방법 논문

장미벵골을 이용한 광역학 요법의 체외 응용을 위한 혁신적인 LED 기반 조명 장치 개발

DOI:

10.3791/68462

⸱

2025년 9월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 시험관 내에서 장미 벵골 매개 광역학 요법을 연구하기 위한 새롭고 혁신적인 3D 프린팅 조명 장치를 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 시험관 내에서 Rose Bengal(RB) 매개 PDT의 효능을 평가하기 위한 새로운 광역학 요법(PDT) 장치에 대해 설명합니다. CELL-LED-550/3이라고 불리는 이 장치는 두 개의 3D 프린팅 부품으로 구성되어 있으며, 하나는 단일 LED(광원 부분)에서 550nm 녹색 빛을 생성하고 다른 하나는 이 빛을 96웰 세포 배양 플레이트(광 분배기 부분)에 분배합니다. 광원 부분은 세 가지 모드의 드라이버에 의해 제어되며, 광 분배기 부분은 웰의 하단 외부 표면에 0.02mW/cm2, 0.23mW/cm2 또는 0.62mW/cm2의 세 가지 방사 조도 수준을 전달할 수 있습니다. 배광기 부분은 우물을 개별적으로 동시에 비추도록 설계되었습니다. CELL-LED-550/3 장치의 관련성을 입증하기 위해 HepG2 간세포 암종 세포에서 RB 매개 PDT에 의해 세포 사멸을 유도하는 능력을 평가했습니다. 먼저, HepG2 세포를 약 550nm에서 흡수 피크(가장 높은 피크)를 갖는 감광제인 Rose Bengal의 농도를 증가시켜 2시간 동안 처리했습니다. 그런 다음 처리된 세포를 0.3 J/cm2, 0.6 J/cm2 및 1.2 J/cm2 의 광선량에서 최대 조도 수준으로 설정된 CELL-LED-550/3 장치를 사용하여 조명했습니다(각각 조명 시간 8분 및 4초, 16분 및 8초, 32분 및 16초). 마지막으로, PDT 후 24시간에 Cell-Titer Glo를 사용하여 생존율을 측정했습니다. 실험 결과는 CELL-LED-550/3 장치를 사용한 RB 매개 PDT가 장미 벵골의 농도와 투여된 빛의 선량에 의존하는 방식으로 HepG2 세포의 생존력 감소를 유도할 수 있음을 보여줍니다. 이 기사에 제시된 개념 증명을 기반으로 CELL-LED-550/3 장치는 RB 매개 PDT 연구에 추가 도구를 추가합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2020년에 905,000명 이상의 신규 사례와 830,000명 이상의 사망자가 발생한 원발성 간암은 전 세계적으로 7번째로 흔한 암이자 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인입니다1. 원발성 간암 중 간세포암(HCC)이 가장 흔한 형태로 사례의 약 90%를 차지합니다2. 발견되지 않은 만성 간 질환과 열악한 감시 순응도로 인해 HCC 환자의 25%만이 질병의 초기 단계에서 진단됩니다3. 이러한 조기 진단 환자는 일반적으로 치료 목적으로 간 절제술, 간 이식 또는 국소 절제 요법으로 치료되며 70% 이상의 5년 생존율로 좋은 예후를 보여줍니다4,5. 나머지 75%의 환자(중간 또는 후기 진단 간세포암종 환자)의 경우, 표적 요법, 면역 요법 및 병용 요법을 포함한 혁신적인 치료 양식이 생존 이점을 가져오지만6, 예후는 여전히 매우 좋지 않습니다: 5년 생존율은 실제로 이 환자 그룹의 경우 30%를 초과하지 않고 전이성 환자의 하위 그룹의 경우 2%로 떨어집니다6. 따라서 대체 치료 옵션을 탐색하는 것은 중간 또는 진행성 간세포암종 환자의 치료 결과를 개선하고 생존을 연장하는 데 중요합니다. 피부과에서 널리 시행되는 항암 요법인 광역학 요법(PDT)7이 적합한 대안 후보가 될 수 있습니다.

PDT는 감광제(PS), 적절한 파장의 가시광선 및 분자 산소의 사용을 결합하여 세포독성 활성산소종(ROS)8을 생성하는 광화학 처리입니다. PDT의 항암 효과는 세 가지 ROS 유도 메커니즘9에서 파생됩니다 9: 첫째, 악성 세포에 대한 직접적인 세포 독성 효과10, 그 다음에는 종양 조직 저산소증, 영양 결핍 및 퇴행을 유도하는 종양 맥관 구조의 손상11, 마지막으로 손상되거나 죽어가는 종양 세포에서 위험 신호 및 종양 항원의 방출을 통한 염증 반응 유도12. 30년 이상 동안 PDT는 다양한 유형과 형태의 암을 치료할 수 있는 잠재력을 평가하기 위한 집중적인 조사의 대상이었습니다 13,14,15,16,17,18. 이러한 조사 19,20,21에서 입증된 효능을 바탕으로 PDT는 현재 비흑색종 피부암 치료를 위해 피부과에서 사용되고 있습니다 7. 다른 적응증의 경우 최근 몇 년 동안 임상 연구의 수가 증가하여 단독으로 또는 표준 치료법과 함께 사용되는 PDT를 임상 실습에 도입하기 위한 상당한 노력을 입증했습니다 22,23,24.

