Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

요약

현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

초록

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 특히 만성 상처 감염 및 만성 폐 감염(특히 낭포성 섬유증(CF) 환자)에서 발생하는 주요 인간 병원체입니다. 만성 세균 감염은 항생제 치료에 불응성이며, 효율적인 치료법을 개발하기 위해 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 만성 감염 모델이 시급히 필요합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 상처 감염을 일으키기 위해 구성적으로 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 CF 환자로부터 P. aeruginosa 임상 분리체에 의한 감염 프로토콜에 대해 설명합니다. 꼬리 지느러미에 손상을 입은 배아는 1.5시간 동안 박테리아 현탁액에 담그고 세척한 후 3일 동안 박테리아 부하를 모니터링합니다. 박테리아 부담은 용해된 감염된 유충의 형광 집락 형성 단위(CFU)를 계수하여 매일 정량화되었으며, 이로 인해 지속적인 감염이 가능했습니다. 더욱이, 잔류성 녹농균(P. aeruginosa) 박테리아는 항생제 치료에 불응성이었다. 지속성 녹농균 감염에 대한 이 새로운 생체 내 모델은 만성 감염에 대한 혁신적인 치료법의 효능을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다.

서론

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 낭포성 섬유증(CF) 및 상처 환자의 만성 집락화를 담당하는 그람 음성 병원성 박테리아입니다 ^1,2. 녹농균(P. aeruginosa)은 ESKAPEE 병원균 그룹에 속하며, 세계보건기구(WHO)에 의해 새로운 치료제의 중요한 우선순위로 인정받고 있다³. 만성 세균 감염은 적응 약물 내성으로 인해 항생제로 치료하기 어려운데, 이는 생물막 생활 방식, 성장 감소, 낮은 대사 활동⁴, 세포 내 수명 주기⁵ 등 여러 요인과 관련이 있습니다. 생체 내 모델은 녹농균 만성 감염을 더 잘 이해하고 치료하는 데 필수적입니다.

녹농균(P. aeruginosa) 독성을 평가하기 위해 여러 가지 in vivo 모델이 사용되었지만, 지속적인 집락화를 모방하고 만성 감염에 대한 치료 효과를 테스트할 수 있는 모델은 거의 없었다⁶. 녹농균(P. aeruginosa)의 만성 발병기전을 연구하기 위한 동물 모델은 주로 한천 구슬에 박힌 박테리아를 폐로 투여하는 데 의존한다⁷. 쥐의 만성 피부 감염 모델도 개발되었다⁸. 제브라피시(Danio rerio)는 많은 장점(중간 정도의 윤리적 문제, 낮은 비용, 높은 난자 생산량)을 가지고 있으며, 약물 테스트를 위한 매력적인 생체 내 척추동물 모델이며, 배아 투명성 덕분에 녹농균 및 숙주 세포의 고해상도 실시간 시각화가 가능합니다⁹.

본 연구에서 보고된 바와 같이, 이전 연구에서는 녹농 균 실험실 균주(PAO1, PA14, PAK)가 주로 제브라피시 감염 모델에 사용되어 급성 감염을 일으켰다⁹. 우리는 최근 급성 감염을 일으킨 P. aeruginosa PAO1 균주에 꼬리지느러미 절단 배아를 담근 것에 기초한 상처 감염 프로토콜을 개발했다¹⁰. 녹농균(P. aeruginosa)의 자연적 감염 방식을 반영하는 손상된 배아의 침지에 의한 감염은 재현 가능하고 미세주입보다 쉬운 감염 방식입니다.

우리의 목표는 제브라피시의 지속적인 녹농균 감염에 대한 프로토콜을 확립하는 것이었습니다. 이를 위해 우리의 전략은 제브라피시 모델^11,12에서 거의 고려되지 않은 녹농균 임상 균주를 상처 감염 경로와 결합하는 것이었습니다. 여기에서는 P. aeruginosa CF 임상 분리물에 의한 상처 감염을 기반으로 제브라피시 배아의 지속적인 집락화를 모델링하기 위해 개발한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 새로운 in vivo 모델은 우리의 기대에 부응하고 본 논문 및 동반 논문¹³에 설명된 바와 같이 지속적인 집락화의 맥락에서 치료제의 효능을 평가할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다.

