단일 핵 현탁액을 위한 마우스 후각 상피의 신속한 해부 및 해리

요약

이 기사는 단일 핵 RNA 시퀀싱을 목적으로 쥐 후각 상피의 해부 및 해리를 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다.

초록

쥐 후각 상피는 후각 감각 뉴런, 재생 전구 세포 및 지지 세포를 포함하는 다양한 세포 유형을 수용하는 후각 시스템의 초기 진입점입니다. 후각 감각 뉴런은 화학적 냄새 물질을 신경 신호로 전달하지만, 이러한 세포가 발달하고 회전하는 방식, 후각 전구와 시냅스를 생성하고 냄새 수용체를 조절하는 메커니즘은 여전히 집중적으로 연구되는 영역으로 남아 있습니다. 비강의 등쪽에 위치한 후각 상피는 비갑개로 알려진 복잡한 뼈 구조에 달라붙습니다. 이 해부학은 특히 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 준비하는 맥락에서 추출 및 해리에 고유한 과제를 제기합니다. 단일 세포 현탁 프로토콜에는 세포 생존율에 스트레스를 주거나 라이브러리 준비를 지연시킬 수 있는 준비 단계(예: 파파인 해리, FACS)가 포함되는 경우가 많기 때문에 조직 추출 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 이 기사에서는 후각 상피의 신속한 해부를 위한 간소화된 방법과 고품질 단일 핵 현탁액을 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

서론

쥐 후각 상피(OE)는 후각계의 필수 구성 요소이며 냄새 신호를 감지하고 중추신경계로 전달하는 역할을 합니다. 가장 표면층에는 후각 감각 뉴런의 냄새 감지 섬모가 포함되어 있으며, 이는 점액층으로 덮여 있고 지지 지위 및 미세 빌라 세포로 둘러싸여 있습니다 ^1,2. OSN은 양극성으로, 섬모를 정점으로 확장하여 점액층 내에서 격자를 형성하고 축삭을 뼈 판을 통해 기저로 후각 구근 내에서 사구체로 합쳐집니다. 이 사구체는 OSN과 다운스트림 뉴런 사이의 시냅스 부위입니다. 기본 OSN인 구형 기저 세포라고 하는 신경 전구 세포는 공기 중 독소, 병원체 및 신체적 외상과 같은 환경 모욕에 직접 노출된 후 죽을 때^OSN을 지속적으로 보충합니다.3. 구형 기저 세포는 비갑개라고 하는 뼈 돌출부의 기저판에 가장 기저에 위치하고 부착되는 다능성 수평 기저 세포^의 예비 풀에서 파생됩니다 ^4,5. 비갑개는 구불구불하여 OE를 분리하고 균질화하기 어렵게 만듭니다. 더욱이 OE는 두개골의 뼈로 둘러싸여 있어 해당 부위에 접근하기 어렵고 전통적으로 시간 집약적인 절차가 필요합니다.

이전 연구에서는 뼈 ^6,7,8,9,10에서 후각 상피를 방출하기 위해 확장된 파파인 배양에 의존했으며, 이는 단일 세포 현탁액의 다운스트림 처리를 더욱 지연시킬 수 있습니다. OSN 축삭의 전단은 세포사멸을 유발하기 때문에¹¹ 조직 추출에서 cDNA 라이브러리 준비까지의 시간을 최소화하는 것이 필수적입니다. 또한, OE의 구조와 후각 전구에 대한 투영은 성공적인 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 온전한 세포의 추출을 복잡하게 만듭니다. 다행스럽게도 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)은 특히 단일 세포 해리가 어렵거나 비실용적인 조직에서 세포 유형 분포를 보존하면서 세포를 프로파일링하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다^12,13.

많은 연구 6,7,8,10,14,15에서 마우스 OE의 단일 세포 시퀀싱을 수행했지만, OE의 취약성과 두개골의 다양한 뼈에 의한 감싸기를 고려할 때 필요한 일관되고 편리한 조직 수집에 최적화된 상세한 해부 절차를 제공하는 연구는 없습니다. 또한, 기존의 해부 가이드⁽¹⁶)는 속도보다는 해부학적 구조를 보존하는 데 초점을 맞추고 있으며, 이는 잠재적으로 긴 해부 시간을 초래한다. RNA 분해를 최소화하고 준비된 핵의 품질을 최대화하기 위해서는 편리한 조직 준비가 필수적이기 때문에^17,18, 다양한 다운스트림 응용 분야에서 사용하기 위해 쥐 OE를 단일 핵 현탁액으로 신속하게 해부 및 균질화하기 위한 최적화된 프로토콜이 보증됩니다.

