장기간의 일측성 요관 폐색의 역전 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 평가하기 위한 마우스 모델

Summary

이 논문은 연구자가 장기간의 요관 폐쇄 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 분석할 수 있는 표준화된 모델을 사용하여 마우스에서 가역적 편측 요관 폐쇄를 수행할 수 있도록 하는 자세한 지침을 제공합니다.

Abstract

요로 폐쇄(UTO) 환자의 임상적 관리는 폐색의 원인을 되돌리기 위한 조기 개입이 필요하지만, 그럼에도 불구하고 UTO가 장기화된 환자는 만성 신장 질환(CKD) 및 재발성 급성 신장 손상(AKI)의 위험이 증가합니다. 그러나 폐색의 조기 회복과 CKD 진행을 지연시키기 위한 일반 요법을 제외하고는 UTO의 역전 후 장기적인 신장 결과를 크게 개선한 치료법은 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 많은 실험실에서 가역적 UUO(R-UUO) 모델을 개발했지만 기술적으로 까다롭고 널리 채택되지 않았습니다. 또한 R-UUO의 마우스 모델은 질병 병태생리학을 연구하기 위해 마우스 유전학의 힘을 활용하는 데 사용할 수 있다는 점에서 매력적이지만, 방해가 >3일 동안 지속되면 종종 사용 방법이 비가역적인 UUO로 이어지기 때문에 특히 어려웠습니다. 또한, 이러한 모델의 특성으로 인해, 요관 폐색의 역전의 장기적 기능적 결과를 평가한 연구는 거의 없었다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 최근 지연된 반대쪽 신절제술을 통한 R-UUO의 마우스 모델을 개발하여 장기간의 UTO를 역전시키는 것이 장기적인 신장 구조 및 기능 결과에 미치는 장기적인 효과를 분석할 수 있습니다. 이러한 연구는 재건 후 3개월 후 거의 완전한 조직학적 회복에도 불구하고 신장 기능의 영구적인 감소와 소변 농축 능력의 현저하고 지속적인 결함이 있음을 보여주며, 이는 신장 수질 기능의 결함을 나타냅니다. 이 모델은 세 번의 주요 생존 수술을 필요로 하지만 폐쇄 기간을 조정하여 다른 마우스 균주에서 재현할 수 있는 강력하고 재현 가능한 장기적 신장 기능 감소를 초래합니다. 이 기사에서는 이러한 수술을 수행하고, 다양한 마우스 균주에 사용하기 위한 조건을 최적화하고, 신장 기능 결과를 평가하고, 신장 조직을 채취하기 위한 자세한 지침을 제공합니다.

Introduction

요로 폐쇄(UTO)는 편측성일 수 있으며, 종종 무증상이거나, 만성 폐쇄성 요로^병증(chronic obstructive uropathy)1을 동반하거나, 신장 산통 및/또는 혈뇨를 동반하는 급성으로 나타날 수 있다. 급성 신우신염 또는 신장 후 급성 신장 손상(AKI)². UTO 관리의 핵심은 장애물²를 조기에 제거하는 것입니다. 그러나 만성 신장 질환(CKD)의 진행을 지연시키기 위한 효과적인 역전과 제네릭 요법의 사용에도 불구하고 영향을 받은 환자는 여전히 진행성 CKD 및 고혈압의 위험이 증가하고 있습니다 ^3,4. 또한, 장기 요농축량(UCC)이 손상되는 경우가 많으며,⁵ 이는 탈수 및 재발성 AKI에 취약한 환자를 유발할 수 있으며, 이로 인해 UTO 후 신장 기능의 점진적인 저하를 가속화할 수 있다.

