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방법 논문

마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)

1.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68482

⸱

2025년 7월 15일

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

여기에서는 확장된 생체 외 실험을 위해 쥐의 눈에서 망막을 분리하는 자세한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 조직에서 망막 신경교세포를 제자리 로 유지함으로써 제공되는 연구 방법을 활용하고자 하는 연구자가 기술적으로 까다로운 접근 방식에 접근할 수 있도록 하는 것을 강조합니다.

초록

녹내장에서 신경교세포의 역할은 점점 더 두드러지는 연구 주제이지만, 이러한 지원 세포, 즉 성상교세포와 미세아교세포의 집단이 망막 신경절 세포의 생존에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 아직 많이 알려져 있지 않습니다. in vivo 및 in vitro 모델은 어느 정도의 통찰력을 제공하지만, 두 접근 방식 모두 전자의 경우 말초 면역 반응의 영향과 후자의 경우 세포 분리 및 배양에 의해 유도된 생리학적 기능의 변화와 같은 상당한 제한이 있습니다. 이러한 교란 요인을 최소화하기 위해 당사는 성상세포, 미세아교세포 및 기타 망막 세포 유형을 최소 3일 동안 현장에서 유지할 수 있는 생체 외 망막 이식 시스템을 개발하여 in vivo 모델에서 일반적으로 실현 가능한 것보다 더 높은 처리량으로 표적 연구를 가능하게 합니다. 결정적으로, 이 접근법은 살아있는 동물에서는 까다롭거나 실현 불가능할 수 있는 방법론에 매우 적합하지만 온전한 신경 조직에 대한 일반적인 다운스트림 분석과 호환됩니다. 여기에서는 생체 외 망막에서 신경교세포와 망막 신경절 세포가 겪는 변화를 기록한 면역형광 현미경 검사의 대표적인 결과와 함께 온전한 망막 외식식물의 분리 및 배양에 적합한 프로토콜을 제시합니다.

서론

눈 뒤쪽에 위치한 중추신경계(CNS)의 연장선인 감광성 망막은 시력에 필수적이지만 급성 부상과 만성 질환에 취약합니다. 다른 중추신경계 영역과 마찬가지로, 성인 망막의 뉴런은 소실되어도 대체되지 않으며, 시각 정보를 응집하여 뇌로 전달하는 망막 신경절 세포(RGC)는 녹내장의 기능 장애와 사망에 특히 취약하여 돌이킬 수 없는 시력 상실을 초래합니다 1,2. 녹내장은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이지만3, 녹내장을 앓고 있는 개인에게 미치는 파괴적인 영향과 사회에 대한 전반적인 비용에도 불구하고 질병의 초기 단계가 망막 신경절 손실에 어떻게 기여하는지에 대해서는 많은 것이 알려지지 않았습니다4. 신경교세포(glia)의 역할은 녹내장 병태생리학에서 연구하는 주요 분야인데, 이러한 비신경세포 지원 세포는 망막 신경절 세포의 생존에 필수적이지만5 유익한 행동6을 감소시키거나 심지어 해로운 표현형7의 채택을 촉진할 수 있는 질병의 표현형 변화를 겪기 때문입니다. 신경교세포(glia)라는 용어는 중추신경계(CNS) 8 전반에 걸쳐 다양한 특수 세포 유형을 포함하지만, 이들은 크게 두 가지 범주로 나눌 수 있는데, 하나는 뉴런과 발달 계통을 공유하고 영양성, 에너지적, 구조적 지원을 제공하는 세포유형9과 특수 면역 감시 및 반응 작업을 수행하는 골수성 기원을 가진 세포 유형이다10. 전자의 성상세포(astrocyte)와 뮐러(Müller) 세포, 후자의 미세아교세포(microglia)는 망막에 서식하며5 녹내장에서 질병 진행과 망막 신경절 세포(RGC) 생존에 대한 그들의 역할에 대한 중요한 의문을 제기하는 큰 변화를 겪습니다11.