PDT에 사용되는 다양한 감광제가 존재합니다25. 그 중 로즈 벵골(RB)은 후두 종양 세포26, 흑색종 세포27, 유방암 세포28 및 전립선암 조직29에 대해 효율적인 광역학제로 작용하는 것으로 나타났습니다. 이 기사에 제시된 연구는 RB 매개 PDT가 HCC 세포에도 효율적인지 여부를 평가할 필요성을 기반으로 합니다.

이러한 평가에는 실제로 96웰 세포 배양 플레이트의 550nm 조명 전용 녹색 LED 기반 장치의 사전 개발이 필요했습니다. 이 장치(30)를 위해 두 부분으로 구성된 설계가 구현되었다: 광원 부분은 단일 LED로부터 550nm 녹색광을 생성하는 반면, 광 분배기 부분은 광섬유 번들을 사용하여 이 빛을 96개의 웰에 개별적으로 그리고 LED로부터 멀리 분산시킨다. 이 두 부분으로 구성된 설계는 첫째, LED 내에서 발생하는 제어되지 않은 열로 인해 발생할 수 있는 유해한 열 효과로부터 세포를 방지하고, 둘째, 전자 부품(LED 포함)이 있는 광원 부분을 외부에 유지하면서 세포 배양 인큐베이터 내부의 세포를 비출 수 있습니다. 이러한 혁신적인 기능은 소위 CELL-LED-550/3 장치에 멀티웰 플레이트 조명을 위해 특별히 설계된 이미 발표된 LED 기반 시스템에 비해 주요 이점을 제공합니다 31,32,33,34,35.

이 기사에서는 먼저 CELL-LED-550/3 장치에 대해 자세히 설명합니다. 그런 다음 개념 증명으로서 세포 생존력 연구는 2D HCC 세포 배양 모델(HepG2)30에서 CELL-LED-550/3을 사용하여 RB 매개 PDT의 효능을 입증합니다. 따라서 CELL-LED-550/3 장치는 저렴하고 휴대가 간편할 뿐만 아니라 RB 매개 PDT 실험에 특히 적합한 도구이기도 합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 장치 구성

알림: CELL-LED-550/3 장치의 두 부분은 별도로 제조되며 마지막 단계로만 함께 연결됩니다.

  1. 광원 부분의 구성
    1. 550nm 3W LED가 장착된 인쇄 회로 기판(PCB)의 뒷면에 적절한 크기의 팬 방열판 어셈블리를 부착합니다.
    2. 먼저 광선을 균질화하고 두 번째로 빔 각도를 120°에서 10°로 줄이기 위해 투명 PMMA(폴리메틸 메타크릴레이트) 시준 렌즈로 LED를 덮습니다. 이러한 감소를 통해 광 분배기 부품에 전달되는 빛의 양을 늘릴 수 있습니다.
    3. LED를 트라이 모드 디밍을 통해 전류 드라이버에 연결하면 다양한 조도 레벨을 전달할 수 있습니다.
    4. 3D 프린팅에서 하우징, 하우징 전면 및 하우징 클로저를 별도로 제작합니다( 그림 1의 빨간색 상자).
    5. 렌즈와 팬 방열판 어셈블리가 모두 장착된 드라이버와 LED를 하우징의 전용 위치( 그림 1의 파란색 상자)에 설치합니다.
    6. 전원 잭과 로커 스위치를 하우징 클로저의 전용 위치에 설치합니다( 그림 1의 파란색 상자).
    7. 로커 스위치를 통해 드라이버와 팬 방열판 어셈블리를 전원 잭에 연결합니다.
    8. 하우징, 하우징 클로저 및 하우징 전면을 조립합니다.
    9. LED가 하우징 전면의 원통형 개구부 축과 정렬되어 있는지 확인하십시오.
      알림: 하우징 전면의 원통형 개구부는 광원 부분(암 커넥터)과 배광기 부분(수 커넥터)의 광학적 연결을 위한 것입니다.

figure-protocol-1
그림 1: 광원 부분의 3차원 전면(A), 후면(B) 및 분해(C) 보기. Lefebvre, A. et al.30에서 각색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