이 프로토콜(그림 1)은 이러한 문제를 극복하도록 설계된 간소화된 방법을 제시하여 핵을 분리할 목적으로 쥐 OE의 신속한 해부와 조직의 효율적인 해리를 가능하게 합니다. 이 접근법은 고품질 단일 핵 시퀀싱을 용이하게 하여 후각 생물학의 분자 토대를 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 기술을 제공합니다.¹⁹.

그림 1: C57BL/6 마우스 두개골의 관련 봉합사 및 뼈의 해부학적 구조 및 후각 상피의 대표적인 단면. (A) 두개골의 봉합사는 색상으로 구분됩니다. 봉합사는 두개골의 한쪽에 색상으로 구분되어 있고 다른 쪽은 참조용으로 표시되지 않은 상태로 남아 있습니다(왼쪽). 봉합사의 이름은 그에 따라 색상으로 구분됩니다(오른쪽). (B) 두개골의 뼈는 색상으로 구분됩니다. 뼈는 두개골의 한쪽에 색상으로 구분되어 있고 다른 쪽은 참조용으로 표시되지 않습니다(왼쪽). 그에 따라 색상으로 구분된 뼈의 이름(오른쪽). (C) OE의 중앙 부분의 단면(이 기사에 설명된 방법을 사용하여 해부됨)과 한쪽에 색상으로 구분된 비갑개와 참조를 위해 표시되지 않은 왼쪽(왼쪽). 시각화된 비갑개의 이름(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 연구의 모든 동물 실험은 Baylor College of Medicine IACUC의 승인을 받고 이에 따라 수행되었습니다. 암컷 C57BL/6J(JAX:000664) 마우스를 사용하였다. 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 후각 상피 박리

1. 선호하는 방법(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)을 사용하여 마우스를 깊게 마취하는 것으로 시작합니다. 발가락을 단단히 꼬집어 마취의 수술면을 확인하고 최소 10mL의 얼음처럼 차가운 1x PBS의 경심 관류를 진행합니다. 두개골을 노출시키기 위해 피부를 제거합니다(그림 2A).
   알림: 본체에서 머리를 제거하는 것은 선택 사항입니다. 머리를 제거하기로 결정한 경우 참수하기 전에 두개골 주변의 피부와 기타 연조직을 제거하는 것이 좋습니다.
2. 가늘고 끝이 날카로운 가위를 사용하여 하나의 가위 끝을 후방 안와에 배치하고 다른 하나는 이도에 인접하여 편평 뼈에서 광대뼈를 양측으로 부러뜨리는 두 개의 절개를 합니다( 그림 2B의 녹색 선).
3. 전두골의 가장 앞쪽을 따라 안와에서 안와로 얕은 절개를 합니다. 전두골의 등쪽 표면(~1-2mm 깊이)만 절개하고 안와를 구성하는 기본 구조나 뼈를 절단하지 않도록 주의합니다( 그림 2B의 파란색 선).
   알림: 안와 사이에 얕은 절개를 하려면 가위를 두개골에 수직으로 잡고 날카로운 끝만 사용하여 자릅니다.
4. 1.3단계에서 전두골에 이루어진 안와간 절개에 도달할 때까지 대공에서 시상 및 전두엽 봉합사를 통해 두개골의 정중선을 따라 절단합니다( 그림 2B의 빨간색 선).
5. 두개골의 정중선을 따라 절개된 부위에 한 쌍의 집게를 삽입하고 두개골 천장의 한쪽 반구를 측면으로 단단히 당깁니다. 이 동작은 또한 안와의 뼈(전두엽, 상악 및 눈물)를 제거하여 후각 비갑개의 측면을 노출시킵니다(그림 2D).
   알림: 이 시점부터 실수로 OE가 손상되지 않도록 주의하십시오.
6. 코뼈와 앞니를 잡고 겸자를 사용하여 반대쪽 두개골 천장을 분리합니다. 뇌(후각 구근 포함)가 찢어질 때 뼈의 반구와 함께 제거되도록 합니다(그림 1E). 이 단계 후에 남아 있어야 하는 유일한 눈에 보이는 뼈 구조는 두개골의 기저부와 OE를 둘러싼 뼈입니다(그림 2F).
7. 한 쌍의 뼈 니퍼 또는 롱저를 사용하여 앞니 기저부까지 남아 있는 전두골과 전상악(예치) 뼈를 제거합니다(그림 2G).
8. 뼈 니퍼를 사용하여 전두비강 봉합사를 따라 절단하여 편골판에서 비강을 풀어주고, 밑에 노출된 OE를 손상시키거나 편판이 골절되지 않도록 각별히 주의하십시오.
9. 집게를 사용하여 편골판에서 코뼈를 들어 올려 OE를 노출시킵니다(그림 2H). 잔여 전상악골이 등쪽 OE를 가리는 경우 진행하기 전에 제거하십시오( 그림 1I의 검은색 원).
10. 끝이 가는 겸자를 사용하여 비중격의 등쪽을 cribriform plate와의 접합부에서 부드럽게 고정하고 뒤쪽으로 당깁니다(그림 2J,K). 최소한의 저항으로 주요 후각 상피는 완전히 온전한 구조로 분리됩니다(그림 2L).
11. OE 해리를 즉시 진행하거나 나중에 처리하기 위해 조직을 급속 동결합니다.

