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방법 논문

마이코플라스마 폐렴 핵산 및 약물 내성 유전자의 검출

819 조회수

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DOI:

10.3791/68500

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2025년 9월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 2Department of Clinical Laboratory Medicine, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital, 3Department of Clinical Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern Medical University, 4Medical laboratory, Heyuan Key Laboratory of Molecular Diagnosis & Disease Prevention and Treatment, Doctors Station of Guangdong province, Heyuan People's Hospital, Guangdong Provincial People's Hospital Heyuan Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 마이코플라스마 폐렴 감염을 감지하고 항생제 내성을 식별하는 빠르고 안정적인 방법을 제공합니다. 이는 의사가 올바른 치료법을 더 빨리 선택하여 폐렴 환자에 대한 치료를 개선하고 항생제의 더 나은 사용을 지원하는 데 도움이 됩니다

초록

마이코플라스마 폐렴 (Mp)은 소아 인구에서 지역사회 획득 폐렴(CAP)을 유발하는 가장 널리 퍼진 병원체 중 하나입니다. 마이코플라스마 폐렴 내성 유전자의 검출은 MP 감염의 정확한 임상 진단 및 치료를 위한 강력한 기술 지원과 이론적 기반을 제공합니다. Mp 감염에서 약물 내성에 대한 정확한 진단과 평가는 임상 치료에 필수적입니다. 마이코플라스마 폐렴 에 대한 일반적인 검출 방법에는 배양, 항체 검출 및 분자 생물학 기반 분석이 포함됩니다. Mp 배양은 진단을 위한 황금 표준이지만 특정 배지가 필요하고 시간이 많이 걸리며 민감도가 낮습니다. Mp의 항체 기반 검출이 널리 사용됩니다. 그러나 감염 초기에는 위음성이 발생할 수 있습니다. 분자 생물학 기반 검출은 빠른 처리, 낮은 오염 위험, 높은 감도, 높은 특이성을 제공하며 샘플 수집 시기 또는 면역 상태에 제한을 받지 않습니다. 따라서 마이코플라스마 폐렴 감염 진단을 위한 새로운 표준으로 인식되었습니다. 마크로라이드 제제는 소아의 Mp 감염에 대한 첫 번째 선택 치료법입니다. 그러나 소아의 호흡기 감염에 마크로라이드가 광범위하게 사용됨에 따라 약물 내성 마이코플라스마 폐렴 감염의 발생률이 증가하고 있습니다. 내성 균주에 감염된 환자는 민감한 균주에 감염된 환자에 비해 투여 후 발열 기간이 현저히 길어지고 입원 기간이 길어지며 발열이 길어집니다. 현재까지 확인된 돌연변이 부위에는 2063, 2064, 2067 및 2617이 포함됩니다. 중국에서는 점 돌연변이가 2063위와 2064위에서만 기록되었으며, 2063위에서 A-to-G 치환이 가장 일반적입니다. 이러한 부위의 경우 형광 프로브 기술과 결합된 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 인간 가래 샘플에서 마이코플라스마 폐렴 의 핵산 및 약물 내성 돌연변이를 검출했습니다. 마이코플라스마 폐렴 내성 유전자의 검출은 Mp 감염의 정확한 진단과 효과적인 치료를 위한 중요한 기술 지원과 이론적 기반을 제공합니다.

서론

마이코플라스마 폐렴(Mp)은 박테리아와 바이러스 사이의 중간 위치에 위치한 독립적인 생존이 가능한 가장 작은 병원성 미생물입니다. 이는 주로 호흡기 비말 또는 에어로졸에 의해 전파되며 소아의 지역사회 획득 폐렴(CAP)과 관련된 두 번째로 흔한 병원체를 구성하며1 CAP 사례의 20%에서 40%를 차지합니다2. Mp는 페니실린 및 세팔로스포린과 같은 β-락탐 항생제에 대한 고유한 내성을 나타내는데, 이는 이러한 항생제가 세포벽 합성을 방해하여 표적으로 삼는 세포벽이 없기 때문입니다. Mp 감염에 대한 주요 치료 양식은 테트라사이클린 및 플루오로퀴놀론과 같은 DNA 복제를 방해하는 의약품과 함께 마크로라이드 및 테트라사이클린을 포함한 단백질 합성을 방해하는 제제로 구성됩니다 3,4,5. 따라서 Mp의 신속한 실험실 식별은 항생제의 현명한 적용을 알리는 데 필수적입니다. Mp에 대한 현대 실험실 검출 방법에는 분리 및 배양, 항원 검출, 항체 검출 및 유전자 진단 기술이 포함됩니다.

