방법 논문

자기 입자 이미징을 사용한 폐 섬유증에 대한 이식된 원위 폐 상피 전구 세포의 이미지 유도 생체 내 추적

762 조회수

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DOI:

10.3791/68477

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2025년 6월 27일

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

세포 요법은 전구 세포를 사용하여 손상된 조직을 복구하고 폐 기능을 개선함으로써 폐 섬유증에 대한 유망한 중재를 제공합니다. 이미징이 세포 통합을 추적하는 데 중추적인 역할을 하기 때문에 여기에서는 마우스 모델에서 폐 섬유증에 대한 세포 요법의 자기 입자 이미징 유도 생체 내 추적에 대해 설명합니다.

초록

폐섬유증(PF)은 반복적인 폐포 상피 손상으로 인해 과도한 세포외 기질 침착이 발생하여 조직이 두꺼워지고 흉터가 생기며 가스 교환이 손상되어 호흡기 기능 장애를 일으키는 진행성 만성 폐 질환입니다. 미국에서는 매년 약 50,000명의 새로운 사례가 보고되며, 환자들은 기흉, 폐고혈압, 호흡 부전, 폐암 위험 증가와 같은 심각한 합병증에 직면해 있습니다. 현재의 치료법은 효능이 제한적이며, 주로 질병의 진행을 늦추는 것을 목표로 하고 있습니다. 세포 요법은 손상된 폐 조직을 재생하고 염증을 조절하며 폐 기능을 개선할 수 있는 잠재력을 제공하는 유망한 치료법으로 부상했습니다. 그러나 이러한 치료법의 효과는 숙주 폐 내에서 이식된 세포의 분포, 생존 및 통합을 모니터링하는 능력에 크게 좌우됩니다.

MPI(Magnetic Particle Imaging)는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 추적자로 활용하는 새로운 비침습적 전임상 이미징 방식입니다. MPI는 높은 감도, 특이성 및 배경 신호가 없어 in vivo에서 라벨링된 세포를 실시간 및 정량적으로 추적할 수 있습니다. 이 연구에서는 면역이 저하된 마우스의 폐에 이식된 인간 원위 폐 상피 전구 세포를 모니터링하기 위해 MPI를 사용하는 방법을 조사했습니다. 신호를 최적화하기 위해 세포를 다양한 SPION 농도로 라벨링했으며, 이는 면역염색 및 철 정량화로 확인되었습니다. 기관내 점안 후 이식된 세포의 공간적 분포를 추적하기 위해 2D MPI 스캔을 획득했습니다. 2주에 걸친 종단 이미징을 통해 폐 조직 내 세포 통합 및 보유를 시각화할 수 있었습니다. 성공적인 점안은 좌측 및 우측 폐 모두에서 MPI 신호를 나타냈으며, 이는 시간이 지남에 따라 감소(~65%)했습니다. 그 후 생쥐는 조직학적 검증을 위해 희생되었습니다. 이 연구는 폐 섬유증에서 세포 치료의 비침습적, 종적 추적을 위한 MPI의 유용성을 입증하고 시술 중에 사용되는 복잡한 기술을 중심으로 합니다.

서론

세포 요법 1,2는 백혈병 및 림프종 3,4 (조혈 줄기 세포), 골관절염 5,6 (중간엽 줄기 세포), 제 1 형 당뇨병7 (섬 세포 이식), 척수 손상 8,9, 신경 퇴행성 질환10과 같은 만성 질환의 재생 잠재력을 제공합니다.11,12(신경줄기세포), 폐섬유증 13,14,15,16(폐전구세포). 이러한 치료법은 상당한 잠재력을 가지고 있지만, 면역 거부 반응 및 장기 효능과 같은 과제는 여전히남아 있습니다 17,18. 폐섬유증(PF)은 폐 조직에 과도한 흉터가 생겨 폐 기능이 손상되는 것을 특징으로 하는 만성 진행성 폐 질환이다19. PF에 대한 세포 요법은 중간엽 줄기 세포 또는 원위 폐 전구 세포와 같은 재생 세포를 영향을 받은 폐에 도입하여 손상된 폐 조직을 재생하고 섬유증을 줄이는 것을 목표로 합니다20. 기저 세포, 폐포 II형 세포, 세기관지 폐포 줄기세포 및 기타 다분화능 전구 세포와 같은 집단을 포함하는 원위 폐 전구 세포는 조직 복구를 촉진하고, 염증을 감소시키며, 잠재적으로 손상된 폐 조직을 재생하고, 정상적인 폐 기능을 회복하면서 폐 손상의 일부를 되돌릴 수 있는 능력을 가지고 있다21. 여러 전임상 및 초기 단계 임상 연구에서 폐전구세포를 섬유화성 폐에 이식하면 폐포 구조를 재생하고 조직 리모델링을 촉진하며 염증을 줄이는 데 도움이 될 수 있는 것으로 나타났습니다 13,22,23. 또한 이러한 세포는 섬유화 환경을 조절하는 다양한 성장 인자와 사이토카인을 분비하여 복구를 더욱 촉진할 수 있습니다. 폐 기능 개선에 대한 고무적인 결과에도 불구하고, 이러한 세포를 손상된 폐 조직으로 효율적으로 분리, 확장 및 통합하고, 장기적인 안전성을 보장하고, 원치 않는 부작용을 방지하는 등 세포 전달을 최적화하는 데는 여전히 과제가 남아 있습니다. 폐 섬유증에 대한 전구 세포 요법의 장기적인 안전성과 효능을 평가하고 프로토콜을 개선하기 위해서는 지속적인 연구가 필요합니다.

