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방법 논문

전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 가능 3차원 조직 모델

839 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68494

⸱

2025년 8월 19일

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 분석을 위해 3차원 조직 모방 내에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 사용하여 계산 모델링을 사용하여 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 정량화합니다.

초록

전기천공법은 고분자 전달 및 연조직 절제를 위해 전기 펄스를 활용하는 유망한 기술로, 차세대 예방 및 암과 같은 유전 질환 치료를 포함하는 응용 분야와 함께 사용됩니다. 이 연구는 주어진 전기천공 프로토콜에 대한 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 3D 조직 배양 모델을 보여줍니다. 불균일한 전기장을 사용하고 형질감염된 세포의 공간적 분포를 분석함으로써 단일 샘플 내에서 가역적 및 비가역적 임계값을 모두 식별할 수 있으므로 특히 생체 내 번역의 경우 전기천공 프로토콜을 특성화할 수 있는 효율성이 향상됩니다. 이 기능을 보여주기 위해 HEK293 세포를 포함하는 3D 조직 모방체를 링 및 핀 전극을 사용하여 형질감염하여 GFP 암호화 플라스미드를 전달했습니다. 그런 다음 형질감염된 샘플의 형광 현미경 이미지를 기반으로 전기천공 임계값을 도출했습니다. 이 모델은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 평가를 위한 수단으로 사용할 수 있는 잠재력을 보여주며, 이는 시간이 많이 걸리고 생체 내 조건을 덜 대표하는 경향이 있는 이러한 임계값을 평가하는 현재 방법에 비해 주요 이점입니다.

서론

가역적 전기천공법(RE)은 일반적으로 막 투과성 화합물 및 분자를 세포에 전달하기 위한 잘 확립된 방법론입니다 1,2,3. 여기서, 펄스 전기장(PEF)은 세포막의 일부를 따라 일시적이고 국부적인 나노 기공을 유도하는 임계 전기장 강도를 달성하는 데 사용됩니다. RE는 염료 및 핵산에서 화학요법제 및 기타 약물에 이르는 다양한 분자 및 화합물을 전달하는 데 사용되었습니다 4,5,6,7,8,9,10. 그러나 전기장 강도가 충분히 증가하면 더 높은 임계 임계값을 충족할 수 있으며, 이로 인해 세포 생존력이 급격히 감소합니다 1,2,11,12. 이 과정은 비가원적 전기천공법(IRE)으로 알려져 있으며 수술이 불가능한 종양 및 심장 부정맥에 대한 치료를 포함하여 연조직 절제에 대해 연구되었습니다 11,12,13,14,15,16. 치료 결과를 이해하고 향후 치료를 알리기 위해 이러한 RE 및 IRE 역치의 정량화는 전기천공 연구에서 일반적인 관행입니다 12,17,18,19,20. 그러나 RE 및 IRE 임계값은 세포 유형, 인가 전압, 펄스 지속 시간, 펄스 수 및 펄스 전달 속도 1,17,18,21,22를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.

전기천공 프로토콜에는 다양한 RE 및 IRE 임계값 1,17,18,21,22를 초래하는 여러 매개변수가 있습니다. 최적의 치료 전압과 파형은 오랫동안 조사되어 왔습니다. 대부분의 상업적으로 이용 가능한 전기천공 기술은 100μs-10ms23 정도의 단극 PEF가 있는 프로토콜을 활용합니다. 이러한 프로토콜은 임상적으로 관련된 결과를 달성하지만 생체 내에서 강렬한 근육 수축을 유도합니다 24,25,26. 이 때문에 이러한 자극을 완화하는 더 짧은 양극성 마이크로초 펄스가 최근 관심 주제가 되었습니다 1,11,24. 그러나 이러한 펄스는 펄스 대칭, 버스트 지속 시간 및 온도 의존성을 포함하여 RE 및 IRE 임계값에 영향을 미치는 새로운 요인을 도입합니다 1,17,22,27. 또한 세포 유형 및 조직 특성도 RE 및 IRE 결과 모두에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 19,28,29. 이 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 요인과 서로 간의 상호 작용 및 기타 가능한 환경 요인이 RE 및 IRE 임계값에 미치는 영향을 어떻게 특성화할 필요가 있으므로 더 높은 처리량 실험을 가능하게 하기 위해 실험 효율성을 개선해야 할 필요성이 점점 더 커지고 있습니다.