이러한 질문에 답하려는 노력은 in vivo 및 in vitro 조사 모두에 도전을 제시하는 망막 신경교세포의 고유한 특성으로 인해 부분적으로 방해를 받고 있습니다. 뉴런과 달리 전기적으로 상대적으로 조용하기 때문에 생체 내에서 망막 신경절 및 광수용체의 기능 평가를 가능하게 하는 ERG와 같은 접근 방식은 신경교세포 기능 및 행동의 변화를 조사하는 데 적합하지 않습니다. 그리고 녹내장의 유도가능한 12 및 자발적13 모델을 사용할 수 있지만, 검출 가능한 망막 신경절 손실에 선행할 수 있는 질병의 가장 이른 시점에서 신경교세포의 변화에 대해서는 많은 것이 알려지지 않았으며, 이러한 모델 중 많은 모델에서 질병 상태의 다양한 침투로 인해 더욱 악화되는 문제입니다. 더욱이, 임상적 및 실험적 녹내장의 증거는 말초 면역 세포가 질병 진행에 영향을 미치기 위해 다른 '방향'으로 작용할 수 있다는 지표에도 불구하고 미세아교세포와 구별하기 어려울 수 있는 말초 면역 세포의 기여를 시사합니다14,15.

시험관 내 망막 신경교세포를 연구하는 데에도 많은 어려움이 있습니다. 뇌에서 성상교세포16,17 및 미세아교세포18의 분리 및 배양은 잘 확립되어 있지만, 최근 연구는 특히 성상세포에서 중추신경계 영역 간의 광범위한 신경교세포 이질성을 강조하고 있으며19, 한 영역에 존재하는 표현형이 망막과 같은 다른 영역의 신경교세포에 존재하지 않을 수 있습니다20,21. 그러나 연구를 위해 망막 성상세포와 미세아교세포를 직접 분리하는 것은 두 세포 유형 모두 상대적으로 희박하기 때문에 특히 까다로운데, 각 세포 유형은 쥐 망막에 있는 약 650만 개의 세포 중 1% 미만을 차지합니다 22,23,24. 더욱이, 뉴런과 달리 신경교세포는 가소성이 매우 높으며 주변 환경의 급격한 변화에 빠르게 적응합니다 16,18,25; 결과적으로, 이러한 세포에서 관찰된 in vitro 행동은 건강이나 질병에서 일반적으로 볼 수 있는 표현형 패턴이 아니라 새로운 환경에 대한 특정 적응을 나타낼 수 있습니다. in vivo 실험과 망막 신경교세포의 1차 배양 모두의 한계를 감안할 때, 우리는 신경교세포, 망막 신경절 세포, 망막절 세포 및 기타 망막의 다른 요소들이 in siwe 맥락에서 보존되는 중간 접근법인 망막 이식을 모색해 왔습니다. in vivo 모델과 비교하여, 이 접근법은 단축된 실험 시간 경과26를 제공하고, 망막 신경교세포(retinal glia)27의 직접적인 실험적 조작을 가능하게 하며, 말초 면역 세포 침투(peripheral immune cell infiltration)의 잠재적인 교란 영향을 피할 수 있습니다14. 반대로, 일차 세포 배양과 달리 세포 외 환경의 파괴가 최소화되고 신경교세포는 손상되지 않고 형태학적으로 인식할 수 있어 효소 및 기계적 파괴 후 이러한 세포를 본질적으로 재성장시키고 식별하는 것과 관련된 문제를 피할 수 있습니다16,25.

앞서 설명한 망막 적출 방법론과 비교하여, 이 접근법은 기술적 신뢰성, 재현성 및 접근성 향상을 위한 접근법의 '사용자 친화성'을 극대화하는 데 중점을 둡니다26,28. 다른 연구자들과의 개인적인 커뮤니케이션을 통해, 우리는 살아있는 망막을 다루는 것과 관련된 기술적 어려움이 외식술을 활용하고자 하는 많은 사람들에게 큰 장애물이 되는 반면, 적절한 세포 배양 시설을 갖춘 그룹에서는 배양에서 외식된 망막을 유지하는 것이 상대적으로 간단하다는 것을 발견했습니다. 따라서 이 프로토콜에는 망막 분리와 관련된 학습 곡선을 줄이고 연구자가 실험 데이터를 보다 신속하게 수집할 수 있도록 하기 위한 여러 가지 혁신이 포함되어 있습니다. 마지막으로, 망막 신경교세포의 거동을 조사하고 주로 면역형광 현미경으로 특성화하기 위한 이 외식 모델의 잠재력에 특히 중점을 두었지만, 다른 망막 세포 유형 및 구조도 대부분 보존되어 있으며 외출된 망막은 광범위한 추가 조사 기술에 순응할 수 있습니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 Schepens Eye Research Institute의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜 # 2022N000030, 2025년 3월 4일 승인). 동물은 시력 및 안과 연구 협회(ARVO)의 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 성명서에 따라 취급되었습니다.