프로토콜

본 연구에서 기술된 모든 제브라피시 실험은 몽펠리에 대학교에서 실험 동물 취급에 대한 유럽연합 가이드라인에 따른 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙에 따라 수행되었으며, 참조 CEEA-LR-B4-172-37에 따라 Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault 및 Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques의 승인을 받았습니다. 모든 감염 실험은 수정 후 최대 5일까지 배아에 대해 수행되었습니다. AB 또는 Golden Lines 물고기에서 성인 제브라피쉬(Danio rerio)를 사육하는 것은 EU 동물 보호 지침 2010/63/EU에 명시된 국제 지침을 준수했습니다. 표준 조건이 12시간 12시간 조명: 다크 사이클, 3.5L 폴리카보네이트 탱크(탱크당 최대 22마리)로 설정된 몽펠리에 대학의 제브라피시 시설은 4% 염도/400μS 전도도 및 28°C의 수온을 가진 재순환 시스템에 연결됩니다. 물고기는 하루에 2번 생선 먹이를 먹었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 제브라피쉬 배아를 성장시키기 위해 메틸렌 블루가 있거나 없는 어수에 대한 1x 작업 용액을 준비합니다( 표 1 참조).
2. 표 1에 설명된 대로 20배의 스톡(0.4%) 및 1배의 작동하는 트리카인 마취액을 준비합니다. 원액의 반복적인 동결 및 해동을 방지하려면 20x Tricaine 분취액 10mL를 준비하고 -20°C에서 보관하십시오.
3. 1x 인산염 완충 식염수(PBS; 표 1).

2.GFP를 구성적으로 발현하는 형광녹농균의 접종물의 제조  

참고: 녹농균 에 대한 모든 작업은 생물 안전 캐비닛에서 BSL-2 예방 조치에 따라 수행됩니다. 녹농균(P. aeruginosa) 균주는 GFP(여기에 사용되고¹³에 기술된 바와 같이)와 같은 형광 리포터를 구성적으로 발현하도록 유전적으로 변형되어야 합니다. 염색체로 인코딩된 형광 리포터와 함께 균주를 사용하는 것은 플라스미드로 인코딩된 형광 리포터의 경우 플라스미드의 손실을 방지하기 위해 강력히 권장됩니다.

1. 감염 2일 전, -80°C에서 LB 한천 플레이트에 GFP를 발현하는 유전자 변형 녹농균(P . aeruginosa )을 줄무늬로 제거하고 (표 1) 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 형광 현미경(배율 6x)을 사용하여 집락의 형광을 확인하여 GFP⁺P. aeruginosa 집락에 LB 배지 1mL를 접종하고(표 1) 37°C에서 밤새 진탕(180rpm)하여 성장합니다.
3. 감염 당일, 위의 녹농 균 배양을 1:20에 신선한 LB 육수 5mL에 희석합니다. 배양액이 OD₆₀₀ = 0.8에 도달할 때까지 37°C에서 흔들림(180rpm)으로 박테리아를 성장시킵니다. 약 2-3시간이 소요됩니다.
4. 박테리아 배양을 실온(RT)에서 3584 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 메틸렌 블루가 없는 생선 물 4mL에 펠릿을 재현탁합니다.
5. 어류를 사용한 배양의 양을 7 x 10⁷ 에서 1 x 10⁸ CFU/mL로 조정합니다. 이는 약 0.15의 OD₆₀₀ 에 해당합니다(각 변형률에 맞게 조정됨).
6. 접종물을 정량화하려면 박테리아 현탁액을 연속 희석하고 LB 한천 플레이트에 ^10-4 희석액 중 20μL를 플레이트화한 다음 37°C에서 밤새 배양합니다.
7. 형광 현미경으로 GFP⁺ 콜로니를 계수하여 접종물의 CFU를 측정합니다.

3. 제브라피시 배아의 수집 및 준비

1. 박테리아 침수 실험 3일 전에 제브라피시 번식 쌍을 설정합니다. 번식하는 수컷과 암컷을 교배 탱크에 넣습니다.
2. 다음날 아침, 수정 후 미세한 여과기를 사용하여 난자를 수집합니다. 수집된 계란을 메틸렌 블루가 든 생선 물이 담긴 페트리 접시에 넣습니다.
3. 오염을 방지하려면 페트리 접시에 표백제 1방울을 넣으십시오. 5분 후 생선 물을 메틸렌 블루로 변경하여 표백제를 제거합니다.
4. 비정상적인 배아 발달(수정되지 않은 난자는 1세포 난자와 유사함) 또는 죽은 난자(흰색 모양)가 있는 난자는 폐기합니다.
5. 감염 당일 아침(2dpf에서)에 실체 현미경(배율 11배)으로 두 개의 매우 얇은 집게로 배아를 분리합니다. 배아를 풀어주기 위해 배아를 꼬집지 않고 집게를 사용하여 융모막을 찢습니다.
6. 디코리온화된 배아를 메틸렌 블루가 든 생선이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 감염될 때까지 28°C에서 접시를 배양하십시오.

