인한 연골세포의 손상을 최소화할 수 있으며, 소화 용액을 신선한 저농도 콜라게나제 II 소화 용액으로 대체하여 세포 수율을 높일 수 있습니다. - 100μm 세포 스트레이너를 통해 멸균 50mL 원심분리 튜브로 모든 분해 산물을 여과합니다.
참고: 연골 세포 응집체의 손실을 방지하고 수율을 높이기 위해 100μm 세포 여과기를 사용하십시오. 잔류 조직 조각은 배지 교환 중에 제거됩니다. - 멸균 1x PBS로 세포 배양 플레이트를 헹굽니다. 셀 스트레이너를 다시 통해 여과합니다.
- 이전 단계의 모든 여과액을 15mL 원심분리기 튜브에 수집합니다. 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 버립니다.
- 멸균 1x PBS 2mL를 첨가하고 피펫으로 가볍게 불어서 침전물을 부드럽게 재현탁합니다. 멸균 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 버립니다.
- 15% 소태아 혈청(FBS) 및 1% P/S를 포함하는 2mL의 새로 준비된 멸균 DMEM/F12 완전 배지로 4.10단계의 침전물을 재현탁합니다. 혈구측정기를 사용하여 수확된 세포 현탁액을 열거한 다음 세포를 2-2.5 × 105 cells/cm2의 멸균 10cm 배양 접시에 플레이트합니다. 완전 배지로 최종 부피 10mL까지 보충합니다.
참고: 연골세포 파종 밀도는 2-2.5 × 105 세포/cm2여야 하며, 저밀도 또는 중간 밀도 파종은 관절 연골세포가 섬유아세포로 표현형 이동을 초래할 수 있기 때문입니다. 분리된 1차 세포의 증식 활성 및 생존력은 선택적 MTT 분석 또는 트리판 블루 배제 염색(선택적 단계)을 사용하여 평가할 수 있습니다. - 37°C에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
- 광학 현미경으로 세포가 벽에 완전히 부착되는 것을 관찰한 후 신선한 DMEM/F12 완전 배지(10% FBS, 1% P/S 포함)로 교체합니다.
- 2일마다 배지를 교체하십시오. 합류점이 70%에 도달할 때까지 배양을 계속하며, 이 시점에서 후속 실험을 수행할 수 있습니다.
참고: 배양 배지의 혈청 농도는 세포 상태에 따라 15%까지 증가할 수 있습니다. 그림 2 는 연골 조직 소화, 분리 및 일차 세포 배양의 단순화된 개략도를 보여줍니다.
그림 2: 연골 조직 소화, 일차 세포 분리 및 배양을 위한 단순화된 절차. 연골을 다진 후 고농도 콜라게나제 II 분해액으로 15분 동안 연속적으로 분해하고, 1회 반복한 후 저농도 콜라게나제 II 분해액으로 6-8시간 동안 분해하여 세포를 분리하였다. 그런 다음 소화된 조직을 여과하고 여과액을 수집하여 원심분리했습니다. 세포 펠릿을 1x PBS로 세척하고 합류가 70%에 도달할 때까지 DMEM/F12 배지에서 배양했으며, 이 시점에서 세포는 후속 실험을 위한 준비가 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 일차 연골세포의 기능 검증
- 염증 상태에서 연골 세포의 대사 및 변화.
- 염증 상태를 시뮬레이션하기 위해 10ng/mL IL-1β로 세포를 24시간 동안 처리합니다.
- RT-qPCR 및 웨스턴 블로팅의 경우 총 RNA 또는 총 단백질을 추출하여 COL2A1, MMP13과 같은 연골세포 세포외 기질의 대사 지표를 검출합니다.
참고: 그림 3은 일차 연골 세포의 기능적 검증 및 후속 실험 절차의 개략도를 보여줍니다. 항체 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR에 대한 자세한 절차는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5에 나와 있다. 모든 방법은 표준 프로토콜11,18을 따랐습니다.