그림 2: 후각 상피의 신속한 해부 기술. (A) 주변 연조직을 제거한 후 마우스 헤드. (B) 두개골 천장 절개를 위한 색상으로 구분된 가이드. (C) 두개골 천장 절개 후의 모습. (D) 후각 상피에 인접한 안와 부분과 함께 두개골 천장의 첫 번째 반구를 제거합니다. (E) 뇌와 함께 두개골 천장의 반대쪽 부분을 제거합니다. (F) 뇌와 두개골 천장을 제거한 후 머리. (G) 전두상악 봉합사 절개 후 최전방 전두골 및 후방 전상악골 제거. (H) 코뼈 제거. (I) 검은색 원은 선택적으로 제거할 수 있는 잔여 전상악골 영역을 강조 표시합니다. (J) 온전한 후각 상피를 제거하기 위한 겸자 배치. (K) 후각 상피를 풀어주기 위해 뒤쪽으로 당깁니다. (L) 후각 상피의 전체 방출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 후각 상피 해리 및 단핵 분리

1. 샘플당 C-튜브 1개와 15mL 원뿔형 튜브 2개를 얼음 위에 놓습니다.
2. 미리 만들어진 핵 추출 완충액에 RNAse 억제제(최종 농도 0.2 U/μL)를 첨가하여 용해 완충액을 준비합니다.
3. 각 15mL 원뿔형 튜브에 4mL의 1% BSA를 추가하고 잠시 소용돌이치고 초과분을 버립니다. 이것은 15mL 원뿔형 튜브 각각을 BSA로 코팅하여 튜브에 대한 핵 접착을 최소화합니다.
4. 전체 OE 1개에 대해 각 C-튜브에 얼음처럼 차가운 용해 완충액 2mL를 추가합니다.
5. C-튜브에 OE 샘플을 추가합니다. #2 겸자를 사용하여 각 샘플을 해당 C-튜브 위에 잡고 끝이 가는 가위를 사용하여 작은 조각으로 자릅니다.
6. 각 샘플이 들어 있는 C-튜브를 자동 조직 해리제 블록에 거꾸로 놓습니다. 해리제 화면에서 각 블록에 해당하는 사각형이 자유 에서 선택으로 변경됩니다.
7. 폴더 아이콘을 눌러 Miltenyi 폴더로 순환합니다. 화살표를 사용하여 4C_nuclei_1 프로그램(해리기 내에 미리 로드된 프로그램)으로 스크롤합니다. 확인 을 눌러 각 블록에 프로그램을 적용한 다음 시작을 눌러 주기를 시작합니다. 사이클 완료 직후 해리기에서 C-튜브를 제거합니다.
   알림: 가능하면 해리 주기 동안 C-튜브를 얼음처럼 차갑게 유지하십시오. 사이클 완료 직후 해리제에서 샘플을 제거하고 핵의 과용해를 방지하기 위해 프로토콜의 다음 단계를 진행하는 것이 중요합니다.
8. 피펫을 사용하여 C-튜브에서 균질화된 현탁액을 흡인하고 70μm 스트레이너를 통해 첫 번째 BSA 코팅 원추형 튜브로 여과합니다. C-튜브 바닥에 쌓인 뼈 조각을 흡인하지 마십시오.
9. 완전한 여과를 보장하기 위해 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL로 스트레이너를 헹굽니다.
10. 여과된 현탁액을 500×g에서 4°C에서 5 분 동안 스 윙 버킷 원심분리기에서 원심분리합니다.
11. 상청액을 부드럽게 흡인하고 버리면서 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 부드러운 피펫팅을 통해 핵 펠릿을 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL에 완전히 재현탁합니다.
12. 재현탁된 핵을 30μm 스트레이너를 통해 두 번째 BSA 코팅 원추형 튜브로 통과시킵니다. 핵의 농도는 혈구측정기 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 정량화할 수 있습니다.
13. 샘플 무결성을 보존하고 성능 저하를 방지하기 위해 선택한 다운스트림 프로토콜(FACS 유무에 관계없이)을 즉시 진행합니다(그림 3).
    참고: 원활하고 시기적절한 완료를 위해 사용자는 이 전체 프로토콜의 연습 실행을 수행하는 것이 좋습니다.

