방법 논문

분산도 및 말단기가 다양한 합성 고분자의 특성화를 위한 MALDI-ToF MS 분석법

DOI:

10.3791/68455

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2025년 10월 3일

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1Department of Chemistry, Tulane University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법을 사용하여 다양한 분산 및 말단 그룹을 가진 합성 폴리머를 특성화하기 위해 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석에 대한 자세한 지침과 예를 제공합니다.

초록

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매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-ToF MS)은 합성 고분자를 특성화하기 위한 효과적인 분석 도구로, 정밀한 분자량 결정과 반복 단위 질량 및 말단 그룹 식별과 같은 구조적 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 적절한 매트릭스 및 양이온 선택을 통한 시료 준비, 데이터 수집 및 정확한 질량 측정을 보장하기 위한 교정 방법을 포함하여 폴리머 분석을 위한 단계를 자세히 설명합니다. 이는 단분산 물질에서 고분산 물질에 이르기까지 폴리머를 분석하는 데 있어 MALDI-ToF MS의 다양성을 강조하는 동시에 고분산 시료를 분해하는 데 한계가 있음을 관찰합니다. 동위원소 패턴을 포함한 이론적 질량과 관측된 질량을 비교함으로써 이 방법을 사용하면 반복 단위와 말단 그룹을 확실하게 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 매트릭스 선택, 분산 범위에 걸친 스펙트럼 해석, 고유한 동위원소 특징 또는 준안정 이온 형성을 가진 폴리머의 특성화에 대한 대표 데이터를 제시하여 신규 사용자를 지원합니다. 문제 해결 전략에는 매트릭스 간섭 및 시료 준비 중 양이온을 추가하지 않고 이온화되는 시료와 같은 문제를 해결하는 것이 포함됩니다. 전반적으로 이 가이드는 MALDI-ToF MS를 고분자 분석을 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 기술로 사용하기 위한 기초 역할을 합니다.

서론

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매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-ToF MS)은 합성 고분자를 특성화하기 위한 매우 효과적인 분석 기술입니다 1,2,3,4. 많은 폴리머는 반복 단위 구조를 확인하기 위해 핵 자기 공명(NMR)으로 특성화될 수 있습니다. 그러나 대부분의 말단기는 저분자량 폴리머의 경우에도 반복 단위 피크의 일부이며, 폴리머의 분자량이 증가함에 따라 말단 그룹 신호는 NMR에서 정량화하기 어려워 보입니다5. 그러나 MALDI-ToF MS 데이터는 더 높은 분자량에서도 이것이 말단 그룹임을 확인합니다. 이 질량 분석 기술은 부드러운 이온화 기능으로 잘 알려져 있으며 대부분 단편화가 매우 최소화된 단일하전한 고분자 이온을 생성합니다2. 이를 통해 정밀한 분자량 측정 및 상세한 구조 분석이 가능하여 빠르고 정확한 결과를 얻을 수 있으며, 반복 단위 질량, 말단 그룹 식별, 저분산성 폴리머의 경우 수-평균 분자량(Mn), 중량-평균 분자량(Mw) 및 분산도(Đ)6 측정과 같은 귀중한 정보를 제공합니다.

MALDI-ToF MS는 분산도가 다양한 폴리머를 분석할 수 있지만 분산도가 높을 때 한계가 있습니다. 덴드리머와 같은 단분산 폴리머의 경우, 이 방법은 질량을 확인하고 말단 그룹을 식별하는 데 이상적입니다7. 분산도가 낮은 폴리머(1.01-1.09)와 일부 분산도가 중간 정도인 폴리머(Đ = 1.1-1.3)의 경우 MALDI-ToF MS를 사용하여 폴리머 반복 단위 질량, 말단 그룹 질량, Đ, Mn 및 Mw8을 측정할 수도 있습니다. 그러나 고도로 분산된 폴리머(Đ = 1.3-10)의 경우 이것이 어려워집니다. 광범위하게 분산된 폴리머의 경우, 낮은 분획은 분자량이 높은 폴리머보다 훨씬 더 높은 강도를 나타내므로 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 같은 다른 특성화 기술보다 인위적으로 낮은 분산도를 나타냅니다. 이를 "낮은 질량 편향"이라고 합니다. 평균 반복 단위 질량 및 말단 그룹은 저분자량 결과에서 확인할 수 있지만 MALDI-ToF MS9의 고분산성 폴리머에 대한 진정한 Mn, Mw 및 Đ를 결정하는 것은 불가능합니다. 따라서 진정한 Mn, Mw 및 Đ를 결정하기 위해 광범위하게 분산된 폴리머에 대한 특성화 기술로 SEC를 추가해야 합니다.

시료 전처리의 최적화는 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 2,10에서 고품질 피크 분해능을 위해 필수적입니다. 첫 번째 단계는 폴리머 극성을 기반으로 적절한 매트릭스를 선택하는 것입니다. 비극성 폴리머의 경우 트랜스-2-[3-tert-부틸페닐)-2-메틸-2-프로페닐리덴](DCTB), 갈비녹실 자유 라디칼(GFR) 및 9-니트로안트라센(9-NA)과 같은 매트릭스가 일반적으로 사용됩니다11. 극성 폴리머는 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA), 디트라놀, 2-(4-하이드록시페닐아조)벤조산(HABA) 및 2,5-디하이드록시벤조산(DHB)12,13,14과 같은 매트릭스에 더 적합합니다. 이 프로토콜에서는 비극성 폴리머에 대한 효과로 인해 DCTB를 1차 매트릭스로 선택했으며 극성 폴리머에는 CHCA를 사용했습니다. 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속은 산소 함유 폴리머를 효과적으로 이온화하는 반면 은과 같은 전이 금속은 불포화 탄화수소에 더 적합하기 때문에 양이온 선택도 중요한 역할을 합니다10,14.

매트릭스와 분석물이 선택되면 시료 용액 혼합물에 대한 최적의 양이온:분석물:매트릭스 비율이 결정됩니다. 이 샘플 용액 혼합물은 1μL의 양으로 대상 플레이트에 추가됩니다. 양이온:분석물:매트릭스 선택의 올바른 비율이 하나 이상 없으면 MALDI-ToF MS 데이터 수집의 감도에 영향을 미칠 수 있습니다. 아래의 대표 데이터에 대해 샘플 전처리는 최상의 분해능 2,15에 최적화되었습니다.

샘플 용액을 준비하고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에 추가한 후 이 샘플을 MALDI-ToF MS 기기에 삽입하여 데이터 수집을 시작합니다. 이 연구를 위해 데이터는 양이온 모드에서만 수집되었으며 Payne et al.16의 이전 작업을 기반으로 새로운 MALDI-ToF 질량 분석기를 활용했습니다. 레이저 출력, 레이저 빔 직경, 검출기 이득 및 펄스 추출 지연 시간과 같은 중요한 MALDI-ToF MS 매개변수를 조정하여 획득 중 분해능을 향상시킬 수 있습니다. MALDI-ToF MS 데이터 수집에는 선형 및 반사론17의 두 가지 모드를 사용할 수 있습니다. 반사콘 모드는 선형 모드(18,19)에 비해 더 높은 신호 분해능을 달성하기 위해 선호된다. 선형 모드에서는 가속 이온이 비행 튜브를 통해 검출기로 직접 이동합니다. 대조적으로, 반사관 모드는 비행관을 한 번 통과한 다음 두 번째 검출기에 도달하기 전에 비행관을 통해 이온을 다시 반사하여 비행 경로를 약 두 배로 늘립니다. 이 접근 방식을 사용하면 질량은 비슷하지만 속도는 다른 이온을 구별할 수 있습니다20,21. 레이저 출력은 또한 신호 대 잡음비를 증가시키거나 폴리머의 단편화를 감소시키는 요인이 될 수 있습니다22. 샘플을 제거할 수 있는 가장 낮은 레이저 출력은 신호 대 잡음비를 개선하고 단편화 가능성도 감소시킵니다22. 신호 분해능을 최적화하고 신호 대 잡음비를 최대화한 후, 획득은 선택한 폴리머 분석물에 대한 고품질 데이터를 제공할 수 있습니다.

MALDI-ToF MS에서 정확한 질량 측정을 위해서는 교정이 필수적입니다. 내부 및 외부 교정의 두 가지 주요 방법이 사용되며, 둘 다 분석물의예상 범위를 포괄하는 알려진 질량을 가진 교정제에 의존합니다6. 대표 데이터에서 분석된 폴리머의 경우, 넓은 질량 범위에 걸쳐 교정하기 위해 단분산 덴드리머 캘리브란트가 선택되었습니다23. 교정제가 양이온, 분석물 및 매트릭스와 혼합되는 내부 교정은 교정제와 분석물 모두 동일한 조건을 경험하고 교정 질량 이동이 동일하게 영향을 미치기 때문에 질량 정확도를 향상시킵니다. 그러나, 이 방법은 생성된 폴리머 신호와 피크 중첩을 초래하여 분석을 복잡하게 만들 수 있다24. 대조적으로, 이 프로토콜에 사용되는 외부 보정은 표적 플레이트의 양이온:분석물:매트릭스와 별도로 양이온:교정자:매트릭스를 준비하고 발견함으로써 피크 중복을 방지합니다. 그러나 표적 전체에 걸쳐 레이저 강도 또는 이온화 효율의 변화와 같은 샘플 배치 및 국소 기기 응답의 약간의 차이로 인해 경미한 질량 부정확성이 발생할 수 있으므로 교정제와 분석물은 서로 근접해야 합니다24. 대표적인 데이터에서 외부 교정 방법을 사용하여 관찰된 질량 차이는 이론값에서 0.100 Da 미만이었습니다.