그림 3: 일차 연골세포 기능 검증 프로그램의 개략도. IL-1β 치료에 의해 유발된 염증 상태; RT-qPCR 및 웨스턴 블로팅으로 평가한 연골 관련 표현형에 미치는 영향. 약어: IL-1β = 인터루킨-1β; RT-qPCR = 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 웨스턴 블로팅 워크플로우 조건 | |
| 걸음 | 상태/시약 |
| SDS-PAGE 겔 제제 | 8 % (w/v) Tris-HCl 분리 겔 |
| 스태킹 전기영동 | 80V, 30–40분 |
| 전기 영동 분해 | 120V, 1–1.5시간 |
| 갈아타다 | 세미 건식, 15 V, 30–60 분 |
| 블로킹 | 신속 차단 완충액, 실온에서 2시간 |
표 1: 웨스턴 블로팅 워크플로우 조건. SDS-PAGE 구성, 전기영동 매개변수, 전이 설정 및 차단 절차를 포함한 웨스턴 블로팅 조건 요약.
| 역전사 반응 믹스 | |
| 구성 요소 | 부피(μL) |
| 5× 전사체 역전사 효소 반응 완충액 | 4 |
| 데옥시뉴클레오티드 믹스 (각 10 mM) | 2 |
| 프로텍터 RNase 억제제 (40 U/μL) | 0.5 |
| 전사체 역전사 효소(20 U/μL) | 0.5 |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 20으로 |
| 총 볼륨 | 20 |
표 2: 역전사 반응 혼합물. cDNA 합성을 위한 역전사 반응 조성물.
| 마우스 일차 연골 세포의 RT-qPCR에 대한 프라이머 정보 | ||||
| 유전자 이름 | 시퀀스(5'3 ') | 어닐링 온도(°C) | ||
| 엠가디 | 전달 | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| 후진 | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | 전달 | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| 후진 | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| 댈13 | 전달 | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| 후진 | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
표 3: 마우스 일차 연골 세포의 RT-qPCR에 대한 프라이머 정보. 마우스 일차 연골 세포에서 Gapdh, Col2a1 및 Mmp13 전사체를 정량화하는 데 사용되는 프라이머의 서열 및 어닐링 온도(60°C).
| RT-qPCR 반응 믹스 | |
| 구성 요소 | 부피(μL) |
| 2 × SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 | 10 |
| 희석된 cDNA 주형 | 8 |
| 포워드 프라이머(10μM) | 1 |
| 역방향 프라이머(10μM) | 1 |
| 총 볼륨 | 20 |
표 4: RT-qPCR 반응 혼합물. RT-qPCR 반응 혼합물(20 μL)과 SYBR Green 마스터 믹스, 템플릿 및 프라이머.
| RT-qPCR 사이클링 프로토콜 | ||
| 걸음 | 온도(°C) | 시간 |
| 초기 변성(×1) | 95 | 10 분 |
| 변성 (×40) | 95 | 5초 |
| 어닐링/신장 (×40) | 60 | 15초 |
| 연장 (×40) | 72 | 30초 |
| 용융 곡선(×1) | 95 55 95 | 60초 30 초 30초 |
표 5: RT-qPCR 사이클링 프로토콜. 95°C에서 5초 동안 변성, 60°C에서 15초 동안 어닐링/신장, 최종 용융 곡선 분석을 40사이클 동안 수행했습니다.
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결과
그림 1, 그림 2 및 그림 3에 설명된 바와 같이, 우리는 프로토콜을 수행하고 마우스 무릎 관절에서 일차 연골 세포를 성공적으로 분리했습니다. 약 10mg의 신생아 마우스 연골에서 생존율이 >90%인 약 1× 104개의 세포를 얻었습니다. 시험관 내 배양 첫날, 일차 마우스 연골 세포는 둥근 형태를 보였으며 대부분의 세포는 현탁액에 있고 아직 배양 접시 바닥에 완전히 부착되지 않았습니다. 2일째에 일부 세포는 배양 접시에 부착되기 시작했고 점차 시험관 내 환경에 적응했습니다. 5일째에 DMEM/F12 배지의 세포는 거의 모든 세포가 부착되고 정상적인 증식을 보이며 강력한 성장을 보였습니다(그림 4A). 약 3일마다 세포는 한 번의 증식 주기를 완...