부분적으로, UTO 환자의 장기 결과를 개선하기 위한 치료적 접근법을 식별하지 못한 것은 UTO의 병리생물학을 탐구하기 위해 비가역적 편측 요관 폐쇄(UUO) 모델의 사용에 의존한 결과입니다. 그러나 이러한 모델은 환자가 진단 직후 역전을 겪는 임상 상황을 재현하지 못하며, 폐색이 역전된 후 장기적인 회복을 개선하는 데 사용할 수 있는 메커니즘 및 치료 접근법을 탐색하는 데 사용할 수 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 R-UUO(Reversible UUO) 모델이 개발되었지만, 이러한 모델은 비가역적 UUO 모델보다 기술적으로 더 까다롭고, 다른 실험실에서 재현하기가 더 어려우며, 그 결과 과학계에서 널리 채택되지 않았습니다. 마우스 모델은 질병 병태생리학을 연구하기 위해 마우스 유전학의 힘을 활용하는 데 사용할 수 있다는 점에서 매력적이지만, 방해가 3일 이상 지속되면 종종 비가역적 UUO로 이어지기 때문에 최적화하기가 특히 어려웠습니다⁶. 이 문제를 해결하기 위해 여러 수술, 2일마다 요관을 따라 클램프를 순차적으로 배치하는 등 다양한 접근법이 배포되었습니다 ^6,7; UUO 후 방광 재이식 ^8,9,10,11; 그리고 손상되지 않는 cl을 사용하십시오.amp요관 12,13,14를 막기 위해 s와 튜브. 쥐와 생쥐를 대상으로 한 장기 결과 연구에서 폐색이 끝난 후 신장 기능이 개선되고 섬유화가 감소하거나 사구체 손상이 감소하는 것으로 나타났지만, UUO가 2일 이상 지속되면 부분적으로만 회복됨 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 . 또한, 신장 수질(RM)은 최근까지 UTO^20,21에 의한 손상에 특히 취약하지만, R-UUO가 RM 구조 및 기능에 미치는 장기간의 영향을 연구한 장기적인 설치류 연구는 없었습니다. 이는 UCC와 혈압을 증가시키지 않고 염분 부하를 배설하는 능력(소위 압력 나트륨 이료 반응)이 RM ^22,23,24의 해부학적 무결성 유지에 의존하기 때문에 중요하며, 따라서 UTO의 역전 후 RM의 불완전한 복구는 환자가 UTO 역전 후 재발성 AKI와 고혈압에 대한 감수성이 증가한 이유를 설명할 수 있습니다. 그러나 이를 평가하는 데 필요한 많은 기법은 여러 차례의 수술(6일 동안 5번의 주요 수술 ^6,7)을 필요로 하고, 가르치기 어려운 외과적 전문 지식(예: 방광에 요관을 재삽입하는 수술 ^8,9,10,11), 폐쇄는 일방적이기 때문에 조사관이 폐쇄를 역전시킨 후 신장 기능의 변화를 평가하기 어렵게 만듭니다.

이 문제를 해결하기 위해, 본 연구는 수행 및 교육이 비교적 간단하고, 다른 기법에 비해 수술 횟수가 제한되며(5-7일 동안 2회 수술), 침습적 및/또는 비용이 많이 드는 분할 신장 기능 연구 없이 신장 기능 회복을 분석할 수 있는 R-UUO의 마우스 모델을 개발했다²⁵. 이를 위해 생쥐는 세 가지 주요 수술을 받습니다: 1) 근위 좌측 요관에 비외상성 혈관 클램프를 배치하는 것; 2) 마우스 변형에 따라 5-7일 후에 혈관 클램프 제거; 3) 신장 기능을 평가하기 위해 10일 후 반대쪽 신장을 제거합니다. 약 20-40%의 쥐가 신장 절제술 후 2-3일 이내에 사망하는데, 이는 모든 쥐에서 UUO가 역전되지 않는다는 것을 나타냅니다. 생존한 마우스에 대한 장기 추적 조사는 R-UUO 후 3개월 후에 신장 수질(RM)의 거의 완전한 조직학적 회복에도 불구하고 이를 보여줍니다. 경피 사구체 여과율(tGFR)로 측정되는 신장 기능이 감소합니다²⁶. 또한, 수분 제한 후 요삼투압을 측정하여 결정된 UCC의 현저한 감소는 RM 기능에 영구적인 결함이 있음을 시사합니다. 시간 경과 연구에 따르면 RUUO 후 28일에서 56일 사이에 tGFR이 개선되었지만 56일에서 84일 사이에 안정화됩니다. 대조적으로, R-UUO²⁵일 이후 28일과 84일 사이에는 UCC가 개선되지 않았습니다. 세포 계통 및 면역조직화학 연구로 검증된 분리된 RM의 scRNA-Seq를 사용하여 R-UUO 후 RM 치수를 회복하는 강력한 재생 반응을 확인했지만 RM의 모든 주요 세포 구획은 R-UUO 후 기능 회복에 영향을 미칠 수 있는 세포 수와 유전자 서명의 영구적인 변화를 보였습니다. 여기에는 R-UUO 후 84일 후 Henle 세포 집단의 RM 수집 덕트 및 루프에서 지속적인 전염증 반응이 포함되었으며, 이는 AKI 및 UUO ^27,28,29,30 후 복구 근접 세뇨관 상피 세포의 실패한 염증 및 노화 신호와 유사합니다. 재발성 신결석 질환 환자의 관을 채취하는 RM에서도 유사한 변화가 관찰되었는데³¹, 이는 인간과 생쥐 모두에서 RM 손상에 대한 공통적인 손상 반응이 있음을 시사한다. 이 기사에서는 이러한 수술을 수행하는 방법, 다양한 마우스 균주에서 사용하기 위해 조건을 최적화하는 방법, 재건 후에도 요관이 여전히 막혀 있는지 여부를 확인하는 방법, 주요 기능 결과를 평가하는 방법, 신장 조직을 적출하여 신장 수질 구조를 평가하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