마지막으로, 모든 폴리머에 대해 MALDI-ToF MS 데이터를 분석하여 반복 단위 질량을 결정하고 폴리머의 말단 그룹 분석을 수행할 수 있습니다. 반복 단위 질량은 소프트웨어 도구를 사용하여 이론적인 반복 단위 질량을 MALDI-ToF 질량 스펙트럼에서 관찰된 반복 단위 질량과 비교하여 확인할 수 있습니다. 일치하면 폴리머는 예상되는 반복 단위 구조(또는 이성질체)를 가질 가능성이 높습니다. 폴리머에 대한 MALDI-ToF MS 말단 그룹 분석은 분석물의 이론적 질량을 계산하는 것으로 시작됩니다. 여기에는 반복 단위, 말단 그룹 및 샘플 준비에서 선택된 양이온의 결합 질량이 포함됩니다. 단분산 거대분자의 경우 계산에는 선택된 양이온의 질량과 함께 하나의 분석물의 총 질량이 포함됩니다. 화학 구조를 그리기 위한 소프트웨어 도구는 이러한 계산에 도움이 될 수 있습니다. 그런 다음 소프트웨어의 이론적 질량을 MALDI-ToF 질량 스펙트럼에서 관찰된 질량과 비교하여 폴리머가 예상 분자 구조와 일치하는지 확인합니다. 그러나 관찰된 반복 단위 질량이 이론적 값과 거의 일치하지만 말단기와 양이온을 포함한 지정된 n-mer의 총 질량이 일치하지 않는 경우 불일치는 예상치 못한 말단기의 존재를 시사할 수 있습니다. 알려지지 않은 말단기를 식별하기 위해 반응 조건을 검토하여 관찰된 말단기를 형성하기 위해 반응할 수 있는 대체 분자 또는 시약을 결정합니다. 이 단계는 폴리머의 모든 구조를 정확하게 특성화하는 데 중요합니다.

이 프로토콜은 합성 폴리머의 MALDI-ToF MS 분석을 위한 단계별 방법을 제공하며, 사용자, 특히 초보자의 시료 준비, 기기 방법 최적화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 지원하도록 설계되었습니다. 대표 데이터는 주어진 폴리머에 대한 매트릭스 선택을 보여줍니다. 단분산, 적당히 분산 및 고분산 샘플을 포함하여 다양한 분산을 갖는 폴리머의 스펙트럼 및 분석; 뚜렷한 동위원소 분해능 패턴(예: 할로겐화) 및 준안정 이온 형성이 발생하기 쉬운 고분자(예: 아지드 말단)를 포함하는 고분자의 말단 그룹 분석; 말단 그룹 및 양이온 부가물을 포함하여 반복 단위 질량 및 총 폴리머 질량을 확인하기 위해 관찰된 질량과 이론적 질량의 비교를 포함하는 MALDI-ToF MS를 사용한 폴리머의 데이터 분석; 저질량 폴리머 및 자체 이온화 폴리머의 매트릭스 간섭에 대한 문제 해결의 예.

이 프로토콜은 MALDI-ToF MS 폴리머 특성 분석을 위한 기반을 제공할 뿐만 아니라 시료 준비, 단계별 기기 방법 최적화(그림 1) 및 새로 합성된 합성 폴리머와 상용 합성 폴리머 모두에 대한 스펙트럼 해석에 대한 지침을 제공합니다.

프로토콜

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주의 : 다시view 사용하기 전에 모든 화학 물질에 대한 안전 보건 자료(SDS). 모든 시료 전처리 및 MALDI-ToF MS 플레이트 전처리는 흄 후드에서 수행하고 보안경, 실험실 가운 및 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.

1. 샘플 준비

  1. 매트릭스, 양이온, 교정제 및 분석물 원액의 제조
    1. 분석물 및 양이온과의 상용성을 위해 선택된 용매 1mL에 원하는 양이온 2mg을 용해시켜 알칼리 양이온 원액을 준비합니다. 샘플 1의 경우 트리플루오로아세테이트 나트륨 2mg을 THF 1mL에 용해시켰습니다.
    2. 분석물의 용해도에 따라 원하는 매트릭스 20mg을 호환 용매 1mL에 용해시켜 매트릭스 원액을 준비합니다. 예: 대표 데이터(샘플 1)의 경우 DCTB 20mg을 테트라히드로푸란(THF) 1mL에 용해시킵니다.
    3. 공급업체 지침에 따라 교정 원액을 준비하십시오.
    4. 10mg의 분석물을 1mL의 적절한 용매에 용해시켜 분석물 용액을 준비합니다. 시료 1의 경우 분석물 10mg을 THF 1mL에 용해시킵니다.
  2. MALDI-ToF MS 타겟 플레이트의 준비
    1. MALDI-ToF MS 타겟 플레이트를 청소합니다.
    2. 분석물 수집 샘플 및 보정 샘플 용액을 준비합니다. 양이온, 분석물 및 매트릭스 원액을 1:5:20 μL 비율로 튜브 A와 와류에 첨가합니다. 외부 보정의 경우: 양이온, 보정액 및 매트릭스 원액을 1:5:20 μL 비율로 튜브 B와 와용돌이에 첨가합니다.
    3. 분석물과 보정액 샘플 용액 혼합물을 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에 추가합니다. 건조 액적 방법을 사용하여 양이온:분석물:매트릭스 샘플 용액 혼합물(튜브 A)의 0.5 μL를 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에 피펫팅합니다. 건조 액적 방법을 사용하여 양이온:교정제:매트릭스 혼합물(튜브 B) 0.5μL를 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트의 분석물에 인접한 지점에 피펫팅합니다. 각 지점의 정확한 위치(행 문자 및 열 번호)를 기록하여 데이터 수집 중에 샘플과 교정물을 쉽게 찾을 수 있습니다.

2. 데이터 수집

  1. MALDI-ToF MS 타겟 플레이트를 삽입하고 획득 방법을 선택합니다.
    1. MALDI-ToF MS 타겟 플레이트를 기기에 삽입합니다. 타겟 플레이트를 올바른 방향으로 홀더에 놓고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트를 너무 멀리 밀어 넣지 마십시오.
    2. 기기 제어 소프트웨어를 사용하여 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트를 기기에 도킹합니다.
    3. 인스트루먼트 제어 소프트웨어에서 분석법 파일을 선택하고 엽니다. 분석물의 질량 범위 내에서 반사기 양극(RP) 또는 선형 양극(LP) 방법을 선택하십시오.
    4. 기기 제어 소프트웨어를 모니터링하여 타겟 플레이트가 삽입되었고 분석법 설정이 완료되었는지 확인합니다.
      참고: 이러한 대표적인 폴리머에는 산소가 있습니다. 따라서 포지티브 모드가 선택됩니다(대부분의 화합물은 포지티브 모드에서 획득이 완료됨). 대표 데이터의 경우 모든 샘플의 반사경 모드에 대해 RP 방법이 선택되었습니다.
  2. 초기 데이터 수집
    1. 기기 제어 소프트웨어에서 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트와 열 문자 및 행 번호가 표시된 웰 다이어그램을 표시하는 카메라를 찾습니다. 양이온:분석물:매트릭스 혼합물이 포함된 MALDI-ToF MS 웰 을 클릭하여 데이터 수집을 위해 선택합니다.
    2. 기기 제어 소프트웨어의 질량 검출 범위를 500-20000 Da의 넓은 범위로 조정하여 분석물의 예상 질량을 완전히 포착할 수 있도록 합니다. 커서를 사용하여 초기 획득 후 분석물의 예상 질량보다 약 2배 아래 또는 위의 범위를 조정합니다.
    3. 데이터 수집
      1. 기기 제어 소프트웨어의 시작 버튼을 눌러 MALDI-ToF MS 데이터 수집을 시작합니다.
      2. 중지를 누르거나 MALDI-ToF MS 수집이 자동으로 완료되도록 합니다.
      3. 추가를 클릭하여 MALDI-ToF MS 단일 스펙트럼을 합계 스펙트럼 버퍼에 추가합니다.
        참고: MALDI-ToF MS 단일 스펙트럼 버퍼는 개별 MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 저장하고 합계 스펙트럼 버퍼는 여러 수집에서 데이터를 축적하여 신호 강도를 증가시킵니다.
      4. 카메라 피드를 보고 MALDI-ToF MS 레이저의 위치를 변경하고 선택한 동일한 웰 내에서 아무 곳이나 클릭하여 레이저를 새 위치로 이동합니다.
      5. MALDI-ToF MS 획득을 반복하여 MALDI-ToF MS 단일 스펙트럼을 합계 버퍼에 추가합니다. MALDI-ToF MS 결과가 만족스러울 때까지 2.2.3.1 - 2.2.3.4단계를 반복합니다.
      6. 분해능 및 기준선 노이즈에 대한 MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 평가합니다. MALDI-ToF MS 스펙트럼이 높은 분해능과 최소한의 베이스라인 노이즈를 나타내는 경우 교정 단계를 진행합니다. 그렇지 않은 경우 데이터 수집 방법을 최적화하는 것이 좋습니다(예: 레이저 출력, 검출기 게인 또는 펄스 이온 추출 설정 조정).
  3. 데이터 수집 최적화( 그림 1)
    1. MALDI-ToF MS 레이저 출력, 검출기 이득 및 펄스 이온 추출을 한 번에 하나씩 조정하여 분해능을 개선하거나 배경 소음을 줄입니다.
    2. MALDI-ToF MS 분석법을 복제하려면 MALDI-ToF MS LP 또는 RP 분석법을 복사하여 새 이름으로 붙여넣습니다. 생성된 붙여넣은 MALDI-ToF MS 분석법 파일을 열고 파일 이름을 바꿉니다.
    3. 데이터 수집 섹션의 초기 데이터 수집에 대한 섹션 2.2의 모든 단계에 따라 초기 MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 수집합니다. 가장 높은 강도의 MALDI-ToF MS의 피크 세트를 확대하여 기기 제어 소프트웨어에서 분해능 및 기준선 노이즈를 평가합니다.
    4. 획득 최적화
      1. MALDI-ToF MS 레이저 출력 조정
        1. ~4%의 낮은 MALDI-ToF MS 레이저 출력에서 시작하고 초기 데이터 수집에 대해 2.2.3.1 및 2.2.3.2단계에 따라 데이터 수집을 시작하고 중지합니다.
        2. MALDI-ToF MS 단일 버퍼의 분해능 및 기준선 노이즈와 합계 버퍼의 초기 스펙트럼을 관찰하고 비교합니다.
        3. 이온화를 향상시키기 위해 MALDI-ToF MS 레이저 출력을 2%-10% 단위로 증가시킵니다. 초기 데이터 수집에 대한 2.2.3.1 및 2.2.3.2단계에 따라 각 증분 후에 데이터 수집을 시작하고 중지합니다.
        4. 최소한의 노이즈로 고강도 피크를 제공하는 가장 낮은 레이저 출력을 선택하십시오.
          참고: MALDI-ToF MS 레이저 출력이 50% 이상이면 샘플 단편화 가능성이 높아집니다.
      2. MALDI-ToF MS 레이저 직경 최적화
        1. 검출기 탭에서 MALDI-ToF MS 레이저 직경을 조정하여 중형, 대형 및 초색 설정을 테스트합니다. 초기 데이터 수집에 대한 2.2.3.1 및 2.2.3.2단계에 따라 데이터 수집을 시작하고 중지합니다.
        2. MALDI-ToF MS 단일 버퍼의 분해능 및 기준선 노이즈와 합계 버퍼의 초기 스펙트럼을 관찰하고 비교합니다.
        3. 베이스라인 노이즈를 최소화하면서 최적의 분해능을 제공하는 MALDI-ToF MS 레이저 직경을 선택하십시오.
          참고: MALDI-ToF MS 레이저 직경은 레이저 빔 직경을 제어합니다.
      3. MALDI-ToF MS 검출기 이득 조정
        1. 작은 증분으로 MALDI-ToF MS 검출기 이득을 늘리거나 줄입니다. 초기 데이터 수집에 대한 2.2.3.1 및 2.2.3.2단계에 따라 MALDI-ToF MS 검출기 이득의 증가 또는 감소할 때마다 데이터 수집을 시작 및 중지합니다.
        2. MALDI-ToF MS 단일 버퍼를 조정할 때마다 기기 제어 소프트웨어에서 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 신호 강도 및 분해능과 합계 버퍼의 초기 스펙트럼을 관찰합니다.
        3. 최상의 강도와 우수한 신호 분해능을 제공하는 MALDI-ToF MS 검출기 이득을 유지하십시오.
      4. MALDI-ToF MS 펄스 이온 추출 수정
        1. MALDI-ToF MS 펄스 이온 추출을 10ns 단위로 조정합니다. 초기 데이터 수집에 대한 2.2.3.1 및 2.2.3.2단계에 따라 검출기 이득이 증가하거나 감소할 때마다 데이터 수집을 시작하고 중지합니다.
        2. 펄스 이온 추출 변화가 MALDI-ToF MS 신호 분해능을 어떻게 개선하는지 평가합니다.
          참고: MALDI-ToF MS 펄스 이온 추출은 레이저 이온화 사이의 시간 지연으로 정의됩니다. 펄스 이온 추출을 늘리거나 줄임으로써 서로 다른 에너지의 이온은 더 짧거나 더 긴 시간 동안 전기장에 머무르게 됩니다. 시간이 길수록 동일한 질량의 분석물과 약간 다른 시간에 절제되는 양전하를 띤 이온이 전압이 가해질 때 동일한 질량의 분석물 이온과 동일한 속도로 완전히 가속될 수 있습니다. 이것은 해상도를 높이고 신호(25)의 배경 소음을 줄이는 데 사용될 수 있습니다.
    5. 최적의 분해능과 가장 높은 신호 대 잡음비가 달성되면 현재 및 향후 사용을 위해 최적화된 MALDI-ToF MS 분석법 파일을 저장하십시오.
  4. MALDI-ToF MS 교정
    1. 대상 플레이트에서 보정 샘플 을 선택하고 초기 데이터 수집을 위해 섹션 2.2의 모든 단계를 수행하여 보정 MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 수집합니다
      1. 교정 기준점에 액세스합니다. 기기 제어 소프트웨어의 교정 탭으로 이동합니다. 사용된 교정제에 해당하는 적절한 질량 제어 목록을 엽니다.
    2. MALDI-ToF 질량 스펙트럼 교정 피크를 질량 제어 목록의 참조 질량과 일치시킵니다.
      1. 질량 제어 목록에서 MALDI-ToF 질량 스펙트럼의 첫 번째 교정 피크에 해당하는 질량 을 선택합니다. MALDI-ToF 질량 스펙트럼은 선택한 교정 피크를 자동으로 확대합니다.
      2. 교정 신호의 왼쪽을 클릭하여 기준 피크를 설정합니다. 피크가 선택됩니다.
      3. 적용을 선택하여 교정 신호를 질량 제어 목록에서 기준 질량으로 설정합니다.
      4. 모든 추가 교정 피크에 대해 이 과정을 반복합니다. 질량 제어 목록에서 관심 있는 다음 질량 을 선택하고 해당 교정 피크를 정렬한 다음 참조 설정을 적용합니다.
  5. 보정된 고분자 분석물 샘플 수집
    1. 기기 제어 소프트웨어에서 양이온:분석물:매트릭스 혼합물 웰이 포함된 웰을 찾아 선택합니다.
    2. 최적화되고 보정된 분석법을 연 상태에서 섹션 2.2의 모든 단계에 따라 데이터 수집을 수행합니다.
    3. 적절한 파일 이름을 추가하고 추가 분석을 위해 보정된 분석물 MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 저장합니다.
  6. 기기 제어 소프트웨어로 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트를 제거합니다. MALDI-ToF MS 타겟 플레이트 세척