폐 섬유증을 위해 세포를 폐에 이식하는 데는 여러 가지 기술이 필요하며, 각 기술은 세포 전달, 생존 및 손상된 폐 조직으로의 통합을 개선하도록 설계되었습니다. 일반적인 방법으로는 정맥 주사 24,25, 기관지 내 분만26,27, 기관내 점안 28,29,30,31 등이 있으며, 각각 특정 장점과 문제점이 있습니다. 줄기세포의 정맥 투여는 차선의 폐 귀환, off-target 장기에서의 격리, 제한된 주입 후 생존력 및 면역원성 반응의 위험으로 인해 방해를 받습니다. 기관지 전달은 더 국소적이기는 하지만 이질적인 세포 분포, 잠재적인 기도 폐색, 염증 반응 및 섬유성 폐 구조 내의 절차적 문제로 인해 제약을 받습니다. 마찬가지로, 기관내 점안은 직접적인 폐 침착을 가능하게 함에도 불구하고 일관되지 않은 세포 분산, 부적절한 원위 폐 침투, 국소 자극 및 폐 구획 전반에 걸친 용량 균일성의 변동으로 이어질 수 있습니다. 이러한 모든 기술은 세포 생존, 통합 및 폐 조직 재생의 효능을 개선하는 것을 목표로 하지만 최적의 기술 선택은 이식되는 세포의 유형, 섬유증 단계 및 환자의 전반적인 건강과 같은 요인에 따라 달라집니다.

이러한 어려움에도 불구하고, 기관내 점안은 특히 폐 섬유증의 맥락에서 세포를 폐로 직접 전달하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나로 남아 있습니다. 이 기술에서는 기관에 삽입된 카테터를 통해 세포가 폐로 유입됩니다32. 그런 다음 세포는 폐포 공간에 축적되어 손상된 폐 조직을 잠재적으로 복구할 수 있습니다. 이 방법은 최소 침습적이며 체외 폐 관류와 같은 다른 전달 방법에 비해 상대적으로 수행하기 쉽습니다. 세포가 폐에 직접 침착되기 때문에 효과적인 통합 및 복구 가능성을 높일 수 있습니다. 정맥 주사와 달리 기관내 점안은 전신 순환을 피하여 세포가 간이나 비장과 같은 다른 장기에 갇힐 위험을 줄여 폐에 보다 집중적인 치료 효과를 제공합니다. 이러한 이점에도 불구하고 이 방법은 여전히 차선의 세포 분포 및 유지, 폐 내 생존 측면에서 문제에 직면해 있으며, 이는 치료 효과를 제한할 수 있습니다. 보다 효과적인 임상 결과를 위해 이 접근 방식을 개선하기 위한 연구가 진행 중입니다. 연구원은 몇 가지 요인을 평가하여 기관내 점안이 자신의 응용 분야에 적합한지 결정할 수 있습니다. 여기에는 전달되는 세포의 유형, 생존 및 폐 조직에 통합되는 능력, 질병 모델의 중증도(즉, 폐 섬유증)가 포함됩니다.