  1. 광 분배기 부분의 구성
    1. 3D 프린팅에서 하우징 하단 클로저, 하우징 및 상단 클로저를 별도로 제작합니다(함께 속이 빈 상자를 형성함)( 그림 2의 빨간색 상자).
    2. 흰색 3D 프린팅( 그림 2의 빨간색 상자)으로 96웰 스페이서를 만들어 1.2.1에 언급된 속이 빈 상자에 정확히 맞도록 합니다. 흰색은 빛 반사를 최대화하여 배광을 최적화하는 것을 목표로 합니다.
      참고: 96웰 스페이서에 존재하는 원형 개구부의 직경 및 중심 간격은 생물학적 분석에 사용되는 96웰 플레이트의 웰의 직경 및 중심 간격과 같아야 합니다.
    3. 중공 상자의 상단 마개에 96개의 작은 구멍을 뚫어 96웰 스페이서의 96개 원형 개구부의 중심과 정렬되도록 합니다.
    4. 상단 클로저의 0.5개의 작은 구멍 각각에 0.5mm 직경의 플라스틱 광섬유를 아래에서 위로 삽입합니다.
    5. 상단 마개 하단에 폴리에스터 수지를 도포하여 96개의 광섬유를 상단 마개에 접착합니다.
    6. 레진이 마른 후 광섬유의 원위 말단이 상단 클로저의 상단에 적응할 때까지 연마합니다.
    7. 1.2.1단계에서 언급한 속이 빈 상자 내부의 광섬유를 상자 밖으로 약 2미터 확장되는 외피로 보호되는 단일 묶음으로 모으십시오.
      알림: 상자의 높이는 광섬유의 구부러짐과 발생할 수 있는 광 감쇠를 방지하기에 충분해야 합니다.
    8. 섬유 다발이 하우징의 전용 개구부를 통과하도록 속이 빈 상자를 조립합니다.
    9. 광섬유의 근위 말단을 3D 프린팅 수 커넥터에 함께 설정하여 광원 부분(암 커넥터)에 연결할 수 있습니다.
      알림: 이 커넥터는 이 접착제로 인해 발생할 수 있는 빛 감쇠를 방지하기 위해 접착제가 필요하지 않습니다.
    10. 96웰 스페이서를 속이 빈 상자에 놓습니다.
    11. 투명한 PMMA 플레이트(아래면)와 긁힘 방지 마일라 시트(윗면) 사이에 트레이싱 페이퍼를 삽입하여 각 광섬유 원위 말단에 전달되는 좁은 빔을 생물학적 분석에 사용되는 96웰 플레이트의 웰 직경만큼 큰 빔으로 확산시킵니다.
    12. 3D 프린팅( 그림 2의 빨간색 상자)으로 스크린 프레임을 구축하여 중앙 개구부가 생물학적 분석에 사용되는 96웰 플레이트의 크기와 정확히 맞도록 하여 웰이 96웰 스페이서의 원형 개구부와 완벽하게 정렬되도록 합니다.
    13. 스크린 프레임이 있는 96웰 스페이서의 상단에 스크린을 고정합니다.

figure-protocol-2
그림 2: 광 분배기 부분의 3차원 보기. Lefebvre, A. et al.30에서 각색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

  1. 광원 부분과 배광기 부분의 조립
    1. 배광기 부분의 수 커넥터를 광원 부분의 암 커넥터에 꽂습니다.
      알림: 수 커넥터가 암 커넥터에 연결되면 광원 부분에서 전달되는 광선은 배광기 부분의 수광 요소의 표면적보다 약간 더 많이 덮어야 하므로 96개의 광섬유에 빛이 공급됩니다.