4. 배아 손상

1. 세포 배양 접시(35mm x 10mm)에서 손상 약 5분 전에 0.02% 트리카인을 함유한 메틸렌 블루가 없는 어류에서 제브라피시 배아를 마취합니다. 배아는 더 이상 움직이지 않고 자극에 반응하지 않습니다.
2. 바늘을 쉽게 다룰 수 있도록 두 개의 젓가락 위에 25G 바늘을 놓습니다.
3. 실체 현미경으로 비정상적으로 발달하거나 죽은 배아를 제거합니다. 접시의 원형 이동을 사용하여 중앙에 있는 모든 배아를 모읍니다.
4. 두 개의 바늘을 수직 위치(머리 아래로-꼬리 위로)로 사용하여 배아를 하나씩 분리하고 왼쪽 바늘을 꼬리에 올려 똑바로 유지합니다. 올바른 바늘로 노토코드 가장자리의 지느러미를 자릅니다. 한 번에 컷을 만드십시오. 절단과 박테리아 용액에 담그는 사이에 10분을 초과하지 마십시오.

5. 상처 입은 배아의 감염

1. 생물 안전 작업대 유형 II 아래에서 약 1 x 10⁷ CFU/mL의 녹농균 용액을 6웰 플레이트에 와류로 첨가합니다.
2. 일회용 파스퇴르 유리 피펫으로 손상된 배아를 수집하고 미생물 안전 포스트 아래의 박테리아 용액에 추가합니다. 플레이트를 28°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.
   참고: 감염된 유충이 많이 필요한 경우 약 50마리의 유충으로 그룹을 만들어 상처를 만들고 담근 다음 다음 그룹에 대해 반복합니다.
3. 감염 후에는 아래 설명된 대로 미생물 안전 포스트 아래에서 배아를 세척합니다.
   1. 유리 피펫으로 배아를 옮겨 메틸렌 블루가 없는 생선 물 10mL에 넣고 가능한 한 적은 액체를 첨가하여 실온에서 30분 동안 세척합니다.
   2. 유리 피펫을 사용하여 감염된 배아를 다시 옮기고 몇 분 동안 메틸렌 블루가 없는 4mL의 생선 물에 두 번째 세척합니다.
   3. 24개의 감염된 배아를 메틸렌 블루가 없는 어수 1mL가 들어 있는 멀티웰 플레이트에 개별적으로 이식합니다.
4. 플레이트를 플라스틱 상자에 넣어 28°C의 인큐베이터에 넣습니다. 상자를 가습하십시오(예: 젖은 종이 타월로ample) 증발을 제한하기 위해.

6. 감염된 배아의 생존

1. 배아 생존 연구의 경우 감염 후 18시간, 24시간 및 48시간(hpi)에서 실체 현미경으로 생존력을 확인합니다. 배아는 심장과 혈액 순환이 멈출 때 죽은 것으로 간주됩니다.
2. Kaplan-Meier 계단 그래픽 표현(GraphPad Prism 8.3.0)을 사용하여 사망률/생존율을 나타내고 로그 순위 또는 기타 적절한 통계 테스트를 통해 데이터를 분석합니다.

7. 감염된 배아의 세균 부담 계수(그림 1)

