여기에서는 확장된 생체 외 실험을 위해 쥐의 눈에서 망막을 분리하는 자세한 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜은 살아있는 조직에서 망막 신경교세포를 제자리 로 유지함으로써 제공되는 연구 방법을 활용하고자 하는 연구자가 기술적으로 까다로운 접근 방식에 접근할 수 있도록 하는 것을 강조합니다.
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방법 논문
마우스 망막의 신경교세포(glial interactions)를 연구하기 위한 생체 외 이식 모델(Ex vivo Explant Model for Study Glial Interactions in the Mouse Retina)
이 논문에서
요약
초록
녹내장에서 신경교세포의 역할은 점점 더 두드러지는 연구 주제이지만, 이러한 지원 세포, 즉 성상교세포와 미세아교세포의 집단이 망막 신경절 세포의 생존에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 아직 많이 알려져 있지 않습니다. in vivo 및 in vitro 모델은 어느 정도의 통찰력을 제공하지만, 두 접근 방식 모두 전자의 경우 말초 면역 반응의 영향과 후자의 경우 세포 분리 및 배양에 의해 유도된 생리학적 기능의 변화와 같은 상당한 제한이 있습니다. 이러한 교란 요인을 최소화하기 위해 당사는 성상세포, 미세아교세포 및 기타 망막 세포 유형을 최소 3일 동안 현장에서 유지할 수 있는 생체 외 망막 이식 시스템을 개발하여 in vivo 모델에서 일반적으로 실현 가능한 것보다 더 높은 처리량으로 표적 연구를 가능하게 합니다. 결정적으로, 이 접근법은 살아있는 동물에서는 까다롭거나 실현 불가능할 수 있는 방법론에 매우 적합하지만 온전한 신경 조직에 대한 일반적인 다운스트림 분석과 호환됩니다. 여기에서는 생체 외 망막에서 신경교세포와 망막 신경절 세포가 겪는 변화를 기록한 면역형광 현미경 검사의 대표적인 결과와 함께 온전한 망막 외식식물의 분리 및 배양에 적합한 프로토콜을 제시합니다.
서론
눈 뒤쪽에 위치한 중추신경계(CNS)의 연장선인 감광성 망막은 시력에 필수적이지만 급성 부상과 만성 질환에 취약합니다. 다른 중추신경계 영역과 마찬가지로, 성인 망막의 뉴런은 소실되어도 대체되지 않으며, 시각 정보를 응집하여 뇌로 전달하는 망막 신경절 세포(RGC)는 녹내장의 기능 장애와 사망에 특히 취약하여 돌이킬 수 없는 시력 상실을 초래합니다 1,2. 녹내장은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이지만3, 녹내장을 앓고 있는 개인에게 미치는 파괴적인 영향과 사회에 대한 전반적인 비용에도 불구하고 질병의 초기 단계가 망막 신경절 손실에 어떻게 기여하는지에 대해서는 많은 것이 알려지지 않았습니다4. 신경교세포(glia)의 역할은 녹내장 병태생리학에서 연구하는 주요 분야인데, 이러한 비신경세포 지원 세포는 망막 신경절 세포의 생존에 필수적이지만5 유익한 행동6을 감소시키거나 심지어 해로운 표현형7의 채택을 촉진할 수 있는 ....
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프로토콜
동물과 관련된 모든 절차는 Schepens Eye Research Institute의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜 # 2022N000030, 2025년 3월 4일 승인). 동물은 시력 및 안과 연구 협회(ARVO)의 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 성명서에 따라 취급되었습니다.
참고: 그림 1 은 적출된 쥐의 눈에서 살아있는 망막을 분리하는 주요 단계를 보여줍니다.
그림 1: 적출된 쥐의 눈에서 살아있는 망막을 분리하는 주요 단계를 다이어그램으로 표현 한 것입니다. 주요 단계의 해당 단계 번호는 원으로 제공됩니다.
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결과
거시적 규모에서 외출된 망막은 1일과 3일 시점 모두에서 본질적으로 변하지 않은 상태로 유지되지만, 후자에서는 상대적으로 취약해지므로 고정 또는 다른 실험적 종점 전에 신중한 취급이 필요합니다. 망막은 접히지 않고 비교적 평평해야 하며(산소와 영양소의 확산에 국부적인 방해를 줄 수 있음), 공기-액체 계면과 세포 배양 삽입물 사이의 배지에 부유해야 합니다. 3일째가 되면 부유 조직 아래의 삽입물 바닥에 희미한 줄무늬가 형성될 수 있습니다. 명시야 위상차 현미경을 사용한 검사는 특히 24시간과 72시간 시점 사이에 퇴화 광수용체의 외부 분절일 가능성이 있는 세포 파편이 적당히 떨어져 있음을 시사합니다. 광수용체의 취약성과 망막 분리 중에 대부분 손실되는 RPE 기질에 대한 의존도를 감안할 때 이는 놀라운 일이 아닙니다. 그러나 매체 자체가 흐린 것처럼 보이면 미생물 오염 가능성을 조사해야 합니다. 초기 분리 과정에서 생물 안전 캐비닛 외부에서 망막을 취급했음에도 불구하고 샘플에서 미생물 오염을 검출할 수 없었으며, 이는 멸균 완충.......