2. 생물학적 분석

  1. 세포 배양 공정
    1. 10% 열 비활성화 소 혈청과 1% 스트렙토마이신 및 페니실린이 보충된 RPMI 1640 배지에서 간암 세포주 HepG2를 배양합니다.
    2. HepG2 세포가 들어 있는 배양 플라스크를 5% CO2 세포 배양 인큐베이터에서 37°C로 유지합니다.
    3. 플라스크에서 배양 배지를 흡인하고 이전에 37°C로 가열된 RPMI 1640 배양 배지로 교체하여 3일마다 배양 배지를 교체합니다.
    4. 현미경을 사용하여 배양 플라스크에 있는 세포가 80%-90% 합류에 도달할 때까지 세포의 합류를 확인합니다.
  2. 파종 과정
    1. 인큐베이터에서 세포를 꺼내 사전 세척된 미생물 안전 스테이션 아래에 놓습니다.
    2. 배양 플라스크에서 배양 배지를 제거합니다.
    3. 배양 플라스크를 인산염 완충액으로 세척합니다.
    4. 트립신 3mL(0.25%, 0.53mM)를 세포에 도포하고 배양 플라스크를 37°C의 인큐베이터에 5분 동안 넣어 세포를 분리합니다.
    5. 5분 후, 배양 배지 7mL로 배양 플라스크에서 트립신을 회수하고 배지 + 트립신 + 세포의 전체 용액을 15mL 튜브에 회수합니다.
    6. 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 이를 위해 세포가 포함된 용액 20μL를 튜브에 넣습니다. 20μL의 트리판 블루 용액을 첨가하고 세포 + 트리판 블루 용액을 계수 슬라이드에 놓고 세포 계수기에 삽입합니다.
    7. 세포가 계수되면 배양 배지에서 희석하여 150,000 세포/mL 용액을 얻고 1.5x104 세포/웰의 속도로 바닥이 투명하고 평평한 흰색 96웰 플레이트에 세포를 파종합니다. 흰색은 우물 내부의 빛 반사 및 분포를 최대화하는 것을 목표로 합니다.
      참고: 웰당 세포 수는 사용된 세포주에 따라 조정되어야 합니다. 시드할 적절한 수의 세포를 찾기 위해 사전 밀도 테스트가 필요할 수 있습니다.
    8. 각 생존율 판독 시간에 대해 두 개의 플레이트를 준비합니다. 한 접시는 조명이 켜지고 다른 접시는 어둡게 유지됩니다.
    9. 세포 부착을 허용하기 위해 처리 전 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
  3. 로즈 벵골 트리트먼트
    1. 10% 식염수에 로즈 벵골 분말을 재구성하여 로즈 벵골 원액을 준비합니다. 이 용액은 안정성으로 인해 로즈 벵골의 분해를 방지하기 위해 세포 처리 직전에 준비해야 합니다.
    2. 이전에 준비된 로즈 벵골 원액을 세포 배양 배지에서 희석하여 증가하는 농도(0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM)로 로즈 벵골 용액을 준비합니다.
    3. 용액이 준비되면 세포가 들어 있는 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 100μl의 로즈 벵골 처리 용액을 첨가합니다.
    4. Rose Bengal 내재화를 허용하기 위해 Rose Bengal 처리와 함께 세포를 2시간 동안 배양합니다.
      참고: Rose Bengal 용액의 배양 시간은 사용된 세포주에 따라 다를 수 있습니다. Rose Bengal 혼입의 동역학은 연구된 각 세포주에 대한 적절한 배양 시간을 찾기 위해 형광 측정에 의해 미세 조정되어야 할 수 있습니다.
    5. 2시간 후, 로즈 벵골 용액을 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 100μL/웰의 로즈 벵골 프리 배양 배지를 추가합니다.
      참고: 더 높은 농도의 로즈 벵골을 위해서는 PBS로 추가 세척이 필요할 수 있습니다. 세포가 올바르게 세척되었는지 확인하기 위해 육안 검사를 수행할 수 있습니다. 충분히 헹구면 PBS는 세포 외부에 존재하는 장미 벵골로 인해 분홍색을 띠지 않아야 합니다.
    6. 마이크로플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되지 않도록 보호합니다. PDT 분석을 위해 플레이트의 절반을 비춥니다(단계 2.4 참조). 조명이 켜지지 않은 플레이트는 PDT 결과(어두운 상태)에 대한 제어 데이터를 제공합니다. 그들은 또한 비광활성화 장미 벵골이 세포 생존력에 미치는 영향에 대한 데이터를 제공할 것입니다. 다른 마이크로플레이트는 장치의 빛에 노출되는 데 사용됩니다(PDT 조건).
  4. CELL-LED-550/3 장치의 작동 절차
    1. 배광기의 수 커넥터를 광원의 암 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 광원을 전기 콘센트에 꽂습니다.
    2. 인큐베이터에서 두 개의 마이크로플레이트(PDT + 다크 조건)를 제거하고 PDT 조건용 알루미늄을 제거한 다음 이 플레이트를 광 분배기에 놓습니다.
    3. 드라이버의 조광기를 최대 수준으로 설정하여 LED가 전달하는 전력을 최대화하고 96개의 웰에서 0.62mW/cm2 의 평균 조도를 얻습니다.
      알림: 드라이버의 조광기는 생물학적 분석에 가장 적합한 값(사용 가능한 세 가지 값 중)으로 설정해야 합니다. 드라이버의 조광기가 무엇으로 설정되든 낮은 전달 조도는 보안경을 사용할 필요가 없습니다.
    4. 세포에 원하는 빛의 선량에 도달할 때까지 플레이트를 비춥니다. 원하는 광량을 얻으려면 다음 방정식을 참조하여 시간 및 조도의 두 가지 매개변수를 조정할 수 있습니다.
      광선량(J/cm2) = 조도(W/cm2) × 시간(방정식 1).
      조도는 드라이버 조광기를 조정하여 각각 0.02mW/cm2, 0.23mW/cm2 또는 0.62mW/cm2를 얻도록 변조할 수 있습니다. 선택한 조도에서 방정식 1을 사용하여 목표 광량을 달성하는 데 필요한 조명 시간을 계산할 수 있습니다.
    5. 원하는 광량에 도달하면 장치를 끕니다. PDT 마이크로플레이트를 알루미늄으로 교체하고 생존력 테스트가 수행될 때까지 컨트롤 플레이트와 함께 인큐베이터로 되돌립니다.
    6. 선택 사항: 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 필요한 경우 다른 플레이트를 비춥니다.
  5. 세포 생존율 분석
    1. PDT 분석 후, 생존력을 측정하여 조명된 세포에 대한 PDT의 영향을 측정하기 전에 조명된 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 그대로 둡니다. 배양 시간은 세포에 대한 PDT의 다소 장기적인 영향을 연구하기 위해 다양할 수 있습니다. 각 PDT 후 배양 시간에 대해 조명이 켜지지 않은 플레이트(어두운 조건)를 동일한 기간 동안 배양해야 합니다.
    2. 배양 기간 후, 조명 플레이트 1개와 비조명 플레이트 1개를 가져와 각 웰에 세포 생존율 분석 키트에서 시약 100μL를 첨가하여 미토콘드리아 대사 및 세포에 의한 ATP 생산을 기반으로 세포 생존력을 측정합니다.
    3. 세포 생존율을 측정하기 전에 어두운 곳에서 10분 동안 멀티플레이트를 배양합니다.
    4. 10분 배양 후, 다중 모드 리더를 사용하여 각 웰에서 방출되는 발광을 판독합니다. 방출되는 발광은 세포 생존율 분석 용액을 첨가할 때 살아있는 세포에 의한 ATP 생성에 비례합니다.
    5. 미처리(NT) 조건의 발광 값을 100% 생존율로 간주하고, 처리된 조건의 발광 값을 NT 조건으로 정규화하여 각 처리에 의해 유도된 생존율의 백분율을 얻습니다.
    6. 각 PDT 치료 후 판독 시간(예: 치료 후 24시간, 48시간 및 72시간)에 대해 동일한 세포 생존율 판독 프로토콜을 반복합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 3에서 볼 수 있듯이 CELL-LED-550/3 장치는 550nm 녹색광으로 96웰 플레이트의 아래에서 균일한 조명을 가능하게 합니다.

