Method Article

High-density Multielectrode Array Recordings of Retinal Waves Using An Electrophysiology Platform

DOI:

10.3791/68493

⸱

June 24th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고밀도 다전극 어레이(HD-MEA)는 신경 회로 발달에 중요한 역할을 하는 자발적 망막파를 연구하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 전기생리학 플랫폼에서 HD-MEA를 사용하여 마우스 망막 조직을 준비하고 전기생리학적 기록을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자발적인 망막파는 발달 중 망막 네트워크 활동의 특징으로, 축삭의 정제, 혈관 구조의 투과성 및 신경 회로의 전반적인 성숙에 영향을 미쳐 시각 시스템의 형성에 중요한 역할을 합니다. 이러한 파동은 일반적으로 다전극 어레이(MEA)를 사용하여 체 외 망막 제제에서 연구되며, 이를 통해 대규모 망막 신경절 세포(RGC) 활동 집단의 전기생리학적 기록이 가능합니다. MEA 기반 전기생리학은 고처리량 데이터를 빠르게 수집할 수 있는 사용 편의성으로 인해 강력한 도구가 되었으며, 따라서 다양한 실험 조건에서 망막 활동을 연구하는 데 이상적으로 적합합니다.

이 프로토콜에서는 전기생리학 플랫폼에서 고밀도 MEA(HD-MEA)를 사용하여 전기생리학적 데이터를 수집하기 위해 망막 조직을 준비하기 위한 중요한 단계를 간략하게 설명합니다. 이 과정은 생리학적 조건에서 신생아 동물로부터 온전한 망막을 조심스럽게 분리하는 것으로 시작됩니다. 준비가 완료되면 망막은 최소 1,000개의 망막 신경절 세포에서 동시에 세포 외 기록을 수행할 수 있는 26,400개의 전극 그리드로 구성된 HD-MEA 칩에 조심스럽게 장착됩니다. 녹음은 최대 몇 시간 동안 지속될 수 있습니다. 궁극적으로 이 방법론적 접근 방식은 망막 발달, 질병 및 잠재적으로 종간 비교 연구를 조사하는 데 유용한 응용 프로그램을 제공하여 신경 과학 및 시력 연구의 광범위한 발전에 기여합니다.

Introduction

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자발적인 망막파(Spontaneous retinal waves)는 시력이 시작되기 전에 발달 중인 망막에서 관찰되는 상관 활동의 주기적인 폭발입니다. 생쥐의 경우, 망막파를 시작하고 전파하는 회로는 발달 과정에서 빠르게 변화하며, 배아에서 시작하여 눈을 뜰 때(출생 후 14일째)1. 망막 회로가 발달함에 따라 망막파의 시공간 특성이 극적으로 변합니다 2,3. 여러 연구는 이러한 특정한 시공간 특성이 시각 시스템의 발달에 영향을 미친다는 것을 뒷받침한다: 눈 사이의 비동기식 활동은 눈 특이적 분리4를 지시하고, 파동 면적 크기는 양안뇌 영역5,6에서 망막 축삭돌기의 정제를 지시하며, 파동의 전파 방향은 상구(superior colliculus)3의 방향 선택성 회로를 지시하는 것과 관련이 있다. 신경 회로를 넘어서, 망막파는 혈액 혈관 구조의 투과성 발달을 담당합니다7....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 Maxwell Biosystems HD-MEA 플랫폼을 사용하여 망막파의 MEA 기록을 위해 신생아 마우스에서 망막 조직을 분리하고 준비하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 생리학적 상태를 보존하도록 설계되어 망막 조직이 구조적으로 손상되지 않고 손상되지 않으며 최적의 전극 접촉을 위해 적절하게 준비되도록 합니다. 이 실험은 밴더빌트 동물 보호 및 사용 프로그램(Vanderbilt Animal Care and Use Program)의 프로토콜 번호 M2200056-00에 따라 승인되었습니다. 생쥐 (1-2 주령, 남녀 모두)는 12 시간 주간 / 야간 주기 사육장에 수용되었으며 규칙적인 차우 식단을 먹였습니다.

1. 망막 조직의 준비

  1. 망막의 격리
    참고: 이 프로토콜에 사용되는 재료, 장비 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오( 그림 1 참조).
    1. 작업 영역 준비
      1. 인공 뇌척수액(aCSF)을 준비합니다: 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HD-MEA를 사용한 고처리량 기록 및 망막 파 분석
우리는 자발적인 망막파를 한 시간 동안 HD-MEA로 기록했습니다(그림 2). 뉴런 활동의 래스터 플롯은 망막파의 구조화된 패턴을 보여주며, 여기서 각 점은 개별 전극에서 감지된 활동 전위를 나타냅니다(그림 2A, 하단). 전극 간의 합 활성은 단일 트레이스를 생성하므로 1시간 기록에 대한 파동의 타이밍을 더 쉽게 시각화할 수 있습니다(그림 2A, 상단). 평균 뉴런 활동을 나타내는 히트맵은 망막의 넓은 영역에서 샘플링할 수 있음을 보여줍니다(그림 2B). 파동의 시공간 특성을 분석하기 위해 HD-MEA 기록 데이터를 분석하여 파동 시작 부위(