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토론
망막 이식과 같은 유기형 배양32 접근법은 세포 배양의 실험적 유연성과 빠른 처리 시간을 활용하면서 생체 내 연구의 현장 맥락을 대부분 보존하여 세포 유형 간의 복잡한 상호 작용을 조사하기 위한 강력한 방법을 제공합니다. 우리는 이 프로토콜을 눈에 대한 상당한 경험이 있고 고정된 망막을 조작하는 데 익숙하지만 새로운 망막은 아닌 연구자를 위한 진입점으로 제시합니다. 따라서 우리는 분리 및 취급과 관련된 기술적 문제와 변동을 줄이는 데 중점을 두었으며, 이는 우리의 경험에 비추어 볼 때 일관된 시료를 안정적으로 생성하는 데 주요 장벽으로 작용했습니다. 그러나 눈은 기능만큼이나 물질적 특성이 거의 다른 구조와 조직으로 구성된 복잡한 기관이며, 쥐 눈의 컴팩트한 특성으로 인해 손상 없이 망막을 추출하는 것이 더욱 어렵습니다. 따라서 격리 중 망막에 대한 과도한 구조적 또는 대사적 손상을 피하고 고품질.......
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
M.A.M.은 NIH/NEI R01EY035312, Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award, Melza M. and Frank Theodore Barr Foundation, Robert M. Sinskey, MD, Foundation, Ruettgers Family Charitable Foundation 및 B.L. Manger Foundation의 지원을 받았습니다. P.F.C.는 NIH/NEI 2T32EY007145의 지원을 받았습니다. 이 작업은 시력 연구 P30 EY003176을 위한 NIH Core Grant에 의해서도 가능했습니다. 그림 1은 Biorender로 생성되었습니다. 저자는 원고에 대한 피드백을 주신 Nasir Uddin 박사와 도움과 지원을 주신 Qiurong Zhu 박사에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #11 메스 블레이드 | Bard-Parker | 3,71,311 | |
| 1 mL 피펫('Pipetman P1000') | Gilson | F144059M | |
| 100 mm 페트리 접시 | Falcon | 351029 | |
| 16% 파라포름알데히드 | Ted Pella Inc | 18,505 | 고정을 위해 4%로 희석 |
| 24 웰 플레이트 | Falcon | 353047 | 고정, 차단 및 항체 배양 |
| 35mm 페트리 접시 | Falcon | 351008 | |
| 6웰 플레이트 및 삽입 키트 | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-545-152 | 1:800 희석 |
| Alexa Fluor 594 당나귀 항쥐 IgG (H + L) 고교차 흡착 | Invitrogen | A-21209 | 1 : 800 희석 |
| Alexa Fluor 594-F (ab')2 당나귀 항마우스 IgG (H + L) | 잭슨 면역 연구 연구소, Inc. | 715-586-150 | 1:800 희석 |
| Alexa Fluor 647-당나귀 항기니피그 IgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | 1:800 희석 |
| Alexa Fluor 647-F(ab')2 당나귀 안티 치킨 IgY(IgG)(H+L) | 잭슨 면역 연구 연구소, Inc. | 703-606-155 | 1:800 희석 |
| 진 겸자('5/45') | FST / Dumont | 11251-35 | |
| Anti-Brn3a 항체(마우스) | Chemicon | MAB1585 | 1:200 희석 |
| 항-CD206 항체(쥐) | Biorad | MCA2235 | 1:200 희석 |
| 항-GFAP 항체(닭고기) | Abcam | ab4674 | 1:1000 희석 |
| 항-Iba1 항체 (토끼) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | 1:500 희석 |
| 항-Tmem119 항체 (기니피그) | Synaptic Systems | 400 004 | 1:500 희석 |
| B-27, 50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| 무딘 곡선 집게('Extra Fine Graefe)FST | 11152-10 | ||
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A9647 | 차단 및 항체 배양에 1% w/v 사용 |
| 필터 키트(0.2 & micro; m aPES 멤브레인, 150mL 병탑 필터) | 피셔 사이언티픽 | FB12566508 | |
| 파인 브러쉬, 사이즈 3/0 | Princeton Art & Brush Co. | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (써모피셔) | 35050061 | |
| 실험실 물티슈 (Kim 물티슈) | KIMTECH | 34155 | |
| N-2, 100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobasal-A 배지, 페놀 레드 | Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| 일반 당나귀 혈청 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 017-000-121 | 차단 및 항체 배양을 위해 10%에서 사용 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermofisher) | 15140122 | |
| 피펫 팁, 1000 및 마이크로; L | TipOne | 1126-7810 | |
| 스프링 가위 ('Cohan-Vannas') | FST | 15000-11 | |
| 멸균수 ('Dnase, Rnase free') | Invitrogen | 10977-015 | |
| 멸균 여과 PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 스트레이트 겸자 ('미니') | FST / Dumont | 11200-14 | |
| 이송 피펫, 5.8 mL | 피셔사이언티픽 | 13-711-9AMMD | |
| Triton X-100 | Thermo Scientific Chemicals | A16046. AP | 차단 및 항체 배양을 위해 0.5%에서 사용 |
참고문헌
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M.
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재인쇄 및 허가
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