참고: 그림 1 은 적출된 쥐의 눈에서 살아있는 망막을 분리하는 주요 단계를 보여줍니다.

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그림 1: 적출된 쥐의 눈에서 살아있는 망막을 분리하는 주요 단계를 다이어그램으로 표현 한 것입니다. 주요 단계의 해당 단계 번호는 원으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 준비

  1. 1mL 피펫과 각진 집게 한 쌍을 소독하고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 이는 프로토콜의 섹션 3에서 필요합니다.
  2. 보어가 가장 넓은 저장소 아래 약 2cm 떨어진 샤프트를 가로질러 수직으로 절단하여 이송 피펫을 수정하여 피펫을 줄이고 개구부를 넓힙니다. 망막이 걸리지 않도록 깨끗하게 절단하십시오.
    알림: 이 도구는 깨끗하고 사용 사이에 멸균수로 헹구면 재사용할 수 있도록 보관할 수 있습니다.
  3. 47.5mL의 Neurobasal 배지에 500μL의 N-2 보충제, 1mL의 B-27 보충제, 500μL의 글루타맥스 및 500μL의 페니실린-스트렙토마이신 혼합물(100U/mL의 페니실린 및 100mg/mL의 스트렙토마이신의 최종 농도)을 보충하여 생물안전성 캐비닛에 50ml의 외식 배지를 무패로 준비합니다.
    참고: 각 분리 시리즈에 대해 새로운 이식 배지를 준비합니다. 여분의 배지는 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있으며 필요한 경우 배지 교체에 사용할 수 있습니다. 개봉 후에는 사용하지 않은 Neurobasal 배지를 1개월 후에 교체하십시오. N-2 및 B-27은 동결-해동 주기를 피하여 일회용 부분 표본으로 냉동 보관해야 합니다.
  4. 생물 안전 캐비닛에서 사용할 각 웰에 인서트를 추가하여 배양 플레이트를 무균 상태로 준비하고, 배양 배지와 접촉할 표면을 만지지 않도록 인서트 테두리에서 나오는 '갈래'를 통해 처리합니다.
    1. 삽입물에 1mL의 외식용 배지를 추가한 다음 웰 자체에 3mL를 추가합니다. 증발을 제어하기 위해 사용하지 않은 우물에 2-3mL의 멸균수를 추가합니다.
    2. 조직 분리 약 30분 전에 평형을 이루기 위해 5% CO2 와 함께 37°C에서 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다.
  5. 조직 안정화 및 전달을 위한 기질을 만들기 위해 필터 사각형을 준비합니다. 면도기나 메스로 재료 주변을 절단하여 병 상단 여과 키트에서 필터를 추출합니다. 필터가 접히거나 찢어져 부상을 입거나 손상되지 않도록 주의하십시오.
    알림: 나사산 어댑터가 저장소와 만나는 부분이 더 가단성 있는 불투명 플라스틱을 절단하기 위해 견고한 면도기를 사용하여 투명한 플라스틱 저장소를 제거하면 추출 과정이 간단해지지만 부상을 방지하기 위해 추가 주의가 필요합니다.
    1. 절단으로 필터를 분리한 후 집게를 사용하여 추출합니다. 추출 중과 추출 후의 필터 방향에 유의하십시오. 무광택 면(저장소를 향함)은 전송을 위해 2.16단계에서 망막을 장착할 수 있도록 똑바로 세워야 합니다.
    2. 필터를 약 7mm × 7mm의 작은 사각형으로 자릅니다. 각 망막 외식에는 하나의 정사각형이 필요합니다. 100mm 페트리 접시에 사각형을 멸균 된 물에 최소 20 분 동안 미리 담그십시오.
      알림: 필터 사각형은 사용하기 전에 최대 1주일 동안 멸균 물에 담근 상태로 유지할 수 있습니다. 필터 사각형은 담그기 전에 높은 수준의 정전기를 발생시키는 경향이 있기 때문에 필요한 만큼의 사각형만 준비하십시오. 나머지 건조 필터 재료는 나중에 사용할 수 있도록 멸균 100mm 페트리 접시에 무기한 보관할 수 있습니다.