일반적인 시험관 내 전기천공 실험은 평행 전도성 플레이트로 큐벳에서 세포를 처리하여 프로토콜을 테스트하며, 이는 처리 중 큐벳 내에서 균일한 전기장 분포를 초래합니다 19,30,31,32,33,34. 앞서 언급한 바와 같이, 주어진 치료에 대한 최적의 인가 전압을 식별하기 위해 프로토콜의 RE 및/또는 IRE 임계값을 식별해야 합니다. 큐벳 연구에서 이를 달성하려면 각각 개별 인가 전압으로 여러 큐벳을 처리해야 합니다. 이를 위해서는 별도로 준비, 처리 및 분석해야 하는 상당한 수의 샘플이 필요하므로 실험 처리량이 제한됩니다. 이 과정을 개선하기 위해, 2D 35,36 및 3D 13,20,27,37,38,39 배양 모델 모두 개발되어 불균일한 전계 분포를 생성하는 전극을 사용하여 단일 샘플에서 전계 강도의 연속체를 평가하고,38,39. 그런 다음 RE 및 IRE 임계값은 전기장 분포 13,20,27,37,38의 계산 모델에서 파생됩니다. 이를 통해 필요한 샘플 수가 크게 줄어들어 임계값 정량화에 대한 보다 높은 처리량 접근 방식을 사용할 수 있습니다.

이 기사는 3D 시험관 내 모델에서 RE 및 IRE 필드 정량화를 위한 이 접근 방식을 입증하여 여러 환경(예: 세포 유형, 처리 매개변수, 전달될 분자)에 걸쳐 전기천공 프로토콜을 효율적으로 평가하기 위한 수단으로서의 잠재력을 입증하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 세포 준비

  1. 생물안전 캐비닛에서 10%(v/v) 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Eagle's Minimum Essential Medium에 조직 배양 T75 플라스크당 10mL의 부피로 세포주 HEK293 10 × 105 세포/ mL를 플레이트합니다.
  2. HEK293 세포를 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
  3. 시드 2일 후 배양 배지를 제거하고 4mL의 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 처리하여 실험을 위해 세포를 수확합니다.
  4. 세포와 트립신을 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 3-5분 동안 또는 세포가 배양 표면에서 분리될 때까지 배양합니다.
  5. 4mL의 배양 배지를 첨가하여 트립신의 효소 활성을 비활성화합니다.
  6. 180 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 배양 배지에 8 × 106 cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다.

2. 3D 조직 모델 생성

알림: 혼합물에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 이러한 단계에서는 역방향 피펫팅을 사용하십시오.

  1. 생물 안전 캐비닛에서 준비된 8 × 106 세포/mL 세포 현탁액을 I형 소 콜라겐 용액(3mg/mL)과 1:1 비율로 완전히 혼합합니다. 혼합물을 사용하는 동안 조기 중합을 방지하기 위해 얼음 위에 놓거나 차가운 구슬 욕조에 넣으십시오.
  2. 결합된 용액 500μL를 피펫팅하여 12웰 플레이트의 각 웰 바닥을 코팅합니다. 웰 중앙에서 용액을 분배하기 시작한 다음 부드럽게 바깥쪽으로 나선형으로 젤이 바닥을 고르게 코팅하는지 확인합니다.
  3. 젤의 가장자리가 웰 벽에 닿도록 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다.
  4. 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 6시간 동안 또는 겔이 단단해지고 플레이트를 기울일 때 움직이지 않을 때까지 겔을 배양합니다.
  5. 웰 플레이트를 기울이고 처리 최소 1시간 전에 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 하여 각 웰에 500μL의 배양 배지를 부드럽게 추가합니다. 젤은 생성 후 48시간 이내에 처리해야 합니다.

3. 전극 제작

  1. 두 개의 1.64mm 304 스테인리스 스틸 무딘 팁 주사기 바늘에서 플라스틱 루어 연결부를 제거합니다. 핀 전극 역할을 할 바늘 하나를 따로 보관하십시오. 다른 바늘의 경우 한쪽 끝의 마지막 5mm를 평평하게 만듭니다.
  2. 웰 플레이트 바닥과 같은 높이에 놓일 수 있을 만큼 충분히 긴 외경 19mm 316 스테인리스 스틸 튜브 섹션을 절단하여 링 전극을 만듭니다.
  3. CAD 소프트웨어를 사용하여 그림 1 과 같이 전극 홀더를 설계합니다. 홀더에 핀 전극을 위한 중앙 구멍, 링 전극을 위한 홈, 그리고 평평한 바늘을 삽입하여 링 전극을 제자리에 고정하는 압입을 만들 수 있도록 홈과 교차하는 구멍이 있는지 확인하십시오.
    1. 또한 홀더에 12웰 플레이트에 꼭 맞도록 설계된 립이 있고 전극과 웰이 모두 동축이 되도록 링 및 핀 전극을 웰 중앙에 배치하도록 설계되었는지 확인합니다(38).
  4. 확립된 레이저 절단 기술(40)을 사용하여 아크릴로 전극 홀더를 제작합니다.
  5. 링 및 핀 전극을 전극 홀더에 끼워 전극을 조립합니다.
  6. 끝이 평평한 바늘을 홀더에 압입하여 링 전극을 고정합니다.