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 프로토콜은 망막 조직을 준비하고 HD-MEA 기록을 수행하기 위한 재현 가능한 고처리량 방법을 제공하여 망막 네트워크 활성을 연구할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. HD-MEA 기술은 특히 고처리량 데이터를 캡처하는 데 있어 기존의 전기생리학 및 이미징 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다. HD-MEA는 자발적 망막 파동 역학에 대한 밀리초 단위의 실시간 정확도 기록을 제공하여 정확한 파동 시작, 전파 및 동기화 특성화를 가능하게 합니다. 또한 HD-MEA는 수천 개의 망막 신경절 세포(RGC)를 동시에 기록하여 네트워크 활동을 볼 수 있도록 함으로써 패치 클램프 방법을 능가합니다. 이러한 확장성과 사용 편의성 및 장기 레코딩 안정성이 결합되어 HD-MEA는 개발 연구를 위한 매우 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 몇 가지 외삽법으로 쥐와 영장류 망막에 대한 MEA 기록에 맞게 조정할 수 있습니다. 마지막으로, HD-MEA 기록의 고처리량 특성은 높.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R00EY030909보조금 지원 A.T.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3mL 일회용 전사 피펫(끝이 잘린 경우)Fisherbarnd13-711-9CM페트리 접시 사이의 망막 이동을 돕습니다.
인공 뇌척수액(aCSF)망막 조직의 생리학적 상태를 유지합니다. NaCl, KCl, NaH2PO<>4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, 포도당 및 발암물질로 거품을 일으킵니다.
CaCl2Fisher ChemicalsC79-500인공 뇌척수액(aCSF)
탄수화물 공급(95% O2, 5% CO2)위해 aCSF에 산소를 공급하고 조직 생존력을 유지하는 데 사용됩니다.
곡선 블레이드 메스 (# 10)Integra4-110조직을 정밀하게 절단하는 데 사용됩니다.
해부 현미경(실체경)ZeissStemi 508망막 조직을 시각화하고 다루는 데 필수적입니다.
포도당Fisher ChemicalsBP350-1인공 뇌척수액 (aCSF)을 준비하기 위해
인라인 히터다채널 시스템TC02aCSF를 32-34°C로 데웁니다; 최적의 조건을 위한 C.
Ismatec 관류 시스템IsmatecISM4208산소가 공급된 aCSF의 지속적인 흐름을 유지합니다.
KClFisher ChemicalsP271-500인공 뇌척수액(aCSF)을 준비하려면KH
2PO4Sigma AldrichP5504-100g인공 뇌척수액(aCSF)을 준비하려면MaxOne
Recording UnitMaxwell BiosystemsMX1-BRDMaxOne Chip과 System 간의 인터페이스
MaxOne 시스템Maxwell BiosystemsMEA 기반 전기생리학적 복원을 위한MX1-SYS
3축 마이크로 매니퓰레이터와 교체 가능한 인서트가 있는 MaxOne 티슈 홀더Maxwell BiosystemsMX1-HLDMEA 칩에 망막의 정확한 배치를 보장합니다.
MEA 칩(MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)Maxwell BiosystemsMX1-S-CHP신경 세포 활동을 기록하기 위한 고밀도 미세 전극 어레이.
MgCl2Fisher ChemicalsM33-500인공 뇌척수액(aCSF)을 제조하려면NaCl
Fisher ChemicalsS271-1인공 뇌척수액(aCSF)을 제조하려면
NaHCO3Fisher ChemicalsS233-500인공 뇌척수액(aCSF)을 제조하려면
바늘(30 G x ½)BD Biosciences305106각막 절개를 돕습니다.
신생아 동물 (P1-P14, 쥐)망막 연구에 사용되는 생쥐, 쥐 또는 기타 유기체를 모델링합니다.
MaxLab Live Scope 소프트웨어가 설치된 PCHPZ4녹음의 데이터 수집 및 분석에 사용됩니다.
페트리 접시 (35mm 또는 60mm)Pyrex3483E12해부 작업 공간으로 사용됩니다.
Roboz 마이크로 Adson 집게(RS-5232, 길이 4.75인치, 톱니 1개 x 2개, 팁 0.5mm)RobozRS-5232미세 해부용 특수 집게.
Roboz 스프링 가위 (RS-5671, 10mm 절삭 날, 0.15mm 팁 너비, 3¾ " 전체 길이)RobozRS-5671섬세한 조직 절단용 정밀 가위.
단일 헤어 브러시: 섬세한 조직을 다루기 위해 단일 머리카락으로 수정된 작은 페인트 브러시.
끝이 가는 두 개의 집게RobozRS-5060섬세한 조직 취급에 사용됩니다.
Whatman 여과지(#1), 작은 조각으로 자른다GE 헬스케어1001-042망막 조직을 취급하고 건조하는 데 사용됩니다.
을 준비하기 코어 시스템.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ford, K. J., Feller, M. B. Assembly and disassembly of a retinal cholinergic network. Vis Neurosci. 29 (1), 61-71 (2012).
  2. Maccione, A., et al. Following the ontogeny of retinal waves: Pan-retinal recordings of population dynamics in the neonata....

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