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그림 3: 실내 조명이 켜짐(A) 또는 꺼짐(B)일 때 96웰 플레이트의 예시 조명 중 CELL-LED-550/3 장치의 사진. Lefebvre, A. et al.30에서 각색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

각 웰은 광섬유 묶음을 사용하여 단일 LED(최대 2미터)에서 멀리 떨어져 개별적으로 조명됩니다(그림 4).

figure-results-2
그림 4: 단일 LED에서 멀리 떨어진 96웰 플레이트의 웰을 개별적으로 조명할 수 있는 광섬유 번들. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

CELL-LED-550/3 장치의 효능을 확립하기 위해 HepG2 간암 세포주에서 RB 매개 PDT를 유도하는 능력을 평가했습니다. 세포는 조명 전 2시간 동안 0-100μM 범위의 증가된 농도의 로즈 벵골로 처리되었습니다. 녹색광에 노출되었을 때 HepG2 세포를 죽일 수 있는 장미 벵골의 유효 용량(EC50)을 결정하는 것을 목표로 하는 이러한 농도 범위의 사용. HEPG2 세포에서 세포 사멸 유도에 대한 CELL-LED-550/3 장치에 의해 전달되는 광선량의 영향도 연구되었습니다. 이를 위해, 세포를 0.62 mW/cm2 의 강도로 8분 9초, 16분 18초 또는 32분 36초 동안 빛에 노출시켜 각각 0.30 J/cm2, 0.60 J/cm2 및 1.22 J/cm2의 광선을 얻었다.

첫째, 로즈 벵골(빛 조건, 그림 5)이 없는 상태에서 조명만으로는 받은 빛의 선량에 관계없이 HepG2 세포의 생존력에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었습니다. 또한 빛이 없는 상태에서 벵골 장미 단독(RB 조건, 그림 5)은 테스트된 조건 중 어느 것에서도 세포 생존력의 변화를 유도하지 않는 것으로 관찰되었습니다. 대조적으로, 결과는 CELL-LED-550/3을 사용하는 RB 매개 PDT가 HepG2 세포를 죽일 수 있음을 보여줍니다. 또한, 최대 유효 농도(EC50)는 0.30 J/cm2의 광선량에서 34.3 μM, 0.60 J/cm2의 경우 26.6 μM, 1.2 J/cm2의 선량에서 6.8 μM로 증가된 광선량과 상관관계가 있는 것으로 증가된 효능이 관찰되었습니다.