그림 3: 후각 상피 해리 및 단일 핵 분리 워크플로우. 해부 후 후각 상피는 기계적, 화학적으로 해리됩니다. 그런 다음 용해물을 70μm 스트레이너를 통해 여과하고 1x PBS로 헹구고 500×g에서 5 분 동안 원 심분리합니다. 펠릿은 30μm 스트레이너를 통해 여과되기 전에 1x PBS에 재현탁됩니다. 생성된 핵 현탁액은 다양한 다운스트림 시퀀싱 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

해부 및 분석을 위한 해부학적 맥락을 제공하기 위해 C57BL/6 마우스 두개골의 봉합사와 뼈, 후각 상피(OE)의 중앙 부분을 시각화하고 색상으로 구분했습니다(그림 1). 각 이미지의 한쪽에는 관련 봉합사, 뼈 및 비갑개를 강조하기 위해 주석이 달렸고 다른 쪽은 참조용으로 표시되지 않았습니다. OE 단면은 확립된 프로토콜⁽²⁰)에 따라 준비되었고, 비갑개 식별은 이전의 해부학적 특성화⁽²¹)에 기초하였다.

유세포 분석이 핵 분리 후 필수는 아니지만, 이 원고에 설명된 방법으로 생성된 핵의 품질을 표시하기 위해 이미징 유세포 분석의 대표 데이터가 생성되었습니다. 단일 핵을 식별하기 위한 게이트(그림 4A)와 고품질 핵의 양(낮은 편심률, 높은 원형도)(...

토론

여기에 설명된 절차를 통해 심장 내 1x PBS 관류 후 온전한 OE를 일관되게 제거할 수 있습니다. 이는 이전 방법¹⁶ 에 비해 속도의 현저한 개선을 나타내며 OSN이 뇌 제거 중에 발생하는 축삭 절개술² 후 퇴화되기 시작한다는 점을 감안할 때 특히 중요합니다.

전두골, 전상악골, 코뼈를 조심스럽게 제거하는 것은 온전한 OE를 일관되게 추출하는 데 중요합니다. 또한, 겸자로 OE를 제거하는 마지막 단계에서 코 중격의 일부가 때때로 부착된 상태로 남아 있을 수 있습니다. 비중격이 상당한 수의 호흡기 상피 세포를 포함한다는 점을 감안할 때²², 후속 분석에서 비후각 세포 유형의 포함을 최소화하기 위해 OE로부터 분리하는 것이 권장됩니다. 또한, 이 절차는 균질화 프로토콜과 함께 제시되지만, 이미...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 원심분리기 튜브	셀트리트	229411
뼈 집게	정밀 과학 도구	16102-11
본 미니어처 홍채 가위	밀텍스	18-1392
소 혈청 알부민 용액	시그마-알드리치	A1595
Dumont #3 집게	정밀 과학 도구	11231-30
암컷 C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소	JAX:000664
젠틀MACS C 튜브	밀테니 바이오텍	130-093-237
gentleMACS 옥토 해리제	밀테니 바이오텍	130-096-427
MACS 스마트 스트레이너 30 um	밀테니 바이오텍	130-098-458
MACS 스마트 스트레이너 70 um	밀테니 바이오텍	130-098-462
마이크로 프리드먼-피어슨 롱저	정밀 과학 도구	16220-14
핵 추출 완충액	밀테니 바이오텍	130-128-024
인산염 완충 식염수(PBS), 칼슘 및 마그네슘 없이 1x, PH 7.4 & 0.1	코 닝	21-040-CV
프로텍터 RNAse 억제제	밀리포어 시그마	3335402001
Sorvall Legend XTR 냉장 원심분리기	써모 사이언티픽	50119927-5