Method Article

전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 가능 3차원 조직 모델

DOI:

10.3791/68494

⸱

August 19th, 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 분석을 위해 3차원 조직 모방 내에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 사용하여 계산 모델링을 사용하여 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 정량화합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전기천공법은 고분자 전달 및 연조직 절제를 위해 전기 펄스를 활용하는 유망한 기술로, 차세대 예방 및 암과 같은 유전 질환 치료를 포함하는 응용 분야와 함께 사용됩니다. 이 연구는 주어진 전기천공 프로토콜에 대한 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값의 정량화를 위한 고처리량 3D 조직 배양 모델을 보여줍니다. 불균일한 전기장을 사용하고 형질감염된 세포의 공간적 분포를 분석함으로써 단일 샘플 내에서 가역적 및 비가역적 임계값을 모두 식별할 수 있으므로 특히 생체 내 번역의 경우 전기천공 프로토콜을 특성화할 수 있는 효율성이 향상됩니다. 이 기능을 보여주기 위해 HEK293 세포를 포함하는 3D 조직 모방체를 링 및 핀 전극을 사용하여 형질감염하여 GFP 암호화 플라스미드를 전달했습니다. 그런 다음 형질감염된 샘플의 형광 현미경 이미지를 기반으로 전기천공 임계값을 도출했습니다. 이 모델은 전기 천공 프로토콜의 고처리량 평가를 위한 수단으로 사용할 수 있는 잠재력을 보여주며, 이는 시간이 많이 걸리고 생체 내 조건을 덜 대표하는 경향이 있는 이러한 임계값을 평가하는 현재 방법에 비해 주요 이점입니다.

Introduction

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가역적 전기천공법(RE)은 일반적으로 막 투과성 화합물 및 분자를 세포에 전달하기 위한 잘 확립된 방법론입니다 1,2,3. 여기서, 펄스 전기장(PEF)은 세포막의 일부를 따라 일시적이고 국부적인 나노 기공을 유도하는 임계 전기장 강도를 달성하는 데 사용됩니다. RE는 염료 및 핵산에서 화학요법제 및 기타 약물에 이르는 다양한 분자 및 화합물을 전달하는 데 사용되었습니다 4,5,6,7,8,9,10. 그러나 전기장 강도가 충분히 증가하면 더 높은 임계 임계값을 충족할 수 있으며, 이로 인해 세포 생존력이 급격히 감소합니다

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 세포 준비

  1. 생물안전 캐비닛에서 10%(v/v) 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Eagle's Minimum Essential Medium에 조직 배양 T75 플라스크당 10mL의 부피로 세포주 HEK293 10 × 105 세포/ mL를 플레이트합니다.
  2. HEK293 세포를 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
  3. 시드 2일 후 배양 배지를 제거하고 4mL의 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 처리하여 실험을 위해 세포를 수확합니다.
  4. 세포와 트립신을 5% CO2 환경에서 37°C의 가습 인큐베이터에서 3-5분 동안 또는 세포가 배양 표면에서 분리될 때까지 배양합니다.
  5. 4mL의 배양 배지를 첨가하여 트립신의 효소 활성을 비활성화합니다.
  6. 180 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 배양 배지에 8 × 106