Protocol

여기에서는 장기 연구에 사용되는 4단계 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1). 이 원고의 끝에서 논의한 바와 같이, 연구자는 이 중 3개(섹션 1, 2, 4)만 수행하거나 장기 결과 연구에 관심이 있는 경우 4개 모두를 수행할 수 있습니다. 이 원고에 있는 모든 쥐 실험은 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 동물 사용 지침을 준수합니다.

1. 요관 클램프 배치(10 - 15분/마우스)

알림: 주변의 결합 조직 없이는 요관을 직접 볼 수 없으므로 요관을 찾기 위해 마우스 신장 해부학에 대한 지식에 의존하십시오. 요관은 신장이 노출됨에 따라 문턱 조직의 아래쪽 뒤쪽을 따라 흐릅니다(그림 2). 혈관 클램프의 선택은 중요합니다. 이들은 비용이 많이 들 수 있지만 여러 번 청소, 오토클레이브 및 재사용할 수 있습니다. 이 클램프는 문제 없이 최소 100번 이상 재사용할 수 있습니다.

1. 수술 전에 모든 수술 기구를 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 여러 생쥐에 대한 수술을 수행하는 경우 사용 사이에 기구에서 혈액과 부스러기를 제거하고 핫 비드 살균기를 사용하여 10-15초 동안 살균하십시오. 다시 사용하기 전에 기구를 식히십시오.
2. 마우스의 무게를 잰다.
3. 복강내 주사로 90-120mg/kg 케타민과 함께 5-10mg/kg 자일라진을 사용하여 마우스를 마취합니다( 재료 표 참조). 일반적으로 적용되는 데 3-5분 정도 걸립니다.
4. 이소플루란(isoflurane)과 같은 다른 마취제를 사용하는 경우 자일라진(Xylazine)과 달리 진통 효과가 없으므로 수술 전 진통제를 투여하십시오.
5. 엉덩이에서 흉곽까지, 그리고 옆구리까지 수술 부위를 면도하되, 털이 절개 부위를 오염시키지 않도록 충분한 테두리를 두세요. 수술이 수행되는 장소가 아닌 준비 구역에서 수행합니다.
6. 가열된 수술 부위를 멸균 수술 드레이프로 덮으십시오. 흩어진 털이 수술 부위에 유입되는 것을 방지하고 멸균 기구를 놓을 수 있는 공간을 제공하는 데 도움이 됩니다.
7. 안과 윤활 연고를 눈에 바릅니다.
8. 베타딘에 적신 거즈를 사용하여 무균 준비제를 바르십시오: 부위 중앙에서 주변부로 3-4회 문지른 다음 매번 알코올 면봉으로 한 번 닦습니다. 절개 전에 수술 부위에서 모든 베타딘을 제거합니다.
9. 가위와 집게를 사용하여 피부와 피하층을 통해 정중선에 1.5cm 길이의 등쪽 절개를 만듭니다.
10. 신장 위쪽의 왼쪽 옆구리와 근막을 작게 절개하여 왼쪽 신장을 바깥쪽으로 만듭니다.