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그림 1: 기기 분석법 최적화를 위한 의사 결정 트리. 이 가이드는 초보 사용자가 기기 분석법 매개변수를 체계적으로 최적화하는 데 도움을 주기 위해 고안되었습니다. 기본 또는 초기 설정으로 시작하여 관찰된 개선 사항에 따라 증가하거나 감소하여 한 번에 하나의 매개변수를 조정합니다. 다음으로, (1) 피크 강도, (2) 기준선 품질(저노이즈), (3) 좁은 피크 및 동위원소 분해능을 제공하는 방향으로 계속 진행합니다. 이 접근 방식은 신뢰할 수 있는 고품질 스펙트럼에 대한 최적의 조건을 식별하는 데 도움이 됩니다. 폴리머 샘플이 이온화되지 않거나 반사경 모드에서 사용 가능한 스펙트럼을 생성하지 않으면 선형 모드로 전환하고 동일한 의사 결정 트리를 사용하여 매개변수를 최적화합니다. 선형 모드는 종종 더 넓은 피크와 제한되거나 동위원소 분해능을 초래하지만 반사경 모드에서 이온화를 잃을 수 있는 고질량 폴리머 또는 폴리머에는 효과적일 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 데이터 분석 및 해석

  1. MALDI-ToF MS 데이터 분석 소프트웨어를 열고 MALDI-ToF MS 분석물 샘플 스펙트럼을 로드합니다.
  2. 분석물 샘플에 대해 올바른 MALDI-ToF MS 처리 방법을 선택하십시오. 여기서, 모든 샘플은 동위원소 분해능을 가지며, MALDI-ToF MS 처리 방법을 선택한 모든 피크에 대해 첫 번째 피크를 선택했습니다.
    참고: MALDI-ToF MS 처리 매개변수는 합성 폴리머 샘플에 맞게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 폴리머에 대한 MALDI-ToF MS 처리 방법은 MALDI-ToF MS 기기 기술자의 기술 교육 세션에서 개발되었습니다. MALDI-ToF MS 평균 질량 처리 방법은 특정 응용 분야를 위해 Payne et al.16. MALDI-ToF MS 처리 방법 편집에 대한 정보와 조언은 MALDI-ToF MS 제조업체의 폴리머 기술 팀에 문의하십시오.
  3. MALDI-ToF MS 분석 소프트웨어를 사용하여 피크를 찾습니다.
  4. 이론적 고분자 질량과 실험적 폴리머 질량 비교
    1. 이론적인 폴리머 질량을 기록합니다. 양이온을 포함하여 예상되는 거대분자 구조를 화학 드로잉 소프트웨어에 그립니다. 화학 도면 소프트웨어에서 분석 창을 열고 이론적 질량을 기록합니다.
      1. 단분산 고분자: 구조와 양이온을 함께 선택하여 고분자의 정확한 질량과 분자량을 기록합니다.
      2. 저분산, 중간 및 고분산 폴리머: 반복 단위 질량의 경우 폴리머 백본만 선택하여 반복 단위 질량을 기록합니다. 지정된 n-mer의 총 질량의 경우 반복 단위 번호를 MALDI-ToF MS 분석 소프트웨어에 표시된 MALDI-ToF MS 스펙트럼 범위 내의 질량으로 설정합니다. 양이온 및 말단 그룹을 포함한 전체 폴리머 구조를 선택하여 지정된 n-mer의 질량을 기록합니다.
    2. 기록된 이론적 질량을 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 관찰된 질량과 비교합니다.
      1. 단분산 고분자의 총 질량 계산을 위해 아래 설명된 단계를 따르십시오.
        1. MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 강도가 가장 높은 피크를 확대하여 보기에 이론적 질량보다 최소 2배 아래와 위의 질량 범위가 포함되도록 합니다.
        2. 이론적 질량을 MALDI-ToF 질량 스펙트럼에서 관찰된 질량과 비교합니다. 차이가 0.100 Da 미만이면 예상되는 단분산 고분자 질량이 정확할 가능성이 높습니다.
        3. MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 예상치 못한 구조의 존재를 나타낼 수 있는 추가 피크를 검사합니다.
        4. 불일치가 감지되면 잠재적인 구조적 변화를 평가합니다. 반응 체계를 검토하고 비교를 위해 대체 구조의 질량을 계산합니다.
      2. 저, 중간 및 고분산 폴리머의 반복 단위 질량 계산을 위해 아래 설명된 단계를 따르십시오.
        1. MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 가장 높은 강도를 나타내는 반복 단위 질량으로 구분된 두 개의 피크를 선택하고 확대합니다.
        2. 인접한 피크의 각 쌍에 대해 낮은 질량 피크에서 더 높은 질량 피크의 관측 질량을 빼서 반복 단위 질량을 계산합니다. 다음 피크 세트에 대해 이 과정을 반복하여 반복 단위 질량의 일관성을 확인합니다.
        3. 계산된 반복 단위 질량을 이론적 반복 단위 질량과 비교합니다. 관측값과 이론값이 일치하고 일관된 질량 차이를 나타내면 폴리머 반복 단위 질량이 정확할 가능성이 높습니다.
      3. 저, 중간 및 고분산 폴리머의 지정된 n-mer의 총 질량에 대해서는 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
        1. 이론적 총 질량에 해당하는 MALDI-ToF 질량 스펙트럼의 피크와 위와 아래에 한 반복 단위의 피크를 확대합니다.
        2. 이론적 질량을 MALDI-ToF 질량 스펙트럼에서 관찰된 질량과 비교합니다. 차이가 0.100 Da 미만이면 예상 말단 그룹이 정확할 수 있습니다.
        3. MALDI-ToF 질량 스펙트럼에서 예상치 못한 구조를 암시할 수 있는 추가 피크를 검사합니다.
        4. 불일치가 확인되면 대체 말단 그룹 또는 구조적 변형을 평가합니다. 반응 체계를 검토하고 잠재적인 대체 말단 그룹 또는 순환 구조에 대한 질량을 계산합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

샘플 1: 단분산 트리스[G1](OH)6
주변에 3개의 벤질리덴 보호 비스(하이드록시메틸)프로피온산(Tris[G1]Bnz3)이 있는 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로판 코어로 구성된 단분산 덴드리머의 1세대를 1:1 메탄올:클로로포름에서 Pd/C 및 H2 가스와 반응시켜 벤질리덴기를 제거하고, 6개의 수산기를 갖는 덴드리머를 생성하여 트리스[G1](OH)6 을 형성했습니다(그림 2A).