이미징은 세포를 추적하고, 세포의 생존력, 분포 및 효과를 평가하고, 세포 치료 모니터링을 강화하고, 치료 전략을 최적화하는 데 필수적인 도구입니다33. 연구원들은 세포 분포 및 유지를 추적하기 위해 이미징 및 전달 후 분석을 통해 전달 효율성을 평가했습니다. 폐 섬유증에 대해 표지된 줄기 세포를 추적하기 위해 형광, 자기 공명 영상(MRI), 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT) 및 초음파와 같은 다양한 기술이 사용되었습니다. 그러나 낮은 깊이 침투(형광), 낮은 감도(MRI), 방사선 노출(CT, PET, SPECT) 및 낮은 해상도(초음파)와 같은 한계에 직면해 있습니다34. 이미징 대비, 해상도 및 생체 적합성을 최적화하면 이러한 문제를 어느 정도 극복하는 데 도움이 될 수 있지만, 새로운 이미징 기술을 탐색하는 것도 폐의 정확한 줄기 세포 추적에 필수적임을 입증할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 MPI(Magnetic Particle Imaging)는 배경 간섭 없이 높은 대비로 고감도, 실시간 정량적 이미징을 제공하는 유망한 방사선 없는 이미징 방식으로 부상했습니다.

MPI는 직접 시각화를 위해 초상자성 산화철 나노 입자(SPION)를 사용하며, 작동 원리는 시간에 따라 변하는 자기장35,36에 노출될 때 이러한 SPION의 비선형 자화 반응을 기반으로 합니다. 전자석은 FFR(Field-Free Field)을 만드는 데 사용되며, 이 영역 내의 입자만 비선형 자화를 나타내고 진동 자기장에 의해 여기될 때 신호를 생성합니다. 반면에, 이 FFR 외부의 입자의 자화는 포화 상태이며 신호 생성에 참여하지 않습니다. 이미징 볼륨 전체에서 FFR을 체계적으로 이동함으로써 MPI는 나노 입자 분포 및 후속 이미지의 공간 맵을 구성합니다. MPI는 기존의 이미징 방식에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다37,38. MRI 또는 CT와 달리 MPI는 트레이서에서만 신호를 제공하므로 배경 노이즈가 없고 대비가 뛰어납니다. 높은 시간 해상도로 실시간 이미징을 제공하므로 세포 이동 또는 관류와 같은 동적 프로세스를 추적하는 데 이상적입니다. 또한 MPI는 매우 민감하여 PET 또는 CT와 달리 전리 방사선 없이 소량의 SPION을 검출할 수 있습니다. 또한 우수한 선형 정량화를 보여 추적자 농도를 정확하게 평가할 수 있습니다. 전반적으로 MPI는 감도, 안전성 및 정량화의 강점을 결합하여 생체 의학 이미징을 위한 강력한 도구입니다. MPI는 폐의 줄기세포 추적에 유망하여 세포 이동, 보유 및 치료 효과를 정밀하게 모니터링할 수 있습니다. 조직 신호 간섭 없이 우수한 대비를 제공하여 표지된 줄기세포의 정확한 국소화를 가능하게 합니다 39,40,41,42. 다음 섹션에서는 이러한 연구를 위해 수행된 프로토콜을 간략하게 설명하고, 라벨링된 세포를 마우스 폐에 전달하기 위해 기관내 점안을 사용하고 MPI를 통해 확인하는 방법을 보여줍니다.

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프로토콜

동물 피험자와 관련된 모든 절차는 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았으며 인간 피험자와 관련된 모든 절차는 Corewell Health IRB no. 2017-198의 승인을 받았습니다. 모든 환자는 연구에 참여하기 전에 서면 동의서를 제공했습니다.

폐 이식을 받는 특발성 폐섬유증(IPF) 환자의 인간 폐 이식 샘플은 Corewell Health에서 수집되었습니다. 이식 시술 전에 모든 환자는 저산소혈증, 호흡곤란, 폐용적 감소를 특징으로 하는 특발성 폐섬유증(IPF)의 진단 기준을 충족했다43. 폐엽의 말단부에서 채취한 조직의 병리학적 분석에서 섬유증의 존재가 확인되었습니다.

수컷 NOD/SCID 마우스는 생후 8주령에 구입하여 1주일 동안 적응시킨 다음 시술 전 12주까지 숙성시켰습니다.