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

링 및 핀 전극은 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포가 포매된 3D 콜라겐 조직 모방체에 성공적으로 전달했습니다. 성공적인 RE 임계값 정량화는 그림 2와 같이 형질감염된 영역의 외부 반경을 측정하고 실험 설정의 계산 모델에서 해당 전계 강도를 도출함으로써 달성되었습니다. IRE 역치는 형질감염된 영역의 내부 반경을 측정하여 유사하게 정량화되었습니다. 그림 3A-C는 양극성 마이크로초 PEF를 사용한 세 가지 프로토콜에 대한 결과 RE 및 IRE 임계값(각각 흰색과 빨간색으로 윤곽선으로 표시됨)을 강조 표시합니다. 프로토콜은 "PND" 표기법을 사용하여 파형의 양수(P) 및 음수(N) 펄스 지속 시간과 이 두 구성 요소 간의 지연(D)을 설명했습니다. 각 파형은 약.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법을 사용하면 개별 전압에서 여러 샘플을 테스트할 필요 없이 가역적 및 비가역적 전기천공 임계값을 식별할 수 있습니다. 불균일한 전기장을 사용하면 모델에서 형질감염된 세포의 공간적 분포를 기반으로 정량화할 수 있습니다. 그러나 이러한 불균일한 분포와 관련된 한계가 있습니다. 무엇보다도, 본원에 기술된 RE 및 IRE 임계값은 각각 성공적인 형질감염 및 세포 사멸을 위한 임계값이며, 이는 전기천공의 정도에 대한 직접적인 측정이 아닐 수 있다. 예를 들어, 일부 세포는 전기천공되었지만 기공이 형질감염에 충분하지 않거나 일부 세포가 유전자 과발현과 같은 비전기천공 현상으로 인해 사멸할 수 있습니다. 이것은 전기천공 프로토콜이 생체 내에서 변환되는 방식에 큰 영향을 미치지 않지만, 분자 흡수 정도와 치료로 인한 세포 사멸이 관심 지표이기 때문에 기초 연구에는 더 많은 정밀도가 필요할 수 있으며, 이는 칼세인 및 요오드화 프로피듐과 같은 다른 분석을 사용하.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개하지 않았습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 노스캐롤라이나 주립대학교에서 수행되었으며 국립보건원(R01CA272550)의 자금 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% 트립신-EDTA깁코25200056
1000 uL 피펫 팁피셔 사이언티픽13-811-164
15 mL 원뿔형 튜브피셔 사이언티픽14-959-70C
200 uL 피펫 팁피셔 사이언티픽13-811-139
304 스테인레스 스틸 무딘 팁 바늘맥마스터 카75165A753
316 스테인레스 스틸 튜브맥마스터 카89785K319
아크릴맥마스터 카8505K754
생물안전 캐비닛피셔 사이언티픽13-261-312
CAD 소프트웨어다쏘 시스템솔리드웍스
원심 분리기누에르뉴-C200R
전기천공기Hbio45-0662이 연구에서는 맞춤형 장치와 BTX ECM 830 시스템이 사용되었습니다
에벬피셔 사이언티픽MT10009CV이것은 다를 수 있습니다  HEK293 이외의 세포주를 사용하는 경우
Falcon 12웰 투명 플랫 바닥 TC 처리 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함코 닝353043모든 12웰 플레이트를 사용할 수 있지만 전극 홀더를 제작할 때 웰 치수를 고려해야 합니다.
FBS피셔 사이언티픽A5670701
광섬유 온도 프로브마이크로노르 주식회사TS5-20MM-02 시리즈
GFP-플라스미드알드베론지위즈-GFP
HEK293 세포ATCCCRL-1573 시리즈다른 세포주를 사용할 수 있지만 올바른 배양 배지를 사용해야 합니다.
핫 플레이트열전 냉각 미국 공사AHP-301CPV
얼음 또는 냉장 구슬 목욕피셔 사이언티픽10-876-001
이미지 분석 소프트웨어라이카라스 엑스
부 화기피셔 사이언티픽15-015-2633
도립 형광 현미경라이카디미8
레이저 커터맥마스터 카7344N11
페니실린-스트렙토마이신피셔 사이언티픽15140122
피펫 키트피셔 사이언티픽14-388-100
시뮬레이션 소프트웨어컴솔COMSOL 멀티피직스 6.2
T75 플라스크피셔 사이언티픽156499
I형 소 콜라겐 용액고급 바이오매트릭스50053 mg/mL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sano, M. B., Fan, R. E., Xing, L. Asymmetric waveforms decrease lethal thresholds in high frequency irreversible electroporation therapies. Sci Rep. 7 (1), 40747(2017).
  2. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review.

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