11. 요관이 있어야 할 곳 주변의 하부 극 지방과 일부 결합 조직을 조심스럽게 절개합니다. 주변 결합 조직 없이는 요관을 직접 볼 수 없습니다. 그런 다음 신장 정맥과 동맥을 포함하는 신척추경에서 주변 결합 조직과 요관을 분리하여 신장 척추경이 요관 클램프에 포함되지 않도록 합니다(그림 2).
12. 클램프 애플라이어를 사용하여 열고 골반 바로 아래의 요관에 놓습니다. 혈관 클램프의 표시를 사용하여 각 마우스에 대해 요관에 동일한 압력으로 배치되었는지 확인합니다(그림 3). 적용하지 말고 클램프를 제거하여 위치를 변경하면 요관이 손상될 수 있습니다.
13. 클램프가 배치되면 식염수에 적신 멸균 면봉을 사용하여 클램프가 있는 신장을 후복막 공간으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
14. 흡수성 봉합사를 사용하여 근육층을 닫습니다.
15. 스킨 클립을 사용하여 스킨 레이어를 닫습니다.
16. 약물 섹션에 설명된 대로 부프레노르핀 3.25mg/kg 진통제를 투여하고 멸균 생리 식염수 0.5mL를 피하로 투여하여 마우스에 수분을 공급합니다.
17. 가열된 하드 패드 수술장에 마우스를 그대로 두거나 마우스가 깨어날 때까지 케이지의 절반 아래에 따뜻한 등온 패드를 사용하여 가정용 케이지로 옮깁니다.
18. 쥐를 동물방으로 되돌려 보냅니다.
19. 마우스를 면밀히 모니터링하고 48-72시간 동안 통증이나 불편함에 대해 부프레노르핀을 추가로 투여합니다. 생쥐에게 추가 진통제가 필요함을 나타내는 통증 및 고통의 임상 징후에는 우울증 또는 기타 행동 변화, 비정상적인 외모 또는 필로렉션, 구부정한 자세, 그루밍 및 식사 부족 또는 부동성과 같은 자세가 포함됩니다.

2. 요관 클램프 제거(10 - 15분/마우스)

1. 원래 피부와 근육 절개를 사용하여 클램프 제거 단계를 사용하여 클램프 배치 절차 단계 1.1-1.10을 따릅니다. 수술 부위를 청소하기 전에 상처 클립을 제거하십시오. 털이 다시 자라지 않기 때문에 다시 면도할 필요는 없습니다.
2. 조직 유착이 발달했기 때문에 신장을 먼저 외부화하지 않고 집게를 사용하여 후복막 공간에서 클램프를 조심스럽게 배치하십시오. 클램프 애플라이어를 사용하여 클램프를 부드럽게 여는 동안 집게를 사용하여 클램프 주위에서 조직을 아래쪽으로 당깁니다.amp cl을 제거합니다.
3. 이제 신장 골반을 시각화하여 폐색 여부를 확인할 수 있도록 신장을 외부로 노출합니다. 신장 골반이 부어올라야 하는데, 이는 신증을 나타냅니다.
4. 신장을 검사한 후 식염수를 적신 멸균 면봉을 사용하여 신장을 후복막 공간으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
5. 위에서 설명한 대로 1.13-1.18단계를 수행합니다.