1. 감염된 배아로부터 4개의 다른 시점, 즉 1.5 hpi, 즉 감염 직후와 5개의 배아/시점으로 24, 48 및 72 hpi의 각 세척 후에 CFU 측정을 수행합니다. 미생물 안전성 포스트에 있는 모든 단계를 수행합니다.
2. 감염된 각 유충에 대해 95μL의 1x PBS를 함유한 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 유충의 부피는 약 5μL입니다.
3. 유충을 메틸렌 블루가 없는 4mL의 물고기 물이 담긴 6웰 플레이트로 옮겨 세척을 수행하고 플랑크톤 박테리아를 제거합니다.
4. PBS가 들어 있는 미세 원심분리 튜브에 각 배아를 넣고 가능한 한 적은 액체를 추가합니다. PBS 표면에 유충이 들어 있는 유리 피펫을 만지기만 하면 액체를 추가하지 않고 유충이 마이크로 원심분리기 튜브에 가라앉을 수 있습니다.
5. 마이크로 원심분리기 튜브 측면에 있는 절굿공이를 사용하여 배아를 개별적으로 부수십시오. 유봉을 튜브 안에 보관하십시오. 온전한 배아가 남아 있지 않을 때 종말을 결정합니다.
6. 유봉을 올리고 100μL의 PBS-Triton 2%를 첨가하여 유봉에 남아 있는 박테리아를 헹굽니다(최종 농도는 1%). 소용돌이를 일으키고 10분 동안 기다립니다. 동시에 5개 이상의 배아를 처리하지 마십시오.
7. 각 배아에 대해 10μL의 비희석 용해물을 LB 한천 플레이트에 3x, 10 μL로 떨어뜨립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 ^10-3 희석에 도달할 때까지 96웰 플레이트에서 용해물을 연속 희석합니다. LB 한천 플레이트의 희석되지 않은 것 옆에 3x, 10μL의 희석 ^10-1, ^10-2 및 ^10-3 을 떨어뜨리고 37°C에서 플레이트를 밤새 배양합니다.
8. 현미경으로 각 희석액의 형광 집락을 세고 감염된 배아당 CFU를 계산합니다.

그림 1: 제브라피시 배아에서 박테리아 독성 및 지속성을 평가하기 위한 실험 타임라인. 약어: CFU = Colony forming units, hpi = infected after-hours. 도면은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다. 이 수치는¹³에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 지속적인 감염에 대한 치료 테스트(그림 2)

1. 녹농균 균주에 대한 최소 억제 농도(MIC)의 40배에서 항생제 용액을 준비합니다. 실험하기 전에 선택한 항생제 농도가 배아에 독성이 없는지 확인하십시오.
2. 7.1 및 7.2단계를 수행합니다. 1웰 플레이트에 항생제가 든 생선 물 24mL를 놓고 항생제 없이 대조를 합니다.
3. 처리당 세척 단계에서 5개의 배아를 24웰 플레이트로 옮기고 가능한 한 적은 액체를 추가합니다.
4. 항생제를 투여하여 실온에서 30분 동안 배양합니다. 7.3단계로 돌아갑니다. 처리 후 박테리아 부하를 정량화합니다.

그림 2: 감염된 배아에 대한 항생제 치료의 효능을 평가하기 위해 사용된 실험 절차. 약어: ATB 30' = 30분 동안 항생제 치료, CFU = 집락 형성 단위, hpi = 감염 후 시간. 도면은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다. 이 수치는¹³에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

제브라피시 배아는 녹농균 분리체의 지속적인 감염을 모니터링하기에 적합한 모델입니다 .
우리는 손상된 배아의 침지 모드를 사용하여 3개의 CF 분리물(A6520, B6513 및 C6490)의 독성을 생체 내에서 평가했습니다⁹. 우리는 또한 생쥐기도에서 장기간 집락화하는 것으로 알려진 잘 특성화된 후기 CF 분리물인 RP73의 행동을 평가했습니다^14,15. 4개의 CF 분리물은 모두 기준 균주 PAO1과 비교할 때 크게 감쇠되었습니다(그림 3A 및 그림 3B).

박테리아 제거와 지속성을 구별하기 위해 3...

토론

생체 내에서 세균성 만성 감염을 모델링하는 것은 발병 기전을 이해하고 치료 효능을 평가하는 데 필수적입니다. 여기서, 우리는 녹농균에 대한 약물 테스트에 적합한 제브라피쉬의 지속적인 상처 감염 모델을 확립했습니다. 이는 만성 박테리아 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족하다는 현재 방법론의 격차를 메웁니다. 특히, 이 모델은 만성의 주요 특징, 즉 적응 항생제 내성을 모방하여 최적화된 화합물/항생제를 검색할 수 있습니다. 제브라피쉬의 지속적인 녹농균 감염에 대한 이 모델은 독창적인 방법론을 기반으로 합니다: (i) 생쥐¹⁴에서 만성 폐렴을 확립하는 것으로 보고된 분리물을 포함하여 CF 환자로부터 녹농균 분리체의 분석, (ii) 박테리아 부하 계산을 포함한 감염 후 장기간(3일)에 걸친 분석, (iii) 상처 감염 방식.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에틸-3-아미노벤조에이트 메탄술폰산염	시그마	E50521
피스톤 펠릿	에펜도르프, 두처	33522
바다 소금	인스턴트 오션, 수족관 시스템	218035
트리톤	유로메덱스	2000-B