Tris[G1](OH)6 는 CHCA를 매트릭스로 하여 양이온제로 NaTFA를 사용하여 분석되었습니다. CHCA는 극성 화합물에 매우 효과적이며 Tris[G1](OH)6 의 수산기와 상호 작용하여 표적 플레이트에 균질한 층을 제공하기 때문에 사용되었습니다. MALDI-ToF MS 시료 전처리는 NaTFA(THF에서 1mg/mL), 분석물(THF에서 5mg/mL) 및 CHCA(THF에서 5mg/mL)의 원액을 만드는 것으로 시작되었습니다. 이러한 용액을 만든 후 Na+ 양이온 용액 1μL, 분석물 용액 5μL, 매트릭스 용액 20μL를 미세 원심분리기 튜브에 결합하고 와류를 일으켰습니다(총 26mL에 대해 1:25:100 양이온:분석물:매트릭스의 비율). 다음으로, 이 혼합물 1μL를 미세 원심분리기 튜브에서 제거하고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에서 건조시켰습니다. 이 샘플은 반사경 모드에서 분석되었으며, 이론값과 관찰값을 비교하여 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 피크를 확인했습니다(그림 2B, 빨간색).

figure-results-1
그림 2: (A) Tris[G1](OH)6에 대한 샘플 1 변형에 대한 반응 방식. 벤질리덴기를 Pd/C 및H2 반응으로 제거하여 Tris[G1](OH)6을 형성하였다. MALDI-ToF MS를 사용하여 반응 완료를 결정했습니다. (B) 샘플 1의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼, Tris[G1](OH)6 및 매트릭스 및 염([CHCA + Na]+)을 포함하는 빈 매트릭스 스펙트럼이 겹쳐져 있습니다. 전체 MALDI-ToF MS 스펙트럼 및 Tris[G1](OH)6의 확대는 [Tris[G1](OH)6 + Na+]+에 대한 관측 질량 값이 505.239 Da이고 이론적 질량인 505.226 Da와 +0.013 Da의 차이가 있음을 보여줍니다. 빈 MALDI-ToF MS 매트릭스 스펙트럼(검은색)과 Tris[G1](OH)6 MALDI-ToF MS 스펙트럼(빨간색)을 비교하면 505.26 Da를 제외한 모든 피크를 무시할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Tris[G1](OH)6에 대한 Na+ 부가물이 관찰되었습니다. [Tris[G1](OH)6 + Na]+의 이론적 질량 값은 Tris[G1](OH)6의 단일 동위원소 피크의 질량(482.2362 Da)과 나트륨 양이온의 질량(22.9892 Da)으로 구성되어 총 질량은 505.226 Da입니다. [Tris[G1](OH)6 + Na]+의 관측 질량 값은 505.239 Da이며, 이는 +0.013 Da의 차이로 이론 값과 일치합니다.

세 가지 벤질리덴 그룹을 모두 완전히 제거하기 위해 MALDI-ToF MS 스펙트럼을 505-769 Da 사이에서 추가로 분석했습니다. 이 질량 범위를 사용하면 감지되지 않은 주변 그룹을 감지 할 수 있습니다. 피크 [Tris[G1]Bnz2(OH)2 + Na]+가 존재하는데, 이는 681.289 Da([Tris[G1]Bnz3 + Na]+ 769.3194 Da - 88.0313 Da)에서 하나의 벤질리덴이 제거되었음을 나타내며, 593.257 Da 피크([Tris[G1]Bnz3 + Na]+ 769.3194 Da -176.0626 Da)는 Tris[G1]Bnz3에서 두 개의 벤질리덴 그룹이 제거되었음을 나타냅니다(그림 3). 이 봉우리와 Tris[G1]Bnz3은 존재하지 않습니다. 따라서 반응이 완료되었고 Tris[G1](OH)6가 합성되었습니다.

figure-results-2
그림 3: Tris[G1]Bnz3, Tris[G1]Bnz2(OH)2, Tris[G1]Bnz1(OH)4의 중간체 및 샘플 1 Tris[G1](OH)6의 구조 및 이론적 질량. 검은색 점은 제품을 나타냅니다. 1개 및 2개의 벤질리덴 그룹의 구조 및 이론적 질량 제거 및 완전히 수산화된 Tris[G1](OH)6 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

900 미만의 저분자량 영역에서는 Tris[G1](OH)6 단분산 질량과 정렬되지 않는 여러 피크가 존재합니다. 대부분의 매트릭스에는 1000 미만의 경미한 노이즈 문제가 있으므로 Tris[G1](OH)6 이 순수한지 확인하기 위해 빈 MALDI-ToF MS 스펙트럼이 포함됩니다. 매트릭스 블랭크 샘플에는 매트릭스(CHCA) 및 양이온(Na+) 원액이 포함되었습니다. Tris[G1]OH6 (1:100 mg/mL)의 동일한 양이온: 매트릭스 농도 비율 양을 분석 샘플 혼합물에 사용했습니다. 다음으로, 혼합물 1μL를 샘플 플레이트에 첨가하고 분석을 위해 건조시켰습니다.

예비 데이터 수집, 교정 수집 및 데이터 수집을 완료하여 빈 MALDI-ToF MS 매트릭스 스펙트럼을 수집했습니다. 그림 2B (검은색)에서 MALDI-ToF MS 블랭크 매트릭스(검은색)와 샘플 Tris[G1](OH)6 스펙트럼(빨간색)을 플렉스 분석에 오버레이하여 어떤 피크가 제품과 연관되지 않는지 비교하고 확인했습니다. 빈 MALDI-ToF MS 매트릭스 스펙트럼 및 Tris[G1](OH)6 에서 식별된 모든 피크는 무시할 수 있으므로 유일한 피크는 샘플 2에 해당하는 505.226 Da입니다. 예를 들어, Tris[G1](OH)6 MALDI-ToF MS 스펙트럼의 445.016 Da 및 656.141 Da 피크(그림 2B 빨간색)는 445.017 Da 및 656.144 Da의 빈 MALDI-ToF MS 매트릭스 스펙트럼(그림 2B 검은색)에도 위치하며 각각 +0.001 Da 및 +0.003 Da의 차이가 있습니다. 이러한 피크는 빈 매트릭스 및 Tris[G1](OH)6 MALDI-ToF MS 스펙트럼과 일치하고 유사한 차이를 갖기 때문에 분석에 포함되지 않습니다. 따라서 Tris[G1](OH)6 의 질량은 MALDI-ToF MS를 통해 확인되지만 샘플의 순도를 확인하기 위해서는 SEC 및 NMR과 같은 다른 분석이 필요합니다.

샘플 2: 염화물 및 양성자 말단기를 갖는 폴리(2,2-디메틸프로파노에이트)
3-클로로-2,2-디메틸프로판산은 탄산칼륨을 염기로 사용하여 중합되었습니다(그림 4A). 한쪽 끝에 염화물이 있고 다른 쪽 끝에 양성자(Mn = 980 Da)가 있는 폴리(2,2-디메틸프로파노에이트)(PDMP) 샘플을 MALDI-ToF MS로 이온화하여 반응 중에 형성된 고분자 구조를 결정하고 서로 다른 말단기를 분석했습니다. MALDI-ToF MS 시료 전처리는 NaTFA(THF에서 2mg/mL), 분석물(THF에서 5-7mg/mL) 및 DCTB(THF에서 20mg/mL)의 원액을 만드는 것으로 시작되었습니다. 이러한 용액을 만든 후 Na+ 양이온 용액 5μL, 분석물 용액 5μL, 매트릭스 용액 10μL를 미세 원심분리기 튜브에 결합하고 와류를 일으켰습니다(총 20mL에 대해 10:25:200 양이온:분석물:매트릭스의 비율). 다음으로, 이 혼합물 1μL를 미세 원심분리기 튜브에서 제거하고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에서 건조시켰습니다. 매트릭스의 경우 DCTB는 다른 많은 폴리에스터와 함께 작동하기 때문에 선택되었지만 CHCA, HABA, GFR 및 DHB와 같은 다른 매트릭스가 시도되었습니다. CHCA, HABA 및 GFR은 샘플을 잘 이온화했지만 DHB는 성공하지 못한 것으로 판명되었습니다. NaTFA 이온은 에스테르 그룹의 산소와 더 잘 상호 작용하기 때문에 칼륨 트리플루오로아세테이트(KTFA), 세슘 트리플루오로아세테이트(CsTFA), 리튬 트리플루오로아세테이트(LiTFA) 및 은 트리플루오로아세테이트(AgTFA)에 비해 더 잘 작동했습니다.

MALDI-ToF MS 스펙트럼(그림 4B)은 샘플 3에 대한 염화물 말단 그룹을 갖는 PDMP의 분자량 분포가 600 Da에서 1600 Da 범위에 있음을 확인했습니다. 이는 샘플의 분산도가 낮아 MALDI-Tof MS 분석 소프트웨어를 사용하여 Mn, Mw 및 Đ 값이 각각 980 Da, 1070 Da 및 1.09가 되었음을 의미합니다. 단일 동위원소 피크는 반사론 모드에서 충분히 분해되어 정확한 질량 식별을 사용할 수 있었습니다.

figure-results-3
그림 4: 샘플 2의 반응 방식 및 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼. (A). 3-클로로-2,2-디메틸프로판산을 이용한 PDMP 합성을 위한 반응 방식. (B) 샘플의 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼 2. 이 전체 MALDI-ToF MS 스펙트럼은 Na+로 이온화된 염화물 말단 그룹(Mn = 980 Da)이 있는 PDMP 샘플의 전체 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

폴리머 반복 단위 질량을 확인하기 위해 인접한 두 피크 사이의 질량 차이를 계산했습니다. 폴리머의 반복 단위는 100.056 Da의 관찰된 평균 분자량을 가지며, 이는 600 Da에서 1300 Da 범위의 8개 피크(주 분포)의 평균 질량을 취하여 확인되었으며, 이는 PDMP의 이론적 반복 단위(100.052 Da)보다 +0.004 Da 낮고 또한 하나의 수소(앞쪽 끝)와 하나의 염화물(뒷면)에 해당하는 말단 그룹 질량을 갖습니다 끝).