이러한 결과는 RB 매개 PDT에 대한 이 새로운 PDT 장치의 효과를 확인했습니다(그림 5).

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그림 5: HepG2 세포주의 생존력과 관련된 장치의 효능. HepG2 처리 후 24시간 생존율. NT, 미처리; RB, 감광제만(0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM 및 100 μM); 0.30 J/cm2, 0.60 J/cm2 및 1.22 J/cm2에 대한 조명, 조명; PDT, RB 처리를 통한 조명. 결과는 NT± 백분율로 표시되는 세 가지 독립적인 실험의 평균 SEM으로 표시됩니다. 양방향 ANOVA 테스트를 수행했으며 p ≤ 0.01(**); p ≤ 0.0001(****)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되고 p ≥ 0.05는 유의하지 않은 것으로 간주됩니다(NS). Lefebvre, A. et al.30에서 각색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 시험관 내에서 RB 매개 PDT 전용 혁신적인 조명 장치를 개발하기 위한 프로토콜과 CELL-LED-550/3 장치에 대한 개념 증명을 구현하기 위한 프로토콜에 대해설명합니다.

CELL-LED-550/3은 두 부분으로 구성되며, 각각 특정 기능이 있습니다. 광원 부분이라고 하는 첫 번째 부분의 목적은 단일 LED에서 두 번째 부분의 광섬유 번들보다 직경이 더 큰 균일한 녹색 광선을 생성하는 것입니다. 광 분배기 부분이라고 하는 이 후자는 광섬유 번들을 통해 광원 부분에서 공급되는 빛을 LED에서 멀리 떨어진 96웰 플레이트의 웰에 개별적으로 분배하는 것을 목표로 합니다. LED에서 최대 2.5m 떨어진 거리에서 LED 내에서 발생하는 제어되지 않은 열로 인해 발생할 수 있는 유해한 열 효과의 위험 없이 필요한 만큼 셀을 비출 수 있습니다.

이 기능은 96웰 플레이트 조명용으로 특별히 설계된 다른 LED 기반 시스템에 비해 CELL-LED-550/3의 첫 번째 중요한 이점을 제공합니다(31,32,33,34,35,36). 실제로 다른 모든 시스템에는 LED를 셀 아래 불과 몇 센티미터(보통 5cm 미만)에 배치하는 것이 포함되며, 이는 셀에 대한 LED 관련 유해한 열 효과의 위험을 제거하기에는 충분하지 않습니다. 이러한 위험을 제한하기 위해 이러한 다른 시스템의 대부분(불행히도 일부는 그렇지 않음)은 때때로 셀에 매우 (너무) 가깝게 배치된 LED 냉각 시스템 32,34,35를 포함하며, 이는 결과적인 열 변동에 의해 비생산적인 영향을 받을 수 있습니다. 두 부분으로 구성된 CELL-LED-550/3 장치의 설계는 대부분의 다른 기존 LED 기반 시스템(31,32,33,35,36)에 비해 또 다른 중요한 이점을 제공합니다. 전자 부품이 포함되지 않은 분광기 부분은 실제로 인큐베이터 내부에 배치할 수 있으며, 습한 환경에 민감한 전자 부품을 포함하는 광원 부분은 부식이나 고장의 위험을 방지하기 위해 외부에 보관됩니다. 전자 부품을 포함한 일부 기존 LED 기반 시스템은 인큐베이터 내부에서 조명을 가능하게 하지만, 이러한 사용은 첫째, 설계자/제조업체에 의해 권장되지 않으며, 둘째, 사용 후 "적절한" 건조가 필요합니다33,34. 인큐베이터 내부의 세포를 조명하여 프로토콜 동안 동일한 생리학적 조건(온도, 습도 및 CO2 농도)에서 세포를 유지하는 능력은 특히 긴 조명 시간이 필요한 프로토콜의 경우 PDT 후 세포 생존율 평가에서 잠재적인 편향을 피하는 데 중요합니다. 또한 CELL-LED-550/3 장치에는 96개의 웰을 개별적으로 동시에 조명하는 단일 LED가 포함되어 있다는 점을 강조해야 합니다. 이 독창적이고 혁신적인 기능은 상술한 다른 LED 기반 시스템(31,32,33,34,35,36)에서는 사용할 수 없다. 이들 시스템의 대부분은 96개의 LED를 포함하며, 각 웰 아래에 하나의 LED가 배치되어 있으며, 따라서 96개의 개별 빔(31,33,34,36)을 전달하는 반면, 나머지 시스템은 웰 플레이트로부터 몇 센티미터 떨어진 곳에 위치한 6 내지 25개의 LED를 웰(31,32,35)의 전체 또는 일부를 덮는 글로벌 빔을 전달한다 . 문헌에 따르면 CELL-LED-96/550이 광섬유 번들을 사용하여 수행하는 것처럼 단일 LED에서 3개의 개별 빔을 생성하는 것은 이전에 제안된 적이 없습니다.