4. 전기천공법을 이용한 3D 조직 모델 처리

  1. 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 기울이고 각 웰에서 400μL의 배양 배지를 흡인합니다. 젤에 닿지 않도록 주의하십시오. 겔 수화를 유지하기 위해 각 흡인 웰에 100μL의 배지를 남겨두어야 합니다. 흡인할 유체가 400μL 미만인 경우(피펫이 유체를 남기지 않거나 공기를 흡입함) 100μL 배양 배지를 추가합니다.
  2. 플레이트를 기울이고 각 웰의 벽에 축적되는 유체에 시약을 추가하여 이러한 흡인 웰에 20μL의 5μg/μL GFP 플라스미드 용액을 추가합니다(웰당 총 부피 120μL). 젤 표면에 고르게 퍼지도록 부드럽게 소용돌이치십시오.
  3. 5% CO2 환경과 함께 37°C의 가습 인큐베이터에서 겔을 10분 동안 배양합니다.
  4. 광섬유 온도 프로브를 핀 전극에 삽입하고 온도 판독을 시작합니다.
  5. 전기천공기의 양극 리드를 핀 전극에 연결하고 음극 리드를 링 전극을 고정하는 바늘에 연결합니다.
  6. 핫플레이트를 켜고 젤을 가열하여 37°C의 온도를 유지합니다.
  7. 핀에 광섬유 온도 프로브가 있는 링 앤 핀 전극을 웰에 삽입합니다. 핀이 플레이트에 수직이고 두 전극이 젤에 완전히 접촉하는지 확인하십시오.
  8. 겔이 37°C인지 확인합니다.
  9. 전기천공 치료를 제공합니다.
  10. 건조해 보이는 젤에 100μL의 배지를 추가합니다.
  11. 4.7-4.10단계를 반복합니다.
  12. 모든 처리가 완료되면 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 겔을 10분 동안 배양합니다.
  13. 웰 플레이트를 기울이고 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 각 웰에 500μL의 배양 배지를 부드럽게 추가합니다.
  14. 5% CO2 환경과 함께 37°C의 가습 인큐베이터에서 겔을 24시간 동안 배양합니다.

5. 세척 및 이미징

  1. 플레이트를 기울이고 각 웰에서 배양 배지를 흡인합니다. 젤에 닿지 않도록 주의하십시오.
  2. 플레이트를 기울이고 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 각 웰에 부드럽게 첨가합니다.
  3. 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 겔을 5분 동안 배양합니다.
  4. 플레이트를 기울이고 각 웰에서 PBS를 흡인합니다. 젤에 닿지 않도록 주의하십시오.
  5. 플레이트를 기울이고 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 각 웰에 부드럽게 첨가합니다.
  6. 플레이트를 부드럽게 휘젓고 기울인 다음 각 웰에서 PBS를 흡인합니다. 젤에 닿지 않도록 주의하십시오.
  7. 100μL의 신선한 PBS를 첨가하여 이미징을 위해 겔을 수화시킵니다.
  8. 표준 형광 현미경 기술을 사용한 이미지 플레이트. 이렇게 하면 가가적 및 비가역적 전기장 임계값이 각각 영역의 바깥쪽 및 내부 가장자리를 묶는 뚜렷한 녹색 토러스 모양 영역이 있는 겔의 이미지가 생성되어야 합니다.
  9. 웰 플레이트를 기울이고 플레이트 벽 아래로 미끄러지도록 각 웰에 500μL의 배양 배지를 부드럽게 추가합니다.
  10. 5% CO2 환경과 함께 37°C의 가습 인큐베이터에서 겔을 24시간 동안 배양합니다.
  11. 각 시점에 대해 5.1-5.10단계를 반복합니다.