MALDI-ToF MS 스펙트럼은 세 가지 뚜렷한 분포를 드러냈으며, 각 분포는 서로 다른 말단 그룹을 가진 결과 폴리머에 해당합니다. 이러한 말단 그룹은 이론적 질량을 계산하고 이를 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 관찰된 질량과 비교하여 식별 및 확인되었습니다. 말단 그룹을 추가로 식별하기 위해 분석을 위해 개별 n-mer를 선택했습니다(그림 5).

PDMP의 주요 분포는 폴리머가 하나의 수소(프런트 엔드)와 하나의 염화물(백엔드, 파란색)을 갖는 것을 보여주었습니다. PDMP의 8-mer의 이론적 질량 값(그림 5)은 반복 단위의 질량(100.0524 Da x 8)에 Cl 말단 그룹의 질량(+ 34.9689 Da) 및 수소 말단 그룹의 질량(+ 1.0078 Da)과 나트륨 양이온의 질량(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 859.385 Da의 총 8-mer 질량을 산출합니다. 8-mer [H-PDMP8-Cl + Na]+ 의 관측 질량 값은 859.426 Da로 이론 값과 +0.041 Da만 차이가 납니다.

다음 분포(주황색)는 폴리머가 프런트 엔드의 양성자를 백엔드의 나트륨과 염화물로 대체하는 것을 보여주었습니다. 탈의양성자화된 PDMP의 8-mer의 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(100.0524 Da x 8)과 Cl 말단 그룹의 질량(+ 34.9689 Da) 및 2개의 나트륨 그룹의 질량(+ (22.9892 Da x 2))으로 구성되어 총 8-mer 질량은 881.367 Da입니다. 8-mer [Na-PDMP8-Cl + Na]+ 의 관측 질량 값은 881.413 Da로 이론 값과 +0.046 Da만 차이가 납니다.

마지막으로, PDMP의 세 번째 분포(녹색)는 고리형 올리고머 종의 존재를 확인했습니다. 고리형 PDMP의 8-mer의 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(100.0524 Da × 8)과 하나의 나트륨 그룹의 질량(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 8-mer 질량은 823.409 Da입니다. 고리형 8-mer [PDMP8 + Na]+에 대해 관찰된 질량 값은 823.448 Da로 이론 값과 +0.039 Da만 차이가 납니다.

폴리머의 할로겐 존재는 MALDI-ToF MS로 식별할 수 있습니다. 선형 폴리머의 말단 그룹에는 하나의 Cl이 있으며, 이는 [M+] 및 [M+2]+ 피크의 약 3:1 비율로 표시됩니다. 관찰된 피크와 이론적 [M+] 및 [M+2]+ 피크 간의 차이는 표 1에 나와 있습니다. 761.3 Da [M+2]+ 에서 두 번째 피크에 대한 이론적 및 관찰된 백분율 풍부도는 각각 42.3% 및 42.2%(첫 번째 피크는 100%)이며, 이는 고분자 말단기에 하나의 Cl 그룹이 존재함을 확인합니다. 고리형 종은 선형 소듐 화합물 아래 36 Da, 디소듐 화합물 아래 58 Da인 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 이 고리 화합물은 단염화 종이 갖는 3:1 비율을 갖지 않았습니다. 이 염화물은 반대쪽 끝에 카르복실레이트가있는 SN 2공격을 통해 제거되어 고리가 닫힐 수 있습니다.

figure-results-4
그림 5: 샘플 2의 개별 반복에 대한 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼. 이 MALDI-ToF MS 스펙트럼은 Na+로 이온화된 수소 및 염화물 말단기(Mn = 980 Da)가 있는 PDMP로 주요 피크를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: MALDI-ToF MS에서 수소 및 염화물 말단기(Mn = 980 Da)가 있는 선형 PDMP의 [M+] 및 [M+2]+ 피크([M+] = 100%) 관찰된 피크 백분율 풍부도 및 피크 동위원소 강도 간의 비교. 선형 폴리머의 말단 그룹에는 [M+] 및 [M+2]+ 피크의 약 3:1 비율로 나타내는 하나의 Cl이 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

샘플 3: 4차 암모늄 및 양성자 말단기를 갖는 폴리(2,2-디메틸프로파노에이트).
3-브로모-2,2-디메틸프로판산은 트리에틸아민(TEA)을 염기로 사용하여 중합되었으나, TEA가 말단 그룹에서 Br을 대체하는 것으로 확인되었습니다(그림 6A). 한쪽에 4차 암모늄이 있고 다른 쪽 끝에 양성자(Mn = 1410 Da)가 있는 PDMP 샘플을 사용하여 동위원소 분포를 Cl 말단 그룹을 갖는 분포와 비교했습니다. MALDI-ToF MS 시료 전처리는 KTFA(THF에서 2mg/mL), 분석물(THF에서 5-7mg/mL) 및 DCTB(THF에서 20mg/mL)의 원액을 만드는 것으로 시작되었습니다. 이러한 용액이 만들어지면 K+ 양이온 용액 5μL, 분석물 용액 5μL, 매트릭스 용액 10μL를 미세 원심분리기 튜브에 결합하고 와류를 일으켰습니다(총 20mL에 대해 10:25:200 양이온:분석물:매트릭스의 비율). 다음으로, 이 혼합물 1μL를 미세 원심분리기 튜브에서 제거하고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에서 건조시켰습니다. 매트릭스의 경우 DCTB는 다른 많은 폴리에스터와 함께 작동하기 때문에 선택되었습니다. 칼륨 양이온을 첨가하여 샘플이 자체 이온화되는지 확인했습니다.

폴리머는 자체 이온화할 수 있는 말단기에 4차 질소(양전하)를 포함합니다. 이는 시료 전처리에 K+ 또는 Na+ 를 사용했는지 여부에 관계없이 질량 대 전하비(m/z)가 변하지 않았기 때문에 MALDI-ToF MS 스펙트럼에 의해 확인되었습니다. 또한, MALDI-ToF MS 스펙트럼은 Br이 좋은 이탈 그룹이기 때문에 말단 그룹에 양전하를 띤 4차 암모늄의 존재를 확인했습니다.

MALDI-ToF MS 스펙트럼은 4차 암모늄 말단기를 갖는 PDMP의 분자량 분포가 600 Da에서 2200 Da 범위 내에 있음을 확인했습니다(그림 6B). 이는 샘플의 분산도가 낮아 MALDI-Tof MS 분석 소프트웨어를 사용하여 Mn, Mw 및 Đ 값이 각각 1410 Da, 1540 Da 및 1.08이 되었음을 의미합니다.

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그림 6: 샘플 3의 반응 방식 및 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼. (A) 샘플 3에 대한 반응 방식. 트리에틸아민을 염기로 하는 3-브로모 2,2-디메틸프로판산을 사용한 PDMP 합성을 위한 반응 방식. (B) 이 전체 MALDI-ToF MS 스펙트럼은 4차 암모늄 말단 그룹(Mn = 1410 Da)을 갖는 선형 PDMP의 전체 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

폴리머가 동일한 반복 단위(단량체)를 갖는지 확인하기 위해 인접한 두 피크 간의 차이를 계산했습니다. 폴리머의 반복 단위는 100.0535 Da의 관찰된 평균 분자량을 갖습니다. 이는 900 Da에서 2300 Da 사이의 12개 피크(주요 분포)의 평균을 살펴봄으로써 확인되었으며, 이는 이론적 반복 단위(100.0524 Da)보다 +0.0011 Da 높았습니다.

MALDI-ToF MS 스펙트럼은 두 가지 다른 분포를 나타냈습니다. 분포 중 하나는 폴리머가 말단기(검은색)로 카르복실산과 양전하를 띤 4차 암모늄을 갖는 것을 보여주었고, 다른 분포(보라색)는 카르복실산에서 양성자 손실과 칼륨 이온의 첨가를 보여주었습니다. 말단 그룹을 추가로 식별하기 위해 분석을 위해 개별 n-mer를 선택했습니다(그림 7).

4차 암모늄 말단 그룹이 있는 PDMP의 12-mer의 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(100.0524 x 12)에 4차 암모늄 말단 그룹의 질량(+ 101.1199) 및 수소 말단 그룹의 질량(+ 1.0078)으로 구성되어 총 12-mer 질량은 1302.757 Da입니다. 12-mer [H-PDMP12-TEA]+ 의 관측 질량 값은 1302.730 Da로 이론 값보다 -0.027 Da 낮습니다.

한쪽에 4차 암모늄 말단 그룹이 있고 양성자를 다른 칼륨 이온으로 대체한 PDMP의 12-mer의 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(100.0524 × 12)과 4차 암모늄 말단 그룹의 질량(+ 101.1199) 및 칼륨 말단 그룹의 질량(+ 38.9637)으로 구성되어 총 12-mer 질량은 1340.713 Da입니다. 12-mer [K-PDMP12-TEA]+ 의 관측 질량 값은 1340.700 Da로 이론 값보다 -0.013 Da 낮습니다.

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그림 7: 샘플 3의 개별 반복에 대한 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼. 이 MALDI-ToF MS 스펙트럼은 4차 암모늄 말단기(Mn = 1410 Da)를 갖는 선형 PDMP의 1차 분포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

샘플 4: 선형 폴리(에틸렌 브라실레이트)
MALDI-ToF MS로 특성화된 다음 폴리머 샘플은 선형 폴리(에틸렌 브라실레이트)(l-PEB)입니다. 이것은 2개의 에스테르기를 포함하는 17원 고리를 갖는 대환 단량체 에틸렌 브라실레이트로부터 합성되었습니다(그림 8A). 고분자 구조 내의 작용기 및 구조 변화를 이해하기 위해 MALDI-ToF MS, 1H-NMR, SEC 및 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)의 네 가지 특성화 기술을 탐색했습니다. 1H-NMR, SEC 및 FTIR은 고리형 디에스테르의 제거와 α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB의 형성을 확인합니다. 그러나 이러한 기술은 어떤 유형의 부산물 형성도 감지하지 못했습니다. 한편, l-PEB의 MALDI-ToF MS 스펙트럼(그림 8B)은 각각 α-하이드록시-ω-하이드록시-PEB(1), α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB(2) 및 α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB(3)의 형성을 나타내는 세 가지 다른 질량 분포를 나타냅니다(그림 8B).

figure-results-7
그림 8: Na+가 있는 l-PEB의 MALDI-TOF 스펙트럼. (A) 선형 폴리(에틸렌 브라실레이트) 구조. (1) α-하이드록시-ω-하이드록시-PEB (2) α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB (3) α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB. (B) α-하이드록시-ω-하이드록시-PEB(1), α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB(2) 및 α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB(3)를 포함한 세 가지 분포가 확인되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

l-PEB 샘플은 DCTB를 비극성 폴리머의 매트릭스로 사용하여 MALDI-ToF MS에서 분석되었습니다. MALDI-ToF MS 시료 전처리는 NaTFA(THF에서 1mg/mL), 분석물(THF에서 5mg/mL) 및 DCTB(THF에서 20mg/mL)의 원액을 만드는 것으로 시작되었습니다. 이러한 용액을 만든 후 Na+ 양이온 용액 1μL, 분석물 용액 5μL, 매트릭스 용액 20μL를 미세 원심분리기 튜브에 결합하고 와류를 일으켰습니다(총 26mL에 대해 1:25:400 양이온:분석물:매트릭스의 비율). 다음으로, 이 혼합물 1μL를 미세 원심분리기 튜브에서 제거하고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에서 건조시켰습니다. 각 분포에 대해 관찰된 MW는 [M + Na]+ 이온의 정확한 분자량에서 0.03 Da의 편차 이내였습니다.