광원 부분에는 두 가지 주요 기준에 따라 선택된 550nm 3W LED가 포함됩니다. 첫째, LED의 방출 스펙트럼(따라서 중심 파장)은 RB 감광제의 흡수 스펙트럼과 겹쳐야 합니다. 선택한 LED(중심 파장: 554.4nm; FWHM: 106.4nm; 둘 다 Lefebvre et al.30에 설명된 방법론에 따라 추정됨(그림 6)은 RB 광활성화에 필수적이며 따라서 RB 매개 PDT의 유도에 필수적입니다. 둘째, LED의 광출력은 5W 미만이어야 합니다. 이 전력 제한은 광원 부분에 포함된 시준 렌즈의 허용 전력과 분광기 부분에 포함된 광섬유 다발의 허용 전력에 의해 부과됩니다.

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그림 6: 물에서 로즈 벵골의 흡수 스펙트럼. 물 속 로즈 벵골의 최대 정규화된 흡수 스펙트럼은 왼쪽 축에 따라 플롯되고 CELL-LED-550/3의 평균 스펙트럼 복사 조도는 오른쪽 축에 따라 스케일링됩니다. 평균 스펙트럼 방사 조도의 프로파일은 제조업체 웹 사이트에서 사용할 수 있는 LED의 프로파일과 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

장치의 두 부분 사이의 광적 결합은 중요한 요소입니다. 이 결합은 한편으로는 3W LED에서 방출되는 빛의 최대값을 좁은 빔으로 수집하고 다른 한편으로는 이 빔을 광섬유 번들에 주입하는 것을 목표로 합니다. 첫 번째 목표와 관련하여 PCB(인쇄 회로 기판) 장착 LED용으로 특별히 설계된 초점 거리가 짧은 비구면 시준 렌즈를 사용하면 120도 LED 빔을 공간적으로 균일한 분포의 10도 좁은 빔으로 집중할 수 있습니다. 또한 결과 빔은 정사각형 LED 칩의 이미지를 투사하여 초기 빔으로 얻은 이미지에 비해 선명도가 향상되고 광학 수차가 감소합니다. 이 좁은 빔을 광섬유 번들에 주입하는 것과 관련하여 네 가지 중요한 사항을 해결해야 합니다. 먼저, 직경 96개의 0.5mm PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 광섬유(개구수: 0.2)의 근위 말단을 수제 커넥터로 모아 측면 5mm의 정사각형 빛 수용 표면을 형성합니다(그림 7). 광 손실을 제한하기 위해 빔에 의한 LED 칩의 정사각형 돌출부와 일치하는 정사각형 모양이 커넥터의 일반적인 원형 모양보다 선호되었습니다. 둘째, 수제 커넥터는 접착제가 필요하지 않도록 설계되었으며 빛 흡수를 제한하여 재료 과열/탄화를 방지하기 위해 수정처럼 투명한 수지를 사용하여 3D 프린팅되었습니다. 셋째, 커넥터의 빛 수용 표면과 최종 표면은 연마 휠을 사용하여 연마되어 최대 빛이 통과하도록 했습니다. 넷째이자 마지막으로, 렌즈와 정사각형 빛 수용 표면 사이의 거리를 이론적으로 결정한 다음 광학 벤치에서 조정하여 정사각형 LED 프로젝션의 가장 균일한 중앙 부분이 빛 수용 표면보다 약간 더 겹치도록 했습니다.

이러한 결합을 통해 10도 좁은 빔에 대해 1.25W의 전력을 얻는 반면, 96개의 광섬유 묶음에 의해 전송되는 총 전력은 0.12W입니다(LED 조명에 적합한 포토다이오드 센서(OPHIR) 사용).