2. 격리 및 장착

  1. 2차 접근법으로 확인하기 전에 승인된 방법을 통해 마우스를 안락사시킵니다. 이 연구는 CO2 질식 후 자궁경부 탈구를 사용했습니다. 끝이 뭉툭한 구부러진 겸자로 양쪽 눈을 적출하고 멸균 PBS에 넣습니다.
  2. 100mm 페트리 접시에 멸균 PBS를 채우고 양안 해부 스코프의 스테이지에 올려 작업 공간을 준비합니다.
    1. 1cm 너비의 실험실 물티슈 스트립을 자르고 접시에 담그면 안정화 기판 역할을합니다.
    2. 한쪽 눈을 해부 접시에 옮기고 다른 쪽 눈을 PBS에 그대로 둔 다음 얼음 위나 4°C의 냉장고에 넣습니다.
      참고: 망막은 장시간의 사후 간격에 민감하기 때문에 한 번에 한 마리의 마우스를 안락사시키는 것이 좋습니다.
  3. 눈을 배치하고 고정시킵니다. 집게를 사용하여 물에 잠긴 실험실 물티슈로 눈을 움직이면 안정화에 도움이 됩니다.
    1. 적절한 고정 지점을 식별하고, 각진 집게로 잡고, 눈을 부드럽게 굴려 측면 또는 이상적으로는 아래에서 잡힙니다. 전후 축(즉, 각막에서 시신경까지)이 수평인지 확인합니다. 이 방향은 가시성을 향상시키고 해부 중 눈에 가해지는 압력을 최소화합니다.
      참고: 가능하면 눈을 찌르거나 쥐어짜지 않도록 안와외 조직을 잡고 시신경이나 지방보다 근육이나 결막을 선호합니다.
  4. 각진 집게로 고정을 유지하면서 눈이 완전히 잠기고 단단히 고정되었는지 확인하십시오. #11 메스의 끝이 각막이 공막으로 전이되는 변연부에서 약 0.5mm 뒤쪽으로 평행하게 절개합니다.
    알림: 이 절개 부위는 스프링 가위의 한쪽 날 끝에 맞을 만큼 충분히 커야 합니다. 메스 끝의 날카로움은 지구본을 깨끗하게 뚫는 데 필수적이므로 두 개의 망막마다 칼날을 교체하십시오.
    1. 스프링 가위의 날 하나를 지구본 안에 삽입하고 눈 주위를 둘레로 자르기 시작하고 집게를 사용하여 필요에 따라 눈의 위치를 부드럽게 조정합니다.
      알림: 이 절단은 가능한 한 직선이고 변절부와 평행해야 합니다. 눈의 위치를 바꾸려면 가위를 내려놓고 양손에 집게를 하나씩 사용해야 할 수도 있습니다. 일단 노출되면 박리 과정 전체에 망막이 잠기도록 합니다.
  5. 상처가 눈을 둘러싸게 되면 앞쪽 부분과 수정체를 조심스럽게 제거한 다음 아이컵을 위쪽을 향하도록 회전하여 육안 검사와 유리체 제거를 용이하게 합니다. 확장된 시신경 조각이 붙어 있는 경우 이를 용이하게 하기 위해 더 짧은(1-2mm) 길이로 다듬습니다.
  6. 망막에 눈에 보이는 손상이 있는지 검사하고 유리체실에 전방 분절을 제거하는 동안 들어갔을 수 있는 RPE 또는 맥락막의 색소 세포와 같은 파편이 있는지 검사합니다. 각진 집게를 사용하여 이 위치에서 아이컵을 고정합니다.
    참고: 최적의 결과를 얻으려면 유리체 챔버의 파편을 제거하고 망막 주변부에 있는 섬모체의 잔류 유리체 및 부착 잔여물을 최소화해야 합니다. 이는 어려운 과정일 수 있으며, 추가 참고 사항은 대표 결과의 '기계적 손상 인식 및 문제 해결' 및 '대사 손상' 섹션에서 찾을 수 있습니다.
    1. 수정된 전사 피펫을 사용하여 PBS로 유리체 챔버를 세척하여 작은 미립자 파편을 제거하고, 피펫 팁을 액체 표면 아래에 유지하고 저장소 전구에 적절한 양의 PBS를 유지하여 기포를 방지합니다.