α-하이드록시-ω-하이드록시-PEB(1)의 6-mer에 대한 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(270.1831 Da x 6)에 2-하이드록시에톡시 말단기의 질량(+ 61.0290 Da)을 더한 수소 말단 그룹의 질량(+ 1.008 Da)과 나트륨 양이온(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 1706.124 Da를 산출합니다. α-하이드록시-ω-하이드록시-PEB(1)의 6-mer에 대해 관찰된 질량 값은 1706.133 Da로 이론 값보다 +0.009 Da 높았습니다.

α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB(2)의 5-mer에 대한 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(270.1831 Da x 5)에 에틸렌 브라실레이트의 질량에서 OCH2CH2O(+ 210.1620 Da)를 뺀 값과 2개의 프로파질 에테르 말단기의 질량(+ 55.0184 Da x 2)과 나트륨 양이온(+ 22.9892 Da)을 더하여 총 1694.103 Da를 산출합니다. α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB(2)의 5-mer에 대해 관찰된 질량 값은 1694.127 Da로 이론 값보다 +0.024 Da 높았습니다.

α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB(3)의 6-mer에 대한 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(270.1831 Da x 6)에 프로파길 에테르 말단기의 질량(+ 55.0184 Da)을 더한 값과 수소 말단 그룹의 질량(+ 1.008 Da)과 나트륨 양이온(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 1700.113 Da를 산출합니다. α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB(3)의 6-mer에 대한 관찰된 질량 값은 1700.139Da로 이론값보다 +0.026 높았습니다.

샘플 5: 아지화된 선형 폴리(에틸렌 브라실레이트)
또한, I-PEB(샘플 6)는 알코올 말단기의 에스테르화를 통해 6-아지도헥산산으로 기능화되었으며(그림 9), 아지드화된 l-PEB(샘플 7)를 생성했습니다. 얻은 생성물은 또한 모 폴리머(샘플 6)로 샘플 준비 기술을 사용하여 MALDI-ToF MS(그림 10)에서 분석되었습니다. 각 분포에 대해 관찰된 MW는 [M + Na]+ 이온의 정확한 분자량에서 0.04 Da의 편차 이내였습니다. 에스테르화 후, 두 개의 하이드록시 말단기(1)를 갖는 l-PEB의 [M + Na]+ 이온은 (1)에서 α-아지도-ω-아지도-PEB(4)로 전환되어 질량 이동을 나타냅니다. 또한, 하나의 하이드록시 말단 그룹과 하나의 프로파르길 말단 그룹(3)을 갖는 l-PEB를 α-프로파르길-ω-아지도-PEB로 전환했습니다(5). 그러나 (2)는 두 알킨 말단기로 인해 반응하지 않은 상태로 남아 있습니다.

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그림 9: 6-아지도헥산산 반응 방식을 통한 알코올 말단기와 선형 폴리(에틸렌 브라실레이트)의 에스테르화. α-하이드록시-ω-하이드록시-PEB(1)는 α-아지도-ω-아지도-PEB(4)로 변환되고 α-프로파르길-ω-하이드록시-PEB는 (3)를 α-프로파르길-ω-아지도-PEB(5)로 변환합니다. α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB(2)는 에스테르화 반응을 겪지 않는 알킨 말단기로 인해 반응되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

α-프로파르길-ω-아지도-PEB(5)의 6-mer에 대한 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(270.1831 Da × 6), 프로파질 에테르 말단기의 질량(+ 55.0184 Da)과 아지도헥산산염 말단기의 질량(+ 140.0824 Da), 나트륨 양이온(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 1839.188 Da를 산출합니다. α-프로파르길-ω-아지도-PEB(5)의 6-mer에 대한 관찰된 질량 값은 1839.184 Da로 이론 값보다 -0.004 Da 낮습니다. 또한, (5)에 대한 준안정 이온(5-N2) 피크의 존재는 분자에 아지드가 존재하는 경우에만 준안정 이온이 형성되기 때문에 아지드 기능화의 또 다른 지표입니다.

준안정 피크(5-N2 + Na+)의 6-mer에 대한 이론적 질량 값은 1815.126 Da이며, 이는 준안정 피크와 α-아지도-ω-하이드록시-PEG 피크의 질량 차이 플롯의 방정식을 사용하여 결정되었습니다(그림 11). 준안정 피크의 6-mer에 대해 관찰된 질량 값은 1815.089 Da로 이론 값보다 -0.031 Da 낮습니다. 플롯은 1000에서 2000 Da의 질량 범위 내에서 준안정 피크의 이론적 질량 값이 (5)보다 24 내지 24.1 Da 낮다는 것을 나타냅니다.

α-아지도-ω-아지도-PEB(4)의 6-mer에 대한 이론적 질량 값은 반복 단위의 질량(270.1831 Da × 6)에 6-아지도헥사노에이트 말단기의 질량(+ 140.0824 Da)을 더한 2-옥시에틸-6-아지도헥사노에이트 말단 그룹의 질량(+ 200.1035 Da)과 나트륨 양이온(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 1994.273 Da를 산출합니다. α-아지도-ω-아지도-PEB(4)의 6-mer에 대한 관측 질량 값은 1994.296 Da로 이론 값보다 +0.023 Da 높습니다.

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그림 10: Na+를 사용한 아지화된 l-PEB의 MALDI-ToF 스펙트럼. 여기에는 α-프로파르길-ω-프로파르길-PEB(2), α-아지도-ω-아지도-PEB(4) 및 α-프로파르길-ω-아지도-PEB(5)의 세 가지 분포가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 11: α-아지도-ω-하이드록시-PEG(평균 질량 1700Da)의 질량에 대한 α-아지도-ω-하이드록시-PEG와 준안정 화합물 간의 질량 차이에 대한 그래픽 그림. 이 그래프는 α-아지도-ω-하이드록시-PEG의 MALDI-ToF 스펙트럼에서 파생되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

샘플 6: 광범위하게 분산된 빗 폴리머
최종 반응 방식은 폴리(에틸렌 글리콜) 측쇄9를 갖는 티오에테르 반복 단위를 갖는 빗 중합체입니다. 400 Mn 메틸 에테르-PEG-프로파르길 및 1,6-헥산디디티올(CP MeO-PEG-400 HDT; 그림 12A) NaTFA를 사용하여 분석했습니다. 나트륨은 에테르와 티오에테르가 세슘과 같은 고알칼리 토금속보다 나트륨, 리튬 및 칼륨으로 더 쉽게 이온화되기 때문에 대응 이온으로 선택되었습니다. 이 샘플은 비극성 매트릭스인 DCTB로 실행되었지만 추가 매트릭스(CHCA 및 DT)도 테스트했지만 결과가 좋지 않았습니다. MALDI-ToF MS 시료 전처리는 NaTFA(THF에서 1mg/mL), 분석물(THF에서 5mg/mL) 및 DCTB(THF에서 20mg/mL)의 원액을 만드는 것으로 시작되었습니다. 이러한 용액이 만들어지면 양이온 용액 1mL, 분석물 용액 5mL 및 매트릭스 용액 20mL를 미세 원심분리기 튜브에 결합하고 소용돌이치게 했습니다(총 26mL에 대해 1:25:400 양이온:분석물:매트릭스의 비율). 다음으로, 이 혼합물 1mL를 미세 원심분리기 튜브에서 제거하고 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에서 건조시켰습니다. NaTFA가 카운터 이온으로 시료에 첨가되었기 때문에 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼은 알려진 시료의 예상 Na+ 부가물을 나타냈습니다. 또한 이 피크보다 대략 16 Da, 32 Da 및 48 Da의 증가도 관찰되었으며 이 백서의 뒷부분에서 논의될 것입니다.

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그림 12: 샘플 6에 대한 반응 방식 및 샘플 6의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼 (A) 여러 개의 HDT 스페이서와 400Mn PEG 측쇄가 있는 디티올-인 기반 빗 폴리머의 화학 구조 및 반응 조건. (B) 샘플 6, CP MeO-PEG-400 HDT의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼. 주요 반복 단위 = 550.30 Da, 부반복 단위 = 44.02 Da 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MALDI-ToF MS는 광범위한 분포를 확인했습니다(SEC에 의한 분산 = 2.88; 그림 12B) CP MeO-PEG-400 HDT의 단일 동위원소 피크(가장 풍부한 원소 동위원소, 즉 12C, 1H, 16O 및 32S만으로 구성됨)가 충분히 분해되어 정확한 질량 식별을 사용할 수 있었습니다. 모든 이론적 질량 계산은 각 원소에 대한 단일 동위원소 질량을 사용하여 결정되었습니다. 시료의 분산도가 넓기 때문에(SEC 기준 2.88) MALDI-ToF 질량 스펙트럼을 사용하여 Mn, Mw 또는 Đ를 계산할 수 없습니다. MALDI-ToF MS는 좁게 분산된 폴리머(Đ < 1.3)의 특성화에 탁월하지만 광범위하게 분산된 폴리머의 완전한 특성화에는 어려움을 겪을 수 있습니다. 분산도가 넓은 중합체를 설명할 때 분자량이 높은 종을 제외하고 질량 스펙트럼의 분자량 말단만 MALDI-ToF MS로 잘 분해되고 가시화됩니다. 이 현상을 저질량 편향이라고 합니다. 이러한 발생으로 인해 MALDI-ToF MS만으로는 빗 중합체의 완전한 특성화를 달성할 수 없습니다. 이러한 이유로 SEC는 정확한 Mn, Mw 및 Đ 값을 얻기 위해 MALDI-ToF MS와 함께 사용되었습니다.