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토론
일차 연골 세포의 분리 및 배양은 연골 질환의 병태생리학을 밝히는 데 필수적입니다22. 일차 연골세포 배양에서 콜라게나제 농도와 소화 시간을 최적화하는 것은 잠재적인 세포 손상을 줄이면서 세포외 기질의 분해 균형을 맞추기 때문에 매우 중요합니다17. 본원에서, 우리는 마우스 연골 조직으로부터 일차 연골 세포를 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 마우스 연골 조직 1mg당 10 3개의연골 세포 × 약 1-2개를 얻을 수 있습니다. 이 접근법은 충분한 수의 일차 연골 세포를 신속하게 분리할 수 있으며 재현성이 높고 실용적입니다. 분리된 연골세포는 시험관 내에서 전형적인 형태와 기능적 특성을 유지하므로 연골세포 유전자 발현의 변화를 쉽게 조사하고 연골 대사와 관련된 기능적 분석을 수행할 수 있습니다. 또한, 이러한 세포는 3D 연골 배양 실험과 같은 고급 응용 분야에 ...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 중국 국가자연과학재단(제82370909호)의 지원을 받았습니다. 그림 1, 그림 2 및 그림 3 은 Figdraw를 사용하여 작성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1× PBS 분말 (2 L) | 서비스바이오 | G0002-2L | |
| 100mm 세포 배양 접시 | 서비스바이오 | CCD-100 시리즈 | |
| 100 & 뮤; M 셀 체 | 상곤바이오텍 | F613463-0001 | |
| 15mL 원추형 원심분리기 튜브(멸균, 효소 없음) | 서비스바이오 | EP-1501-J | |
| 50mL 원추형 원심분리기 튜브(멸균, 효소 없음) | 서비스바이오 | EP-5001-J | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | 서비스바이오 | CCP-6H | |
| 항-COL2A1 토끼 다클론 항체 | 면역웨이 | YT1022 시리즈 | 1차 항체; WB: 1/500 |
| 항-GAPDH 마우스 단클론 항체 | 프로틴테크 | 60004-1-IG | 1차 항체; 수: 1/2000 |
| 항-MMP13 토끼 다클론 항체 | 면역웨이 | YT2796 | 1차 항체; WB: 1/1000 |
| 무균 울트라 클린 벤치 | 써모 피셔 | 51029704 | |
| 세포 배양 인큐베이터 | 써모 피셔 | 51033782 | |
| 콜라게나제 II | 솔라바이오 | C8150 | |
| 맞춤형 프라이머(Gapdh, Col2a1, Mmp13) | 상곤바이오텍 | Primer BLAST를 사용하여 설계 | |
| DMEM/F12 매체 | 하이클론 | SH30023.01 | |
| 태아 소 혈청 | 엑스셀 | FCS500 | |
| HRP-Goat Anti-Mouse 다클론 항체 | 면역웨이 | RS0001 | 2차 항체; WB: 1/10000 |
| HRP-염소 항토끼 다클론 항체 | 면역웨이 | RS0002 | 2차 항체; 와브: 1/10000 |
| 거꾸로 된 위상차 현미경 | 올림푸스 | CKX53 | |
| 마이크로피펫 | 써모 피셔 | ||
| 소형 벤치탑 원심분리기 | 순네 | SN-TDL-6 | |
| 11호 수술용 칼날 | 서비스바이오 | QXJZ-11 시리즈 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액(100X) | 비요타임 | C0222 | |
| 작은 동물 해부 기구 세트 | 서비스바이오 | QXTZ01 시리즈 |
참고문헌
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