    2. 미세한 수채화 브러시로 더 큰 파편을 제거하고 망막 표면과의 접촉을 최소화하십시오. 필요한 경우 끝이 가는 집게로 더 지속적인 파편을 제거하십시오. 그러나 손상을 방지하기 위해 금속 도구 끝이 망막에 직접 닿지 않도록 하십시오.
  7. 눈에 보이는 파편을 제거한 후 위에서 설명한 대로 이송 피펫의 PBS로 유리체 챔버를 반복적으로(3-5회) 세척합니다. 이렇게 하면 파편을 제거한 후 남아 있을 수 있는 느슨하게 부착된 유리체가 제거됩니다. 가는 브러시를 사용하여 챔버를 부드럽게 조사하고, 특히 모양체의 요소가 남아 있는 경우 주변 근처를 조사합니다. 유리체는 광학적으로 투명하지만 브러시 섬유에 드래그 역할을 하며 이러한 방식으로 감지할 수 있습니다.
    참고: 망막의 얇은 유리체 잔류층은 망막을 분리하거나 생체 외 상태로 유지하는 데 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 보이지만, 종종 모양체의 잔류 구조와 관련된 망막 주변에 상당한 양의 존재는 제거하지 않을 경우 망막 접힘 및 샘플 손실을 유발할 수 있습니다.
    1. 유리체의 상당한 주머니가 남아 있는 경우 브러시를 사용하여 주변을 향해 바깥쪽으로 부드럽게 쓸어 제거하여 브러시의 섬유가 망막에 닿을 경우 얕은 각도에서 브러시를 따라가도록 하여 챔버에서 유리체를 밀어내는 대신 당깁니다.
      참고: 유리체를 제거하려면 거시적으로 볼 수 없는 망막 손상을 방지하기 위해 특히 조심스럽게 다루어야 합니다. 이러한 손상을 인식하고 방지하는 방법에 대한 조언은 대표 결과의 '기계적 손상 인식 및 문제 해결' 및 '대사 손상' 섹션에서 찾을 수 있습니다.
  8. 유리체실에서 파편이 제거되고 최소한의 유리체만 남게 되면 각진 집게로 샘플을 계속 안정화하면서 안구컵에서 바깥쪽 망막을 부드럽게 분리합니다. 시신경두의 손상을 피하고 망막을 고정하기 위해 이 구조를 그대로 두십시오.
    1. 집게를 잡고 끝이 닿도록 닫힌 위치를 유지하고 가능한 경우 이전 취급의 기존 간격을 사용하여 망막과 맥락막 사이에 부드럽게 삽입합니다. 집게의 끝부분보다는 편평한 팔을 사용하여 망막과 맥락막 사이의 주머니를 이러한 구조가 완전히 분리될 때까지 확대합니다.
      참고: 망막과 맥락막 사이의 간격을 확장하기 위해 끝을 미는 것보다 측면 움직임을 강조하십시오. 이러한 동작 중에 겸자를 부드럽게 비틀면 분리를 개선하는 동시에 겸자와 조직 사이의 마찰로 인한 순전한 응력을 줄일 수 있습니다.
  9. 맥락막에서 바깥쪽 망막을 분리한 후 두 번째 집게를 사용하여 공막, 맥락막 등의 아이컵을 아래쪽으로 당기면서 샘플을 계속 안정화합니다. 망막이 성공적으로 분리되었다면, 망막은 시신경두에 묶여 제자리에 있어야 하며, 아이컵은 한 쌍의 집게로 잡을 수 있어야 합니다. 망막이 아이컵으로 눌리면 계속해서 부드럽게 탐색하여 시신경두 이외의 연결 지점을 분리합니다.
  10. 망막을 시신경두에 고정한 상태에서 조직을 계속 고정시키고 두 번째 집게를 사용하여 시신경두 아래의 안구컵을 뭉칩니다.