빗 폴리머의 존재를 확인하기 위해 표준 선형 또는 고리형 폴리머에 대해 유사한 접근 방식이 취해졌습니다. 빗 폴리머의 각 반복 단위는 Mn = 400 PEG 측쇄의 좁은 분포를 포함하므로 빗 폴리머 반복 단위를 탐색하여 각각에 의도된 생성물의 존재를 결정했습니다. 또한, 반응 용액(300-700 Da)에 남아 있는 중합의 출발 물질도 특성화되었습니다.

전체 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 MeO-PEG-OH 의 6-15-mer에 대한 더 낮은 MW와 더 높은 MW를 볼 수 있습니다. 원래 MeO-PEG-프로파르길 출발 물질의 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서는 이러한 MeO-PEG-OH가 보이지 않았습니다(그림 13, 상단 스펙트럼). 이러한 피크의 출현은 MeO-PEG-OH에 대한 MeO-PEG-프로파르길의 상대적 농도 때문입니다. 빗 중합체 반응이 진행됨에 따라 MeO-PEG-프로파르길이 생성물에 통합됩니다. 이 때문에 MeO-PEG-OH에 비해 알킨 출발 물질의 비율이 감소하기 시작하여 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 기능화되지 않은 MeO-PEG-OH를 나타냅니다(그림 13, 하단 스펙트럼).

제품 질량 분포의 경우 정확한 질량 값이 모든 후속 계산에 사용되었습니다. 출발 물질 [MeO-(PEG10)-CH2CCH + Na]+ 의 한 반복 단위의 이론적 질량 값은 44.0262 Da입니다. 이 반복 단위 질량에 각 측쇄에 대해 10이 되는 반복 단위 수(44.0262 Da x 10)에 α-메톡시 말단 그룹의 질량(+ 31.0183 Da)과 ω-프로파길 말단 그룹의 질량(+ 39.0235 Da)에 나트륨 양이온의 질량(+ 22.9892 Da)을 더하면 총 10-mer 질량이 533.2932 Da가 됩니다. 10mer PEG + Na+ 의 관측 질량 값은 533.239 Da로 이론 값보다 -0.054 Da 낮습니다(그림 13). 전체 MALDI-ToF MS 스펙트럼에는 이 시리즈에 대해 아래의 6-9-mer와 위의 11-15-mer가 있습니다. 저분자량 스펙트럼에서 더 작은 오프셋 피크의 시퀀스는 11-mer의 이론적 질량 값이 반복 단위의 질량(44.0262 Da x 11)에 α-메톡시 말단기의 질량(+ 31.0184 Da) 및 ω-수소 말단기의 질량(+ 1.008 Da) 및 나트륨 양이온의 질량(+ 22.9892 Da)으로 구성되어 총 11-mer를 생성하는 비기능화된 MeO-PEG-OH 출발 물질에 해당합니다 질량 539.304. 11-mer + Na+ 의 관측 질량 값은 539.252 Da로 이론 값보다 -0.052 Da 낮습니다.

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그림 13: 출발 물질(상단) 및 샘플 8(하단)의 저분자량 종, CP MeO-PEG-400 HDT의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼(530-615Da에서 확대). MeO-PEG-OH(상단 스펙트럼 및 빨간색)와 비교한 알킨 출발 물질의 비율이 감소하기 시작하여 CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF 질량 스펙트럼(하단 스펙트럼)에서 기능화되지 않은 MeO-PEG-OH(하단 스펙트럼 및 파란색)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

고리형 빗 중합체의 경우, 중합 정도가 다양한 질량에 원하는 n-mer의 개별 부분을 곱할 수 있습니다. 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]+ 의 이론적 질량 값은 각 PEG 사슬의 반복 단위의 질량으로 구성되며, 그 중 사슬당 대략 8개(44.0262 Da x 16)에 각 PEG 사슬의 말단 메틸 말단 그룹의 질량(+ 15.0235 Da x 2)과 한때 프로파길 그룹이었고 현재 티올과 반응한 탄소의 질량(+ 41.0391 Da x 2)에 알킨과 반응한 HDT의 질량(+ 148.0380 Da x 2)과 나트륨 양이온의 질량(+ 22.9892 Da)을 더하여 총 2-mer 질량은 1167.599 Da입니다. 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]+ 의 관측 질량 값은 1167.626 Da로 이론 값보다 +0.027 Da 높습니다(그림 14). 저분자량 고리형 구조가 관찰되었지만, 양단에 티올 또는 양단에 이중결합이 있는 선형 화합물은 관찰할 수 없었다.

이러한 티오에테르 함유 폴리머는 또한 산화를 거쳐 티오에테르를 설폭사이드로 전환할 수 있습니다9. 이것은 산화 정도에 따라 여러 산소(+ 15.9949 Da x n)의 추가를 설명합니다. 이것은 Na+ 부가물에서 +15.9739 Da의 차이인 K+ 부가물과 다릅니다. 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]+의 단일 산화의 경우 이론적 질량 값은 1183.594 Da인 반면, 관찰된 질량 값은 1183.620 Da이며 이론적 값에서 +0.026 Da만 증가했습니다. 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]+의 이중 산화의 경우 이론적 질량 값은 1199.590 Da인 반면, 관찰된 질량 값은 1199.613 Da였으며 이론적 값보다 +0.023 Da만 증가했습니다. 마지막으로, 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]+의 삼중 산화에 대해 이론적 질량 값은 1215.585 Da인 반면, 관찰된 질량 값은 1215.617 Da였으며 이론적 값보다 +0.032 Da만 증가했습니다.

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그림 14: 샘플 8, CP MeO-PEG-400 HDT의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼. 1165-1254 Da에서 확대하면 서로 다른 양의 PEG 반복 단위가 부착되고 다양한 정도의 티오에테르 산화가 있는 고리형 2-mer 빗 폴리머 제품을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

산화는 대이온 연구를 수행하여 추가로 확인할 수 있습니다. 여기에는 K+와 같은 다른 이온화 양이온을 사용하고 MALDI-ToF MS 스펙트럼에서 피크의 이동을 비교하는 것이 수반됩니다. CP MeO-PEG-400 HDT의 샘플은 NaTFA가 아닌 KTFA를 사용하여 MALDI-ToF MS에서 실행되었습니다(그림 15). 이것은 Na+ 와 K+ 사이의 질량 차이로 인해 피크의 모든 질량을 +15.9739 Da 위로 이동합니다. K+ 부가물을 사용한 분석의 경우 MALDI-ToF MS 스펙트럼에 산화되지 않은 폴리머(1183.574 DaTheo)가 존재하지 않았습니다. 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + K]+ 의 단일 산화의 경우 이론적 질량 값은 1199.569 Da인 반면 관찰된 질량 값은 1199.567 Da(단 -0.002 Da)였고, 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + K]+ 의 이중 산화의 경우 이론적 질량 값은 1215.564 Da이고 관찰된 질량 값은 1215.572 Da로 차이가 있습니다(+0.008 Da에 불과). 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + K]+ 의 삼중 산화의 경우 이론적 질량 값은 1231.558 Da인 반면 관찰된 질량 값은 1231.563 Da(단 +0.005 Da)였으며 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + K]+ 의 새로 형성된 4중 산화의 경우 이론적 질량 값은 1247.553 Da이고 관찰된 질량 값은 1247.551 Da(단 -0.002 Da)였습니다. Na+ 및 K+ 부가물을 실행하는 사이에 폴리머가 더 산화되어 산화되지 않은 생성물이 손실되고 CP MeO-PEG-400 HDT의 4중 산화가 형성된다는 점에 유의해야 합니다. 또한 폴리머는 실제로 Na+ 및 K+ 부가물과 함께 비행하지만 신호 대 잡음비는 Na+ 부가물에 대해 훨씬 더 높기 때문에 1차 특성화에 Na+ 를 사용하는 옵션이 강조됩니다.

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그림 15: 샘플 8, CP MeO-PEG-400 HDT의 MALDI-ToF 질량 스펙트럼. 1195-1254 Da에서 확대하면 서로 다른 양의 PEG 반복 단위가 부착되고 다양한 수준의 티오에테르 산화가 있는 순환 2-mer 빗 폴리머 제품을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-ToF MS는 합성 폴리머의 특성화에 매우 효과적인 기술로, 부드러운 이온화 메커니즘으로 인해 최소한의 단편화로 정확한 측정을 제공합니다. 이 방법에서 매트릭스는 레이저로부터 에너지를 흡수하여 분석물(26)으로 전달합니다. 이 에너지는 폴리머를 기화시키고, 양이온화제와의 상호 작용을 통해 이온화하고, 진공으로 탈착시킵니다. 이온화된 분석물은 비행 튜브를 통해 이동하며, 그곳에서 질량 대 전하비(m/z)26,27를 기반으로 검출됩니다. 이 방법은 단분산 분자의 질량을 결정하는 데 적합하며 반복 단위 질량 및 말단기를 결정할 수 있는 적당히 분산(Đ = 1.1-1.3) 및 고분산 폴리머에 동등하게 효과적입니다. 적당히 분산된 폴리머의 경우 MALDI-ToF MS는 분산도(Ð), 수 평균 분자량(Mn) 및 중량 평균 분자량(Mw)도 제공합니다.

그러나 이 기술의 몇 가지 제한 사항에 유의해야 합니다. MALDI-ToF MS는 분산도가 높은 고분자(Đ > 1.3)를 분석할 때 저질량 편향을 나타내며, 이는 분포에서 질량이 낮은 중합체가 스펙트럼을 지배하는 반면 질량이 높은 종은 강도가 낮은 피크이거나 없음을 의미합니다28,29. 또한 10,000 Da를 초과하는 폴리머의 경우 분해능이 크게 감소하고 15,000 Da를 초과하는 폴리머는 선형 모드에서 더 잘 분석할 수 있습니다. 그러나 선형 모드는 반사경 모드에 비해 동위원소 피크 분해능을 희생합니다. 또한 MALDI-ToF MS는 폴리머가 효과적으로 이온화되는 능력에 의존합니다. 공액계 또는 헤테로원자를 갖는 폴리머는 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌과 같은 포화 탄화수소보다 더 쉽게 이온화되며, 이온화를 위해 화학적 변형이 필요한 경우가 많습니다 30,31.