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그림 7: 96개의 광섬유를 수제 커넥터로 모아 얻은 정사각형 빛 수용 표면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

CELL-LED-550/3은 웰의 하단 외부 표면에서 0.62mW/cm2 (표준 편차: 0.09mW/cm2)의 평균 조도를 제공합니다(그림 8). 위에서 언급한 결합 효율을 고려한 이 평균값은 Lefebvre 및 al.30에 자세히 설명된 방법론에 따라 시간이 지남에 따라 안정적임이 입증되었습니다(변동 계수는 0.6% 미만). 이러한 낮은 조도(위에서 논의한 96웰 플레이트 조명을 위해 특별히 설계된 다른 LED 기반 시스템에서 제공하는 것보다 낮음)로 인해 조명만으로는 HepG2 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 입증된 반면 RB 매개 PDT의 경우 매우 높은 효율에 도달했습니다. 효율성을 보장하기 위해 더 높은 조도가 필요한 PDT 프로토콜의 경우 여러 개의 LED를 사용할 수 있으므로 각 광섬유에 주입되는 광력이 수십 밀리와트의 허용 전력을 초과하지 않는 한 여러 광원 부품을 구현할 수 있습니다.

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그림 8: 플레이트의 96개 웰에 전달된 조도의 분포를 나타내는 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

광원 부분의 LED만 다른 적합한 것으로 대체하면 다른 CELL-LED 소자를 얻을 수 있습니다. LED는 가시 범위(광섬유 번들의 사양에 따름)에서 5W 미만의 광 전력(위에서 언급한 이유로)을 방출하는 경우 적합한 것으로 간주됩니다. 이러한 LED가 상당수 존재하기 때문에 다양한 CELL-LED 장치를 개발할 수 있으며, 이를 통해 많은 PDT 프로토콜을 시험관 내에서 평가할 수 있습니다. PDT 프로토콜이 주어지면 고려된 감광제의 흡수 스펙트럼과 최상의 중첩을 제공하는 LED가 모든 적합한 LED 중에서 분명히 선호되어야 합니다. LED를 교체하는 경우 팬 방열판 어셈블리에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 실제로 이 어셈블리는 LED와 드라이버 모두의 과열 및 그에 따른 성능 저하를 방지하기 위해 적절한 크기여야 합니다. 또한 LED 변경을 위해서는 새로운 광학 및 열 특성화가 필요합니다.

단일 LED를 간단히 대체하여 대부분의 감광제를 광활성화할 수 있는 가능성과 인큐베이터 내부의 세포를 비출 수 있는 가능성은 기존 장치에 비해 이 장치에 실질적인 부가가치를 제공합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 우리 연구를 지원해 준 프랑스 릴 중앙 병원과 INSERM에 감사를 표하고 싶습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
550  NM 3  인쇄 회로 기판에 장착된 W LED 오스람오스타 KP CSLPM1. F1
75 cm2 배양 세포 플라스크사르슈테트3911002
플라스틱 광섬유 100개(직경 0.5mm) 묶음아르센시엘 LED섬유05EGM글로우 엔드 PMMA 0,5 직경 - Lng  200 미터        http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
셀 카운터써모피셔AMQAF2000선택사항, 미세스코프에서 계산할 수 있습니다.
세포 배양 인큐베이터PHCI(더처)MCO-170AICUVD-PE
세포 역가 Glo프로메가지7571
투명 PMMA 시준 렌즈Glecc 스토어14mm 렌즈 10°Aliexpress - 14mm를 지원하는 DEL 시준 렌즈
Colorfab Ngen 블랙컬러팹  SKU 020014FDA 식품 접촉 규정 준수
Colorfab Ngen 화이트컬러팹  SKU 020013FDA 식품 접촉 규정 준수
트라이 모드 디밍이 있는 전류 드라이버(CDM 드라이버)CDM 드라이버BD39 시리즈2200 mA
에폭시 수지 클&이큐트; 오파트레크리스탈 다이아몬드크리스탈 다이아몬드 150mL
팬 방열판 어셈블리보 이드
HepG2 세포ATCCHB-8065 시리즈
멀티모달 리더(CLARIOstar Plus)BMG 랩텍430-2927
인산염 완충액써모피셔20012-068
PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 광섬유(개구수: 0.2)광저우 Mayki 조명 제한
전원 잭RS프로907-5680
RMPI 1640써모피셔21875-091
로커 스위치 RS프로419-744
로즈 벵갈레써모피셔 / 머크A17053.14 / 330000-1G
긁힘 방지 마일라 시트RS프로전화: 785-0802
칼집AUPROTECT&오슬래시; 8,5mm / &오슬래시; 외장 11mmPP 폴리프로필è ne UV 증거 검정색 골판지 칼집은 쪼개지지 않습니다.
SVF유로바이오CVF SVF00-01
투사지캔송79368730
투명 PMMA 플레이트RS프로전화: 284-6269
트리판 블루써모피셔15250061
트립신써모피셔25200-072
얼티메이커 2+얼티메이커
흰색 투명 바닥 96웰 플레이트두처655098

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