1. 인간기도 상피 세포의 격리 그리고 확장

  1. 해부 중 세포 무결성을 보존하기 위해 이식된 폐 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 샘플에 존재하는 기관지/대기도를 식별합니다. 소기도는 폐 샘플의 원위부에 위치하며, 대기도에서 가장 멀리 떨어져 있습니다. 멸균된 기구를 사용하여 폐 샘플의 원위 부분을 절제하고 조직의 소화를 돕기 위해 더 작은 부분으로 처리합니다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 검체를 헹구어 과도한 혈액과 체액을 제거한 다음, 50mL 튜브에 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로테아제, 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 1개, DNase I 및 겐타마이신 1개로 구성된 완충액에서 작은 기도를 포함하는 이식된 폐 조직을 분해합니다. 조직을 37°C 수조에 넣어 약 4시간 동안 또는 조직이 충분히 소화될 때까지 흔들게 합니다.
  2. 50mL 튜브의 내용물을 멸균된 100μm 세포 여과기에 통과시킵니다. DPBS로 조직을 3번 헹구고 세척액을 스트레이너에 통과시킵니다. 400 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, 상층액을 제거하고, 500 μL로 설정된 피펫으로 세포 현탁액 50x를 피펫팅하여 1mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
  3. 기도 상피 성장 배지를 포함하는 75cm2 배양 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다. 세포를 37 °C, 5 % CO2 에서 약 2 주 동안 배양합니다.

2. 나노 입자로 기도 상피 세포 라벨링 (산화철 추적자)

  1. 상피 배양이 80% 융합되면 최종 농도 250μg/mL의 산화철 추적자로 세포에 라벨을 부착합니다. 상피 세포의 플라스크당 10mL의 배양 배지에 적절한 부피의 산화철 추적자를 추가하고 48시간 동안 배양합니다.
    참고: 세포 라벨링에 대해 다양한 농도의 산화철 추적자(50, 100, 200 및 250μg/mL)를 평가한 후 2D MPI 스캔을 수행했습니다(그림 1A). 이식을 위한 50,000개의 세포와 함께 250μg/mL의 농도가 이 연구를 위해 확정되었습니다.
  2. 48시간 후 DPBS로 세포를 3회 세척하여 과도한 나노 입자를 제거합니다.
  3. 세포 분리 시약을 사용하여 세포를 분리하고 37°C에서 15분 동안 또는 세포가 플라스크 표면에서 들어 올려지기 시작할 때까지 세포를 배양합니다.
  4. 1mL의 소 태아 혈청이 들어 있는 50mL 튜브에 세포를 모읍니다. 플라스크를 5mL의 DPBS로 3x 헹구고 세포가 들어 있는 50mL 튜브에 세척제를 추가합니다.
  5. 400 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 500μL로 설정된 피펫으로 세포 현탁액 50x를 피펫팅하여 1mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
  6. 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정하고 in vivo 이식에 필요한 세포 현탁액의 부피를 측정합니다.
  7. 세포 현탁액의 100μL를 분취하고 4% 파라포름알데히드에 고정합니다.

3. 시험관 내 면역 염색 및 현미경 검사

  1. 100μL의 세포 현탁액 분취액을 슬라이드와 필터가 들어 있는 cytospin 카트리지에 넣고 1,000rpm에서 5분 동안 회전합니다.
  2. 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 세포를 윤곽을 그립니다.
  3. DPBS로 2 x 15분 동안 슬라이드를 세척합니다.
  4. 실온에서 5분 동안 DPBS에 0.1% Triton X-100을 배양하여 슬라이드의 세포를 투과화합니다.
  5. DPBS로 2 x 2분 동안 세포를 세척합니다.
  6. DPBS에 5% 소 혈청 알부민(BSA)/1% 염소 혈청으로 슬라이드를 2시간 동안 막습니다.
  7. DPBS의 2.5% BSA/0.5% 염소 혈청의 1차 항체(항덱스트란)의 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  8. 1차 항체를 제거하고 Tween 20(TBST)을 사용하여 1x Tris-Buffered Saline에서 3 x 5분 슬라이드를 세척합니다.
  9. 2.5% BSA/0.5% 염소 혈청에 1:1,000 2차 항체를 DPBS에 함유한 2차 항체로 어두운 곳의 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  10. 3x TBST로 5 x 1분 동안 슬라이드를 세척합니다.
  11. 핵 염색제인 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 DPBS에서 1:1,000 농도로 슬라이드에 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  12. 1x TBST로 슬라이드를 2 x 5분 세척합니다. 슬라이드에서 초과 1x TBST를 제거합니다.
  13. DAPI로 장착 매체를 추가하고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 슬라이드 위에 유리 커버슬립을 놓습니다.
  14. 슬라이드가 고정되면 투명한 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
  15. 컨포칼 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다.