샘플 준비는 성공적인 결과를 얻기 위한 중요한 단계입니다. 가장 중요한 측면 중 하나는 고분자 분석물에 적합한 매트릭스를 선택하는 것입니다11,32. 예를 들어, DCTB 및 GFR과 같은 매트릭스는 비극성 폴리머에 잘 작동하는 반면, DHB 및 CHCA는 극성 폴리머에 대해 비교하여 어떤 매트릭스가 가장 많이 분해된 피크를 제공하는지 식별할 수 있습니다. 또한 매트릭스와 분석물을 모두 용해하는 데 적합한 용매를 선택하면 적절한 공결정화가 보장되어 레이저 제거가 향상되고 생성된 MALDI-ToF MS 스펙트럼 33,34,35의 분해능이 향상됩니다. 마찬가지로, 적절한 양이온화제를 선택하는 것은 이온화 효율을 극대화하고 명확하고 구별 가능한 피크를 생성하는 데 필수적입니다.

매트릭스와 양이온화제를 선택하면 매트릭스:분석물:양이온 비율을 최적화할 수 있습니다. 먼저 선택한 양이온(THF에서 1mg/mL), 분석물(THF에서 5mg/mL) 및 매트릭스(THF에서 20mg/mL)의 원액을 준비합니다. 총 부피 26μL에서 약 1:25:400 mg/mL의 농도 비율에 해당하는 1:5:20 μL(양이온:분석물:매트릭스)의 시작 부피 비율이 권장됩니다. 이 초기 혼합물이 잘 분해된 스펙트럼을 생성하지 못하는 경우, 그리드 기반 접근 방식을 사용하여 체계적인 최적화를 수행할 수 있습니다(표 2)10,16. 이 설정에서 분석물 부피는 고정되는 반면 매트릭스 부피는 컬럼 전체에서 4씩 증분 곱해지고 양이온 부피는 행 위로 4를 곱합니다. 이 그리드를 사용하면 이온화 (ionization) 및 해상도에 대한 최적의 비율을 식별 할 수 있습니다. 외부 그리드 조건 중 하나가 향상된 성능을 제공하는 경우 해당 비율을 중심으로 새 그리드를 생성하여 추가 개선을 위해 4가지 조정의 배수를 계속할 수 있습니다. 좋은 출발점은 스펙트럼에 고강도 피크, 낮은 기준선 노이즈 및 잘 분해된 동위원소 분해능이 포함되어 있는지 여부를 평가하는 것입니다. 이 공정은 특히 3 x 3 준비 그리드에서 여러 매트릭스와 양이온을 테스트해야 할 수 있는 새롭거나 복잡한 폴리머의 경우 시간이 많이 소요될 수 있습니다.

표 2: 실험 비율의 체계적인 그리드를 생성하고 테스트할 수 있습니다. 각각 양이온, 분석물 및 매트릭스의 1:5:20 μL 비율을 사용하여 총 26mL에 대해 양이온:분석물:매트릭스를 시작합니다(1:25:400mg/mL). 분석물 부피는 5μL(25mg/mL)로 고정됩니다. 행렬 및 양이온 비율은 열과 행에 걸쳐 각각 4씩 증분 배합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

건조 액적 방법을 사용하여 MALDI-ToF MS 타겟 플레이트에 샘플을 적용한 후 MALDI-ToF MS 플레이트를 MALDI-ToF MS 기기에 로드합니다. 레이저 출력, 레이저 빔 직경, 검출기 이득, 펄스 이온 추출 등의 MALDI-ToF MS 데이터 획득 매개변수를 미세 조정하여 더 높은 해상도와 더 명확한 피크 분리를 달성할 수 있습니다. 이를 체계적으로 변경하여 피크 강도를 결정하고, 기준선 노이즈를 낮추고, 피크 분해능을 향상시킬 수 있습니다(그림 1).

기기 매개변수 및 시료 전처리 비율의 최적화는 엄격하게 선형적인 워크플로를 따르지 않습니다. 작업자는 선호하는 시료 전처리 방법으로 시작하여 선형 모드로 스크리닝하여 폴리머가 이온화되는지 여부를 평가하거나 3 x 3 전처리 그리드를 사용하여 시료 혼합 비율을 수정하기 전에 먼저 기기 방법(예: 레이저 출력, 펄스 추출)을 미세 조정할 수 있습니다. 워크플로의 유연성은 특히 새롭거나 알려지지 않았거나 특성이 잘 특성화되지 않은 물질을 분석할 때 필요한 경우가 많습니다.

최적화가 완료되면 시료 전처리 프로토콜을 재사용할 수 있지만 약간의 작업자 간 또는 일간 변동성이 여전히 발생할 수 있습니다. 각 수집 실행에 대해 보정을 수행하면 변동이 최소화되며, 일관된 프로토콜을 따를 때 피크 질량의 차이는 일반적으로 0.1 Da 미만으로 유지됩니다. 따라서 기기 분석법과 시료 전처리가 모두 동일하게 유지되면 사용자와 며칠에 걸쳐 재현성을 달성할 수 있습니다. 문제가 계속 지속되면 사용자가 경험할 수 있는 일반적인 문제점과 해결 방법이 있는 표가 표 3에 나와 있습니다.

표 3: 실제 경험을 바탕으로 한 일반적인 문제 및 문제 해결 전략. 이 표는 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석 중에 발생하는 문제를 지원합니다. 기기별 문제 해결은 MALDI-ToF MS 제조업체 설명서를 참조하거나 자격을 갖춘 기술자에게 문의하십시오. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

교정은 질량 측정의 정확성을 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 외부 및 내부 교정을 모두 사용할 수 있지만 사용되는 교정제가 고분자 분석물의 질량 범위 내에 있어야 합니다. 적절한 교정을 통해 분석물의 질량이 올바르게 측정됩니다.

데이터 분석은 MALDI-ToF MS 질량 스펙트럼이 열린 곳에서 수행되며 추가 분석을 위해 피크 피킹을 선택할 수 있습니다. 단분산 고분자의 질량과 특정 n-mer의 저분산, 중간 및 고분산 중합체의 질량은 관찰된 질량을 화학 드로잉 소프트웨어를 사용하여 계산된 이론 값과 비교하여 확인할 수 있습니다. 이러한 비교는 단분산 거대분자의 총 질량을 검증하는 데 도움이 되며, 특정 n-mer의 저분산, 중간 및 고분산 폴리머의 경우 말단 그룹이 식별되고 반복 단위 질량이 확인됩니다.

요약하면, 매트릭스, 양이온화 조건 및 실험 비율을 최적화하는 것은 고분해능 MALDI-ToF MS 데이터를 얻는 데 중요합니다. 교정은 정확한 질량 측정을 보장합니다. 피크 피킹 및 이론적 질량 비교를 사용한 데이터 분석을 통해 말단 그룹 및 반복 단위 질량 식별을 포함하여 폴리머의 철저한 특성화가 가능합니다. 이 기술은 단분산 고분자뿐만 아니라 저분산, 적당히 분산 및 고분산 합성 고분자에 사용할 수 있습니다. 미래의 방향에는 무용제 시료 전처리 방법 및 탠덤 질량 분석법(MS/MS)36,37,38을 통해 고분자 박막 혼합물, 고리형 중합체 및 초분지 중합체와 같은 복잡한 고분자 구조의 특성화를 확장하는 것이 포함됩니다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 시료를 분별한 다음 구조 분석을 위해 MALDI-ToF MS를 사용하는 것과 같은 기기 조합은 고분산 폴리머 샘플에서 저질량 구조를 식별하고, 분획 분산도를 결정하고, 말단 그룹을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다 39,40,41. 또한 Kendrick 질량 결함 플롯의 수동 입력 또는 소프트웨어 지원 생성을 포함한 새로운 데이터 분석 접근 방식을 통해 질량 스펙트럼을 2차원 맵으로 변환할 수 있어 샘플 내에서 여러 말단 그룹을 쉽게 식별할 수 있습니다 2,42.

공개 사항

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저자는 이 연구에 사용된 수지상 교정제에 금전적 이해관계를 가지고 있습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACS-석유 연구 기금 66398-ND7, Boyer 교수직 및 Tulane University의 지원에 감사드립니다. NSF MRI 2319960를 통해 새로운 MALDI-ToF MS를 추가로 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
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1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]dec-5-ene밀리포어 시그마345571https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE
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DHOxXYjle_kMT
1,6-헥산디디티올 98%(HDT) TCIH0334https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
2-(4-하이드록시페닐아조)벤조산)(HABA)밀리포어 시그마H5126https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
2,2-비스(하이드록시메틸)프로피온산밀리포어 시그마106615https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK
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2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논 99%(DMPA) 시그마-알드리치196118https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A
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2,5-디하이드록시벤조산(DHB)밀리포어 시그마149357https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(디메틸아미노)피리딘밀리포어 시그마522821https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage=
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& 유형=제품 
6-브로모헥산산밀리포어 시그마150452https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1
& 페이지=30& sort=relevance& 용어=
6-브로모헥산산%20acid& 유형=제품 
벤즈알데히드 디메틸 아세탈밀리포어 시그마226076https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid=
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벤조산밀리포어 시그마242381https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e
_j-KetQyyHJ6Qq86jSK8
ZVxC3BorQgkO8Xg5I 
브루커 울트라플렉스트림 브루커 달토닉스https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
클로로포름피셔 사이언티픽AA32614K7https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7
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클로로포름-acs-99-8-thermo-scientific
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=AA32614M6
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에틸렌 브라실레이트밀리포어 시그마W354309https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium=
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갈비녹실, 자유 라디칼밀리포어 시그마G307https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid=
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메탄올피셔 사이언티픽A456https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
팔라듐, 탄소 10%, 타입 487, 건조피셔 사이언티픽AAA1201206https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
폴리(에틸렌  글리콜) 모노메틸 에테르 350&NBSP; Mn  (MeO-PEG-OH 360) 피셔 사이언티픽AA4156022https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
칼륨 트리플루오로아세테이트(KTFA)밀리포어 시그마281883https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
프로파질 알코올피셔 사이언티픽A10295.0Fhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
프로파르길 브로마이드 97%(MgO로 안정화된 톨루엔 중 80% w/w)피셔 사이언티픽AAL1059514https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80%%20w/w%20in%20톨루엔%20안정화%20with%20MgO)
아지드화나트륨밀리포어 시그마S2002https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002 
수소화나트륨 60% 광유 분산 밀리포어 시그마452912https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid=
AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI
qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
트리플루오로아세테이트나트륨(NaTFA)오크 우드MFCD00013217https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt
검색=1549& ExtHyperLink=1
SpheriCal Neat 로우 레인지 키트(250 - 7,500 Da)폴리머 공장PFS-104https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
테트라히드로푸란(THF)피셔 사이언티픽T427https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
트랜스-2-[3-(4-tert-부틸페닐)-2-메틸-2-프로페닐리덴]말로노니트릴(DCTB)TCIB3635https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
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