3. 반대쪽 신장 절제술 (10 - 15분/마우스)

1. 모발이 자라는 경우 해당 부위를 면도하십시오.
2. 마취를 위해 1-5% 이소플루란/공기 혼합물을 사용하여 이전에 마취 사건이 있었기 때문에 더 쉽게 회복할 수 있습니다. 수술 부위를 청소하기 전에 상처 클립을 제거하십시오.
3. 수술 전에 부프레노르핀 진통제를 투여합니다( 재료 표 참조).
4. 원래 피부 절개를 사용하여 절차 단계 1.1-1.9를 따라 시작합니다.
5. 오른쪽 옆구리, 신장 위의 근육과 근막을 작게 절개하고 오른쪽 신장을 바깥쪽으로 만듭니다.
6. 매끄럽고 구부러진 집게로 신장을 부드럽게 잡고 주변 조직에서 벗어나 신장의 상극과 하극을 조심스럽게 절개합니다.
   참고: 상극 주변의 조직에는 자체 혈액 공급을 운반하는 부신이 포함되어 있으며, 이 혈액은 신장에서 분리할 수 있지만 당연히 마우스에서 제거해서는 안 됩니다( 그림 2 참조).
7. 신장을 주변 조직으로부터 해방시킨 후, 이중 수술 매듭을 사용하여 신장 혈관과 요관 주위에 4-0 실크 봉합사를 완전히 묶습니다. ~30초 동안 방치하면 신장이 어두워집니다. 매끄럽고 구부러진 집게로 신장을 잡고 구부러진 가위로 매듭을 원위부로 잘라 신장을 제거합니다.
8. 식염수에 적신 멸균 면봉을 사용하여 남아 있는 신장 척추경을 후복막 공간으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
9. 위에서 설명한 대로 1.13-1.18단계를 수행합니다.

4. 조직 채취

1. 말기 절차 전에 안정적인 외과적 마취면을 달성하기 위해 5% 이소플루란/공기 혼합물로 마취합니다.
2. 복강을 열어 왼쪽 신장을 노출시킵니다.
3. 신장을 검사하여 신장 골반의 부종을 확인합니다(2.3단계 참조).
4. 신장 골반이 여전히 부어 있는 것 같으면 인산염 완충 식염수(PBS)에 메틸렌 블루의 1/5000 희석 0.5mL가 들어 있는 주사기에 연결된 작은 게이지 버터플라이 바늘을 삽입합니다. 요관이 특허인 경우, 파란색 용액은 신장 골반에서 방광으로 이동할 때 볼 수 있습니다. 그렇지 않으면 신장 골반이 파란색 용액으로 부풀어 오르고 방광에 나타나지 않습니다.
5. 관류로 신장을 고정하려면 흉강을 열고 심장을 노출시킵니다.
   1. 심장이 계속 박동하는 동안 23-25G의 나비 바늘을 좌심실에 삽입하고 생리식염수를 주입한 다음 우심방이나 심실을 절단하여 혈액량을 식염수로 대체하십시오.
   2. 약 1분 후 신장이 하얗게 변했는지 확인합니다. 1분 더 식염수 주입을 계속하거나 10-2분 동안 10% 포르말린 용액 주입으로 교체하여 조직을 고정합니다.
   3. 이 시점에서 마우스는 죽습니다. 조직을 수확하십시오. RNA 또는 단백질 연구를 위해 조직을 채취한 경우 관류로 고정하지 마십시오.
6. 동물에서 신장을 적출할 때(관류 고정 여부에 관계없이) 면도날을 사용하여 신장 중앙을 통해 2-3mm 두께의 시상 절편을 최대 3개까지 자릅니다(그림 4). 이는 신장 수질과 피질을 포함하는 대표적인 부분을 제공하고 조직학, 단백질 또는 RNA 분석을 위한 충분한 조직을 제공합니다.
7. 연구 요구 사항에 따라 샘플을 고정/동결하십시오.