전통적인 검출 방법인 분리 및 배양은 마이 코플라스마 폐렴 감염 진단을 위한 결정적인 표준입니다. Kashyap et al. 인후 면봉 또는 객담 검체에서 Mp를 배양하는 것이 신뢰할 수 있는 진단 기술임을 관찰했습니다6. 이 접근 방식은 Mp의 엄격한 문화적 전제 조건, 연장된 배양 기간, 일반적으로 낮은 양성 검출률과 같은 상당한 장애물에 직면하여 일상적인 임상 사용을 제한합니다. Mp 항원 검출은 Mp 특이적 항체에 따라 달라집니다. Miyashita et al. 다양한 Mp 균주의 단클론 항체를 이중 항체 샌드위치 ELISA의 코팅제로 사용하고 PCR7을 사용하여 그 효능을 평가했습니다. 연구 결과는 두 방법론 사이에 실질적인 차이가 없음을 보여주었습니다. 그러나 고도로 특이적이고 역가가 높은 단클론 항체의 필요성으로 인해 이 방법의 광범위한 구현이 제한됩니다.

Mp 감염 후 면역 체계는 특정 IgM 및 IgG 항체를 생성합니다. IgM 항체는 일반적으로 감염 후 1주 이내에 검출이 가능해지며 3-4주에 최고조에 도달하여 초기 감염에 대한 귀중한 진단 지표가 됩니다. 그러나 초기 단계에서는 항체 수준 감소로 인해 위음성 결과가 발생할 수 있습니다8. 반대로, IgG 항체는 나중에 나타나며 일반적으로 이전 감염을 나타냅니다 9,10. Mp의 혈청학적 검출은 비특이적 항체 분석과 특이적 항체 분석으로 분류됩니다. 비특이적 항체 검사는 시행이 간단하지만 리케치아, 아데노바이러스 등 다른 병원체의 감염도 한랭응집소 수치를 증가시켜 위양성 결과를 초래할 수 있기 때문에 특이성이 제한적입니다. 특이적 항체 분석에는 보체 고정 테스트, 입자 응집 테스트, 간접 혈구 응집 테스트, 간접 면역형광 분석 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)이 포함됩니다. ELISA는 확립된 기술과 상업적 접근성으로 인해 중국에서 광범위하게 활용되고 있으며, 높은 감도와 작동 단순성을 제공하여 일상적인 임상 실습에서 Mp 감염을 진단하는 실용적이고 신뢰할 수 있는 방법 역할을 합니다11.

실시간 형광 정량 PCR은 빠른 처리 시간, 높은 특이성, 강력한 민감도 및 교차 반응성이 없다는 점에서 구별됩니다. 이 방법은 가래, 인후 면봉 또는 기관지 세척액 샘플에서 Mp DNA를 식별하며 반응당 1-100ng의 DNA가 필요합니다. 검출은 실시간 PCR 기기를 사용하여 수행되었습니다. DNA 주형은 더 높은 온도에서 변성을 경험한 후 프라이머 어닐링 및 형광 프로브 혼성화를 경험합니다. 유전자 증폭 기술은 극도로 낮은 농도의 핵산 단편을 짧은 시간 내에 수백만 개의 복제로 가능하게 하여 ≥10 CFU/mL의 검출 감도를 달성합니다12. 기존 PCR과 비교하여 실시간 형광 정량 PCR은 오염 위험을 줄이는 동시에 높은 처리량 및 자동 분석을 가능하게 합니다. 따라서 임상 실습에서 직접 Mp 검출을 위해 선호되는 기술로 부상했습니다13. 민감도가 높아지기 때문에 위양성 또는 위음성 결과를 초래할 수 있는 오염을 방지하기 위해 엄격한 조치가 필요합니다.