6. 전산 모델 생성

  1. 물리 시뮬레이션 소프트웨어를 열고 전류, 고체의 열 전달 및 전자기 가열 물리학을 활용하는 새로운 2D 축대칭 모델을 만듭니다.
  2. 실험 설정의 전압, 주변 온도, 핫 플레이트 온도, 온도 설정값, 펄스 전달 속도, 통합 전기 선량, 링 및 핀 전극, 젤 및 웰 플레이트의 치수에 대한 매개변수를 생성합니다.
  3. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 링 및 핀 전극, 겔 및 실험 설정의 웰 플레이트의 방사형 단면을 나타내는 도메인 형상을 만듭니다.
  4. 시험관 내 실험 중에 사용되는 광섬유 온도 프로브를 나타내기 위해 겔 높이의 절반에 있는 중앙 전극 내부에 프로브 포인트를 배치합니다.
  5. 온도를 입력 인수로 사용하는 조각별 함수를 만듭니다.
  6. 온도가 6.2단계에서 정의된 온도 설정값 매개변수보다 낮을 때 값이 1이 되고 그렇지 않으면 0이 되도록 함수를 정의합니다.
  7. 핀 전극을 나타내는 도메인 형상의 맨 위 표면에 전압 경계 조건을 적용하고 전압 값을 6.2단계에서 정의된 전압 매개변수에 6.4단계에서 생성된 프로브 포인트의 온도에서 평가된 6.6단계의 조각별 함수를 곱한 값으로 설정합니다.
  8. 링 전극을 나타내는 도메인 형상의 맨 위 표면에 접지 경계 조건을 적용합니다.
  9. 나머지 모든 도메인 경계에 전기 절연 경계 조건을 적용합니다.
  10. 온도를 사용하는 연속 함수를 만듭니다.
  11. 콜라겐 겔의 온도 의존적 전도도의 확립된 모델27 을 사용하여 함수를 0.8277 + 0.0323*T로 정의합니다.
  12. 사용자 정의 재료를 정의하고 전기 전도도를 6.11단계에서 정의된 연속 함수로 설정합니다. 이 물질을 겔 도메인에 도포합니다.
  13. 재료를 정의하거나 사용 가능한 경우 소프트웨어 기본값을 사용하여 304 및 316 스테인리스강 재료를 각각 핀 및 링 전극 도메인에 할당하고 폴리스티렌을 웰 플레이트 도메인에 할당합니다.
  14. 모형의 베이스에 온도 경계 조건을 적용하고 온도 값을 37°C로 설정합니다.
  15. 다른 도메인과 인터페이스하지 않는 다른 모든 도메인 가장자리에 표면 주변 복사 경계 조건을 적용하고 도메인이 플레이트, 젤 또는 전극의 일부인지 여부에 따라 방사율을 각각 0.97, 0.9 및 0.075로 설정합니다27.
  16. 모델에 자유 삼각형 메쉬를 추가합니다. 요소 크기를 더 미세하게 설정합니다.
  17. 다양한 매개변수 수준을 평가하는 경우 매개변수를 평가할 모든 값을 나열하는 파라메트릭 스윕을 작성하십시오.
  18. 계산 버튼을 클릭하여 시뮬레이션을 실행합니다.
  19. 완료되면 결과 섹션에서 전기장의 2D 컷선 플롯을 생성합니다.
  20. 핀 전극에서 겔 도메인의 중간을 통해 링 전극으로 통과할 컷라인을 정의합니다. 이로 인해 핀 전극의 가장자리에서 링 전극의 가장자리까지 기하급수적인 감쇠가 발생합니다.
  21. 플롯 데이터를 .csv 또는 .xlsx 파일로 내보내 조회 테이블을 만듭니다.

7. 임계값 도출

  1. 현미경의 소프트웨어를 사용하여 수직 및 수평 축을 따라 토러스 모양 영역의 바깥쪽 및 내부 가장자리의 직경을 측정합니다. 소프트웨어에 이 기능이 없는 경우 ImageJ를 사용하여 이 작업을 수행합니다.
  2. 외경과 내경을 각각 평균화하고 2로 나누어 토러스 모양 영역의 외경과 내경을 계산합니다. 외부 반경은 RE 임계값을 표시합니다. 내부 반경은 IRE 임계값을 나타냅니다.
  3. 6.21단계에서 생성된 조회 테이블을 사용하여 측정된 반경에서 전기장 강도를 도출합니다.