Results

장기 연구의 경우, 일반적으로 의식이 있는 마우스에서 순차적 혈액 요소 질소(BUN) 및 경피 사구체 여과율(tGFR)을 측정하여 신장 기능을 평가하고(이²⁶을 설명하는 이전에 발표된 논문 참조), 18시간 수분 부족 후 채취한 현물 소변 샘플에서 소변 삼투압을 평가하여 요 농축 용량(UCC)을 측정합니다. 우리는 항상 BUN 연구를 수행하지만, 이는 신장 절제술 후 초기 시점에서 부상의 심각성을 평가하는 데 가장 유용합니다(논의 참조). 그러나 장기 연구의 경우, BUN(및 혈청 크레아티닌) 측정은 발생하는 신장 기능의 미묘한 변화를 감지할 만큼 충분히 민감하지 않습니다. 이는 일반적으로 신장 절제술 후 다른 시점에서 수행됩니다(그림 1A). UCC 분석은 신장 수질 기능에 대한 간단한 측정을 제공하며 일반적으로 같은 시점에서 신장 절제술 대조군 마우스보다 현저히 낮은 요삼투압 수치를 보여줍니다.

Discussion

마우스에서 연장된 UUO의 역전을 연구하는 데 사용된 일부 접근 방식과 비교하면 다음과 같습니다.^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}, 여기에 설명된 프로토콜은 비교적 간단하며 높은 수준의 사전 수술 전문 지식이 필요하지 않습니다. 이 검사는 비교적 적은 수의 생존 수술(최대 3회)을 포함하며 장기적인 기능적 결과를 평가하는 데 사...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% 염화나트륨	VUMC 약국	배수
흡수성 봉합사 Vicryl 6-0	Med Vet International- ETHICON	제이492G
알코올 면봉	BD 브랜드 이소프로필 알코올 면봉	BD 326895
베타딘 용액	한나 제약 공급 주식회사	67618015017
집게를 적용하는 클램프: S& 티 CAF-4	정밀 과학 도구	00071-14
델타페이즈 등온 패드	브레인트리 사이언티픽	DPIP
전기 트리머	오스터	배수
ENCORE 라텍스 질감 수술용 장갑	안셀	5785003
에티카 XR 부프로페노르(CIII) VI 1.3 mg/mL	패터슨 수의학 - 에티카	86084010030
EZ 클립 9mm	브레인트리 사이언티픽	EZC-CS	또는 7mm
EZ 클립 어플라이어 9mm	브레인트리 사이언티픽	EZC-APL	또는 7mm
EZ 클립 리무버 9mm	브레인트리 사이언티픽	EZC-RMV	또는 7mm
거즈 스펀지 2 & 급성; 2	피셔 사이언티픽	22-362178
Graefe 각진 또는 곡선 톱니 모양 팁	정밀 과학 도구	11049-10
Graefe 직선 톱니 모양 팁	정밀 과학 도구	11050-10
가열 하드 패드 15 및 급성; 24	브레인트리 사이언티픽	HHP 2
가열식 하드 패드 펌프 커넥터	브레인트리 사이언티픽	HHP Gaymar 커넥터
핫 비드 살균기	정밀 과학 도구	18000-45
인슐린 주사기 0.5mL 29g	엑셀 인터내셔널	26028
이소플루란	패터슨 수의학 - Pivetal	78949580
케타민 100 mg/mL	VUMC 약국
비 흡수 봉합사 실크 4-0	Med Vet International- ETHICON	683G
Olsen Hegar 바늘 홀더: 봉합사 절단기 포함	정밀 과학 도구	12002-12
옵틱스케어 아이 윤활유 20g	Med Vet International	포틱스케어
가위 - 무딘 렉서 - 아기	정밀 과학 도구	14078-10
가위 - 날카로운 곡선	정밀 과학 도구	14005-12
멸균 면 팁 어플리케이터	청교도	25806 2화장실
멸균 거즈 스펀지 4 & 급성; 4	피셔 사이언티픽	22-415-469
멸균 수술용 일회용 드레이프 18 및 급성; 26	Med Vet International	20001
살균 기구 파우치 5 및 급성; 10	피셔 사이언티픽	01-812-54
T/펌프 난방 냉각 펌프	브레인트리 사이언티픽	TP-700 시리즈
테일러 집게는 곡선, 매끄럽습니다.	정밀 과학 도구	11017-17
혈관 클램프: S& T 5-15g 프레스	정밀 과학 도구	00396-01
자일라진 100mg/mL	패터슨 수의학 - 크로노스	CR04305