    1. 망막과 잔여 섬모체 사이의 각도에 과도한 유리체로 인해 망막 주변부가 접힌 위치에 끼어 있지 않은지 확인합니다. 필요한 경우 전사 피펫을 사용하여 챔버를 PBS로 세척하여 추가 이물질을 제거하고 브러시를 사용하여 조직을 과도하게 잡아당기지 않도록 주의하면서 조직을 부드럽게 펴고 과도한 유리체를 제거합니다.
  11. 망막이 양쪽에서 노출된 상태에서 스프링 가위를 사용하여 약 90° 간격으로 주변에서 시신경두를 향해 직선으로 뻗어 중심에서 약 1mm 떨어진 곳에서 멈추는 일련의 완화 절단을 만듭니다. 이것은 망막에서 망막 신경절 세포 축삭의 절단을 최소화하여 배양된 외식의 품질을 향상시킵니다.
  12. 물에 잠긴 티슈를 제자리에 고정한 상태에서 접시에서 제거하기 전에 집게를 사용하여 실험실용 물티슈를 부드럽게 제거하여 티슈에서 옆으로 당겨냅니다. 와이프에 대한 접착 및 샘플 손실 가능성을 방지하기 위해 망막과의 접촉을 피하십시오.
  13. 그런 다음 조직을 계속 잡고 스프링 가위를 사용하여 망막 바로 아래의 시신경을 절단한 다음 접시에서 나머지 아이컵을 제거합니다.
  14. 망막이 눈의 나머지 부분과 분리되면 35mm 페트리 접시에 PBS를 채우고 집게를 사용하여 거친 무광택 면이 위를 향하도록 아래쪽에 필터 사각형을 놓습니다. 필터가 구겨지지 않도록 주의하면 필터를 망막을 이동시키는 기질로 사용하는 데 방해가 될 수 있습니다.
  15. 전사 피펫으로 망막을 부드럽게 흡인하고 조심스럽게 35mm 접시에 옮깁니다. 브러시로 망막을 움직여 망막의 내부 표면이 똑바로 세워지고 조직이 필터 사각형 바로 위에 놓이도록 합니다.
  16. 전사 피펫으로 접시에서 PBS를 천천히 흡입하여 망막을 필터 위로 내립니다. 망막이 필터에 안착할 때까지 계속하기 전에 필요한 경우 조직을 재조정하기 위해 일시 중지하십시오.
    참고: 급흡인은 망막의 갑작스러운 측면 움직임을 유발하여 손상이나 조직 손실을 초래할 수 있습니다. 망막 전체는 손상을 방지하기 위해 사각형에 놓여 있어야 합니다. 그러나 망막이 문제가 있는 위치에 정착하면 망막이 다시 부유할 때까지 PBS를 접시에 다시 추가할 수 있으며 장착을 다시 시도할 수 있습니다.
  17. 망막이 필터에 안착되면 브러시를 사용하여 접혔을 수 있는 주변 망막을 펼칩니다. 망막이 필터에서 쉽게 움직이지 않도록 PBS 수준의 균형을 조심스럽게 맞추는 동시에 샘플이 건조되지 않고 브러시가 내부 망막을 손상시키지 않고 부드럽게 움직일 수 있도록 충분히 남아 있는지 확인합니다.
  18. 다시 한 번 망막에 이물질이 있는지 검사합니다. 손상을 방지하려면 전사 피펫을 사용하여 조직 위 약 1cm에서 망막에 PBS를 떨어뜨려 직접 다루지 않고 망막을 청소합니다. 이렇게 하면 남아 있는 찌꺼기가 씻겨 나가야 하지만 접시에 PBS를 너무 많이 넣으면 망막이 다시 떠오를 수 있습니다. 이 경우 흡인을 다시 수행하여 조직을 다시 장착하십시오.
    참고: '가짜' 샘플은 다른 곳에서 설명한 대로 고정, 차단/투과화 및 항체 염색을 위해 망막을 24웰 플레이트로 전달하여 생성할 수 있습니다21. 이러한 가짜 컨트롤은 격리 중에 발생할 수 있는 망막의 기계적 손상 문제를 해결하는 데 유용합니다.