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결과

링 및 핀 전극은 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포가 포매된 3D 콜라겐 조직 모방체에 성공적으로 전달했습니다. 성공적인 RE 임계값 정량화는 그림 2와 같이 형질감염된 영역의 외부 반경을 측정하고 실험 설정의 계산 모델에서 해당 전계 강도를 도출함으로써 달성되었습니다. IRE 역치는 형질감염된 영역의 내부 반경을 측정하여 유사하게 정량화되었습니다. 그림 3A-C는 양극성 마이크로초 PEF를 사용한 세 가지 프로토콜에 대한 결과 RE 및 IRE 임계값(각각 흰색과 빨간색으로 윤곽선으로 표시됨)을 강조 표시합니다. 프로토콜은 "PND" 표기법을 사용하여 파형의 양수(P) 및 음수(N) 펄스 지속 시간과 이 두 구성 요소 간의 지연(D)을 설명했습니다. 각 파형은 약...

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토론

이 방법을 사용하면 개별 전압에서 여러 샘플을 테스트할 필요 없이 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 식별할 수 있습니다. 불균일한 전기장을 사용하면 모델에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 기반으로 정량화할 수 있습니다. 그러나 이러한 불균일한 분포와 관련된 한계가 있습니다. 무엇보다도, 본원에 기술된 RE 및 IRE 임계값은 각각 성공적인 형질감염 및 세포 사멸을 위한 임계값이며, 이는 전기천공의 정도에 대한 직접적인 측정이 아닐 수 있다. 예를 들어, 일부 세포는 전기천공되었지만 기공이 형질감염에 충분하지 않거나 일부 세포가 유전자 과발현과 같은 비전기천공 현상으로 인해 사멸할 수 있습니다. 이것은 전기천공 프로토콜이 생체 내에서 변환되는 방식에 큰 영향을 미치지 않지만, 분자 흡수 정도와 치료로 인한 세포 사멸이 관심 지표이기 때문에 기초 연구에는 더 많은 정밀도가 필요할 수 있으며, 이는 칼세인 및 요오드화 프로피듐과 같은 다른 분석을 사용하...

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공개 사항

저자는 공개하지 않았습니다.

감사의 글

이 작업은 노스캐롤라이나 주립대학교에서 수행되었으며 국립보건원(R01CA272550)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-EDTA깁코25200056
1000 uL 피펫 팁피셔 사이언티픽13-811-164
15 mL 원뿔형 튜브피셔 사이언티픽14-959-70C
200 uL 피펫 팁피셔 사이언티픽13-811-139
304 스테인레스 스틸 무딘 팁 바늘맥마스터 카75165A753
316 스테인레스 스틸 튜브맥마스터 카89785K319
아크릴맥마스터 카8505K754
생물안전 캐비닛피셔 사이언티픽13-261-312
CAD 소프트웨어다쏘 시스템솔리드웍스
원심 분리기누에르뉴-C200R
전기천공기Hbio45-0662이 연구에서는 맞춤형 장치와 BTX ECM 830 시스템이 사용되었습니다
에벬피셔 사이언티픽MT10009CV이것은 다를 수 있습니다  HEK293 이외의 세포주를 사용하는 경우
Falcon 12웰 투명 플랫 바닥 TC 처리 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함코 닝353043모든 12웰 플레이트를 사용할 수 있지만 전극 홀더를 제작할 때 웰 치수를 고려해야 합니다.
FBS피셔 사이언티픽A5670701
광섬유 온도 프로브마이크로노르 주식회사TS5-20MM-02 시리즈
GFP-플라스미드알드베론지위즈-GFP
HEK293 세포ATCCCRL-1573 시리즈다른 세포주를 사용할 수 있지만 올바른 배양 배지를 사용해야 합니다.
핫 플레이트열전 냉각 미국 공사AHP-301CPV
얼음 또는 냉장 구슬 목욕피셔 사이언티픽10-876-001
이미지 분석 소프트웨어라이카라스 엑스
부 화기피셔 사이언티픽15-015-2633
도립 형광 현미경라이카디미8
레이저 커터맥마스터 카7344N11
페니실린-스트렙토마이신피셔 사이언티픽15140122
피펫 키트피셔 사이언티픽14-388-100
시뮬레이션 소프트웨어컴솔COMSOL 멀티피직스 6.2
T75 플라스크피셔 사이언티픽156499
I형 소 콜라겐 용액고급 바이오매트릭스50053 mg/mL

참고문헌

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