4. 기관내 점안을 이용한 세포 이식

  1. 준비
    1. 마우스의 무게를 측정하여 각 마우스에 필요한 블레오마이신(BLM)의 용량을 계산합니다.
    2. 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에서 원하는 BLM 용액(멸균된 식염수로 희석)을 50μL를 초과하지 않는 부피로 준비합니다.
      참고: 약물 농도는 실험 목표에 따라 달라집니다. 이 절차에는 0.6 U/kg의 BLM이 사용되었습니다.
    3. BLM 용액을 피펫에 로드합니다. 또한 주사기에 200μL의 공기를 예압하여 모든 액체량이 기관으로 배출되도록 합니다.
      참고: BLM 치료 72시간 후, 라벨링된 세포 현탁액이 유사한 방식으로 투여됩니다.
    4. 2.6단계에서 얻은 세포 수를 사용하여 투여할 50,000개의 세포를 포함하는 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.
    5. 마취 장치에 연결된 유도 상자에 마우스를 넣고 진정될 때까지 이소플루란(2.5-3%)을 공급하여 마우스를 마취합니다.
      참고: 마우스는 전체 절차 동안 (1) BLM 투여 당일과 (2) BLM 투여 후 72시간 후인 세포의 기관 내 점안 당일에 두 번 마취됩니다.
    6. 그림 2A와 같이 광섬유 프로브가 후두경과 카테터를 통과하도록 광섬유 삽관 키트를 설정합니다.
      알림: 섬유의 조명이 켜진 끝은 카테터 튜브 바로 바깥(1-2mm)에 배치해야 합니다.
  2. 기관내 점안(Intratracheal Inspiation)
    1. 뒷다리 중 한쪽에 발가락을 끼워 페달 반사를 확인하여 마취를 확인합니다. 적절한 마취가 확인되면 각진 설치류 삽관대에서 앙와위 자세로 앞니를 매달아 쥐를 매달아 놓습니다(그림 2B-D).
    2. 끝이 뭉툭한 집게를 사용하여 혀를 조심스럽게 잡고 위쪽 및 왼쪽으로 움직여 후두를 적절하게 시각화할 수 있도록 혀의 위치를 잡습니다.
    3. 광섬유 프로브를 켜고 입으로 들어가 기관에 접근합니다. 후두경의 돋보기를 사용하여 후두를 더 잘 시각화하고 기관 개구부에서 성대를 찾습니다.
    4. 기관 입구에 카테터를 삽입하고 후두경을 매우 조심스럽게 분리하여 빼냅니다. 카테터의 상단에 작은 식염수 방울(20μL)을 놓습니다.
      알림: 액체 레벨은 마우스의 호흡 속도에 맞춰 위아래로 움직입니다. 이렇게 하면 카테터가 기관에 배치되고 식도에 잘못 삽입되지 않는지 확인할 수 있습니다.
    5. 200μL의 공기가 예재된 주사기를 부착하고 물방울을 내부로 밀어 넣습니다. 세포 현탁액(≤50μL)을 카테터에 넣고 이전과 같이 공기 주입 주사기를 사용하여 주입합니다.
    6. 주입된 액체가 기관을 빠져나가는 것을 방지하려면 카테터를 5-7초 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 카테터를 부드럽게 당겨 빼냅니다.
    7. 삽관 스탠드에서 마우스를 동일한 위치에 최소 30초 동안 유지합니다.
    8. 마우스를 제거하고 가열 패드 위에 놓인 복구 케이지에 넣습니다. 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.