3. 배양 배지로 이전 및 유지

  1. 35mm 접시의 뚜껑을 닫고 생물 안전 캐비닛으로 운반하고 접시 높이를 유지하여 필터에서 망막이 빠지지 않도록 합니다. 이 경우 위와 같이 다시 마운트합니다.
  2. 망막이 들어 있는 닫힌 35mm 접시를 생물 안전 캐비닛에 넣고 장갑을 소독하거나 교체하기 전에 캐비닛 내부의 장비나 표면을 만지지 않도록 주의하십시오.
  3. 장갑의 오염을 에탄올로 제거하거나 교체한 다음 explant media가 미리 로드된 6-well 플레이트를 incubator에서 biosafety cabinet으로 옮깁니다. 3.4 단계에서 배치 된 도구를 사용하여 생물 안전 캐비닛 내에서 3.5 및 1.1 단계를 수행하십시오.
  4. 망막이 들어 있는 35mm 접시의 뚜껑을 제거하고 각진 집게를 사용하여 망막에 직접 닿지 않도록 필터 사각형을 조심스럽게 들어 올립니다. 6웰 플레이트의 뚜껑을 제거하고 필터를 적절한 웰 인서트 중앙에 놓은 다음 매체로 천천히 내립니다. 이 단계에서 망막은 필터에서 분리되어 공기-액체 계면 바로 아래에 떠 있습니다.
  5. 망막과 필터가 분리되면 필터를 망막에서 천천히 멀리 옮기고 매체에서 제거합니다. 1mL 피펫을 사용하여 인서트에서 500μL의 매체를 제거하고 인서트 바닥과 공기-액체 계면 사이에 망막을 가두어 망막이 평평하게 놓이도록 합니다.
  6. 플레이트의 뚜껑을 교체하고 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO2로 다시 넣고 망막이 우물 중앙 근처에 유지되도록주의하십시오. 하나의 플레이트에 최대 6개의 망막을 보관할 수 있습니다.
    참고: 외식식물을 24시간 이하로 보관하는 경우 실험이 끝날 때까지 인큐베이터에 그대로 둘 수 있습니다. 장기간 보관하는 경우, 시험관 1 일 후와 그 이후에는 격일로 배지를 50% 교체하는 것이 좋습니다.

4. 면역 염색을 위한 정착 (선택)

  1. 면역염색을 수행하는 경우 고정을 위해 다음 단계를 참조하십시오. 면역염색은 편평한 장착형 망막21에 대해 이전에 자세히 설명된 매개변수를 사용하여 수행할 수 있지만, 이식된 망막을 고정하려면 특별한 고려 사항이 필요합니다.
  2. 6-웰 배양 플레이트에서 외식액 및 배지가 있는 세포 배양 삽입물을 제거하고 삽입물이 약간 다공성이고 소량의 고정액이 이 기본 표면으로 통과하므로 고정 후 적절하게 폐기할 수 있는 비다공성 표면(예: 배양 플레이트의 플라스틱 뚜껑)에 놓습니다.
  3. 인서트에서 배양 배지를 부드럽게 제거한 다음 각각에 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL를 추가합니다. 흄 후드에서 망막을 15분 동안 고정시킨 다음 PFA를 제거하고 기관 정책에 따라 폐기합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 위험하며 알려진 발암 물질인 포름알데히드의 전구체입니다. 주의를 기울이고 적절한 예방 조치와 함께 흄 후드에 고정을 수행하십시오.
  4. PBS로 망막을 3회(각 5분간) 세척하여 PFA를 제거한 다음, 변형된 전달 피펫을 사용하여 PBS의 망막을 24웰 플레이트의 개별 웰로 전달하여 차단, 투과화 및 면역 염색을 위해21번 설명합니다. PFA에 오염된 플라스틱(피펫 팁, 인서트 및 고정 중에 사용되는 비다공성 표면)을 기관 정책에 따라 폐기합니다.
    알림: 이송 피펫은 고정 및 염색된 망막을 장착 및 이미징을 위해 슬라이드로 옮기도록 유지할 수 있습니다. PFA와 직접 접촉해서는 안 되지만 살아있는 조직과 고정된 조직을 취급하기 위해 다른 이송 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.

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결과

거시적 규모에서 외출된 망막은 1일과 3일 시점 모두에서 본질적으로 변하지 않은 상태로 유지되지만, 후자에서는 상대적으로 취약해지므로 고정 또는 다른 실험적 종점 전에 신중한 취급이 필요합니다. 망막은 접히지 않고 비교적 평평해야 하며(산소와 영양소의 확산에 국부적인 방해를 줄 수 있음), 공기-액체 계면과 세포 배양 삽입물 사이의 배지에 부유해야 합니다. 3일째가 되면 부유 조직 아래의 삽입물 바닥에 희미한 줄무늬가 형성될 수 있습니다. 명시야 위상차 현미경을 사용한 검사는 특히 24시간과 72시간 시점 사이에 퇴화 광수용체의 외부 분절일 가능성이 있는 세포 파편이 적당히 떨어져 있음을 시사합니다. 광수용체의 취약성과 망막 분리 중에 대부분 손실되는 RPE 기질에 대한 의존도를 감안할 때 이는 놀라운 일이 아닙니다. 그러나 매체 자체가 흐린 것처럼 보이면 미생물 오염 가능성을 조사해야 합니다. 초기 분리 과정에서 생물 안전 캐비닛 외부에서 망막을 취급했음에도 불구하고 샘플에서 미생물 오염을 검출할 수 없었으며, 이는 멸균 완충...

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토론

망막 이식과 같은 유기형 배양32 접근법은 세포 배양의 실험적 유연성과 빠른 처리 시간을 활용하면서 생체 내 연구의 현장 맥락을 대부분 보존하여 세포 유형 간의 복잡한 상호 작용을 조사하기 위한 강력한 방법을 제공합니다. 우리는 이 프로토콜을 눈에 대한 상당한 경험이 있고 고정된 망막을 조작하는 데 익숙하지만 새로운 망막은 아닌 연구자를 위한 진입점으로 제시합니다. 따라서 우리는 분리 및 취급과 관련된 기술적 문제와 변동을 줄이는 데 중점을 두었으며, 이는 우리의 경험에 비추어 볼 때 일관된 시료를 안정적으로 생성하는 데 주요 장벽으로 작용했습니다. 그러나 눈은 기능만큼이나 물질적 특성이 거의 다른 구조와 조직으로 구성된 복잡한 기관이며, 쥐 눈의 컴팩트한 특성으로 인해 손상 없이 망막을 추출하는 것이 더욱 어렵습니다. 따라서 격리 중 망막에 대한 과도한 구조적 또는 대사적 손상을 피하고 고품질...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

M.A.M.은 NIH/NEI R01EY035312, Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award, Melza M. and Frank Theodore Barr Foundation, Robert M. Sinskey, MD, Foundation, Ruettgers Family Charitable Foundation 및 B.L. Manger Foundation의 지원을 받았습니다. P.F.C.는 NIH/NEI 2T32EY007145의 지원을 받았습니다. 이 작업은 시력 연구 P30 EY003176을 위한 NIH Core Grant에 의해서도 가능했습니다.  그림 1은 Biorender로 생성되었습니다. 저자는 원고에 대한 피드백을 주신 Nasir Uddin 박사와 도움과 지원을 주신 Qiurong Zhu 박사에게 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#11 메스 블레이드Bard-Parker3,71,311
1 mL 피펫('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm 페트리 접시Falcon351029
16% 파라포름알데히드Ted Pella Inc18,505고정을 위해 4%로 희석
24 웰 플레이트Falcon353047고정, 차단 및 항체 배양
35mm 페트리 접시Falcon351008
6웰 플레이트 및 삽입 키트Greiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-1521:800 희석
Alexa Fluor 594 당나귀 항쥐 IgG (H + L) 고교차 흡착InvitrogenA-212091 : 800 희석
Alexa Fluor 594-F (ab')2 당나귀 항마우스 IgG (H + L) 잭슨 면역 연구 연구소, Inc. 715-586-1501:800 희석
Alexa Fluor 647-당나귀 항기니피그 IgG(H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 희석
Alexa Fluor 647-F(ab')2 당나귀 안티 치킨 IgY(IgG)(H+L) 잭슨 면역 연구 연구소, Inc. 703-606-1551:800 희석
진 겸자('5/45')FST / Dumont11251-35
Anti-Brn3a 항체(마우스)ChemiconMAB15851:200 희석
항-CD206 항체(쥐)BioradMCA22351:200 희석
항-GFAP 항체(닭고기)Abcamab46741:1000 희석
항-Iba1 항체 (토끼)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-197411:500 희석
항-Tmem119 항체 (기니피그)Synaptic Systems400 0041:500 희석
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
무딘 곡선 집게('Extra Fine Graefe)FST11152-10
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA9647차단 및 항체 배양에 1% w/v 사용
필터 키트(0.2 & micro; m aPES 멤브레인, 150mL 병탑 필터) 피셔 사이언티픽FB12566508
파인 브러쉬, 사이즈 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (써모피셔)35050061
실험실 물티슈 (Kim 물티슈) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A 배지, 페놀 레드Gibco (Thermofisher)12349015
일반 당나귀 혈청Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121차단 및 항체 배양을 위해 10%에서 사용
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermofisher)15140122
피펫 팁, 1000 및 마이크로; LTipOne1126-7810
스프링 가위 ('Cohan-Vannas')FST15000-11
멸균수 ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
멸균 여과 PBSGibco10010-023
스트레이트 겸자 ('미니')FST / Dumont11200-14
이송 피펫, 5.8 mL피셔사이언티픽13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. AP차단 및 항체 배양을 위해 0.5%에서 사용
각 빼기

참고문헌

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

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