5. 자분 이미징

  1. 진정될 때까지 이소플루란(2-2.5%)을 공급하는 마취 장치에 연결된 유도 상자에 마우스를 넣어 마취합니다.
  2. 마취 라인이 적절한 연결을 통해 침대 아래를 통과하도록 MPI 스캐너에 마우스 베드를 설정합니다.
  3. 마우스가 진정되는 동안 이미징을 위해 MPI 스캐너를 준비합니다. 연결된 소프트웨어를 시작하고 Project 에서 폴더 이름을 정의하고 식별을 위해 Exam name domain에서 스캔을 정의하고 요구 사항에 따라 스캔 매개변수를 설정합니다. 이 절차를 수행하려면 다음 스캔 매개변수를 사용하십시오. 스캔 유형: 2D 스캔; 스캔 모드: 표준; 전송 채널: 다중 채널(등방성); 예측당 평균: 2.
  4. 4.2.1단계에 설명된 대로 마취를 확인합니다. 그림 2E와 같이 MPI 베드에 마우스를 단단히 놓습니다.
    알림: 스캔하는 동안 마취를 적절하게 유지하기 위해 주둥이가 침대에 내장된 노즈콘과 적절하게 정렬되어 있는지 확인하십시오.
    주의: 스캔 중 마취가 충분하지 않으면 스캔이 실행되는 동안 마우스가 깨어날 수 있습니다.
  5. 마우스를 스캐너에 넣었으면 보어 안쪽으로 베드를 밀어 넣고 스캔 시작을 클릭합니다.
  6. 스캔이 완료되면 MPI 베드에서 마우스를 제거하고 발열 패드에 놓인 복구 케이지에 넣습니다. 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.
  7. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다.

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결과

파일럿 연구는 6마리의 쥐를 대상으로 수행되었습니다. 이 중 연구가 완료되기 전인 10일째에 죽은 쥐는 단 한 마리뿐이었습니다. 서로 다른 라벨링 농도에 대한 2D MPI 신호 강도는 세포 수의 함수로 평가되었습니다(그림 1A). 신호 강도는 산화철 추적자의 농도에 정비례하는 것으로 관찰되었습니다. 따라서 250μg/mL의 농도를 최적의 라벨링 농도로 간주하여 후속 연구에 사용했습니다. 또한 면역 염색 및 후속 형광 현미경을 사용하여 체외 세포 표지를 확인했습니다(그림 1B). 세포 표지 효율은 유세포 분석을 사용하여 평가할 수도 있으며, 이를 위해서는 형광단을 나노 입자에 접합하는 추가 단계가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 접근 방식은 현재 연구에서 활용되지 않았지만 향후 조사에 통합될 수 있는 귀중한 전략으로 남아 있습니다.

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토론

생쥐의 기관내 점안은 물질을 폐로 직접 전달하는 정밀한 기술입니다. 이 절차 전반에 걸쳐 여러 중요한 단계에서 세심한 주의가 필요합니다. 불편함과 움직임을 방지하기 위해 적절한 마취 깊이를 확보하는 것부터 시작하고, 기관 입구에 명확하게 접근할 수 있도록 기도를 정렬하기 위해 목을 뻗은 상태에서 마우스를 앙와위 자세로 배치합니다. 혀 억제제를 사용하면 기도를 여는 데 도움이 될 수 있습니다. 카테터를 조심스럽게 삽입하고 역류나 흡인을 피하기 위해 물질(예: 줄기세포, 약물, 나노 입자)을 천천히 주입해야 합니다. 주입 후에는 완전한 회복을 보장하고 마우스를 케이지로 되돌리기 전에 고통이나 호흡기 합병증을 모니터링하십시오. 이미징 중 주목할 만한 다른 단계로는 이미징 필드에 맞추기 위해 MPI 스캐너에서 마우스를 적절하게 배치하는 것, 고해상도 추적을 위한 자기장 강도 및 스캐닝 모드와 같은 매개 변수의 최적화가 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구를 위한 자금은 R01HL153165-01A1에서 X.P.L.로, R21AI159928-01에서 P.W.로 보조금으로 부분적으로 제공되었습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMT세포 수집 및 BLM 희석 준비용
Anti-Dextran 항체STEMCELL Technologies60026일차 항체
BD Luer-Lok 주사기Becton, Dickinson309628기관 내 침착 중 공기 주입용
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-) Gibco14190250
Fetal Bovine Serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamicin Gibco15750060
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568ThermoFisher ScientificA-11004이차 항체
Goat SerumMillipore-SigmaG9023
IsofluraneCovetrus11695067772가스 마취
Isoflurane vaporizerSOMNI ScientificVS6002마취 장치
MomentumMagnetic Insight Inc임상 전 자기 입자 이미징(MPI) 스캐너
Mouse intubation kitOHANOhan-201모든 필수 액세서리가 포함된 완전한 삽관 키트
NOD/SCID MiceJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303면역 저하된 마우스 모델
Penicillin/Streptomycin Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI InvitrogenP36962면역 염색된 슬라이드용 장착 매체
Protease from Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Surgical kit쥐의 혀를 잡는 데 사용되는 둔부 포스펫
Tris-Buffered Saline with Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01세포 표지에 사용되는 철 산화물 추적자 및 후속 MPI
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참고문헌

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