임상 치료에서 마크로라이드는 마이코플라스마 폐렴 폐렴(MPP)에 대한 1차 치료 개입을 구성합니다. 항생제의 과도한 사용과 부적절한 적용으로 인해 선택압이 가해져 마크로라이드 내성 Mp가 등장했습니다. 이 저항성은 내화 MPP에 중요한 기여를 합니다. 마이코플라스마 폐렴의 마크로라이드 내성은 동아시아, 특히 중국과 일본에서 눈에 띄게 높은 반면, 유럽과 미국은 상대적으로 낮은 내성률을 보입니다. 소아 환자는 일반적으로 성인에 비해 높은 저항률을 나타내므로 강화된 조사가 필요합니다14. 2000년 이후 마이코플라스마 폐렴 감염(MRMPI)의 발병률은 전 세계적으로, 특히 동아시아에서 크게 증가했습니다. 중국에서 MRMPI 균주는 사례의 69%에서 95%를 차지합니다.15 심각한 질병, 치료 실패, 합병증 및 장기 후유증에 크게 기여합니다. 연구에 따르면 23S rRNA 유전자의 돌연변이는 표적 부위에 대한 마크로라이드 결합을 억제하여 결과적으로 약물 효능을 감소시킵니다. 빈번한 돌연변이 유전자좌는 위치 2063, 2064, 2067 및 2617을 포함합니다. 중국에서는 2063 및 2064 위치에서만 돌연변이가 확인되었습니다16,17. 2016년 연구에 따르면 베이징, 하얼빈, 상하이, 신장의 마크로라이드 내성율은 66.7%에서 86.7% 사이인 반면, 난징은 20%로 더 낮은 비율을 보였습니다18. 마크로라이드 내성 균주는 다양한 지역에서 등장했으며, 내성율은 다음과 같이 보고되었습니다: 프랑스 8.3%-9.8%, 독일 3.0%-3.6%, 미국 8.2%, 덴마크 0.9%-2.9%, 캐나다 12.1%, 이탈리아 20%, 이스라엘 22%, 스페인 8%, 영국 9.3% 19,20,21,22,23,24,25,26, 27. 이러한 추세는 마크로라이드 내성이 전 세계적으로 확산되고 있음을 강조합니다. 2008년에 Hindley et al. 마크로라이드 내성 마이코플라스마 폐렴 46건을 보고했으며, 40건은 A2063G 돌연변이를 나타내고, 1건은 A2063C 돌연변이를 나타내며, 5건은 A2064G 돌연변이를 나타냈습니다28. 일본과 미국에서 유사한 내성 돌연변이가 확인되었으며, 1차 돌연변이는 위치 2063과 2064에서 발생합니다29. 연구에 따르면 돌연변이 부위와 약물 내성 표현형 사이의 관계가 시사됩니다: A2063G 돌연변이는 14원 마크로라이드(ML)에 대한 내성을 부여하고, A2064G 돌연변이는 14원 및 16원 ML 모두에 대한 내성을 부여하고, C2617G는 14원 및 15원 ML에 내성을 부여하고, A2067G 돌연변이는 16원 ML에 내성을 부여합니다30. Mp 내성을 모니터링하는 것은 약물 내성 감염을 조기에 식별하고 임상 치료 선택을 알리는 데 중요합니다. 연구에 따르면 체외 항균제 감수성 검사는 임상 약물 효과를 예측할 수 있는 것으로 나타났습니다31. 2011년 미국 임상 및 실험실 표준 협회(American Clinical and Laboratory Standards Institute)는 마크로라이드 내성을 평가하기 위해 최소 억제 농도(MIC)를 확인하기 위한 미세 희석 방법을 옹호하는 지침을 공포했습니다32. 그러나 MIC의 결정에는 몇 주가 소요될 수 있으므로 실시간 항생제 치료를 지시하는 데 있어 임상적 유용성이 제한됩니다.

Sanger 시퀀싱은 Mp의 23S rRNA 유전자에서 돌연변이를 식별하기 위한 직접적인 기술입니다. 이 방법은 형광 표지된 뉴클레오티드와 전기영동 분석을 사용하여 DNA 서열을 확인하고 Mp 유전적 변이를 쉽게 식별합니다. Sanger 시퀀싱은 여러 돌연변이를 동시에 식별하고 내성 균주와 감수성 균주의 비율을 정량화할 수 있지만 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리므로 임상적 유용성이 제한됩니다33,34. 대조적으로, 파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 혼입 중 피로인산염 방출을 식별하여 DNA 서열 변이에 대한 보다 정확한 평가를 제공합니다. 이 방법은 MRMPI 균주를 식별하고 Sanger 시퀀싱보다 더 정확하게 임상 샘플에서 내성 균주와 감수성 균주의 비율을 정량화할 수 있습니다. 또한 파이로시퀀싱은 개별 환자의 종단적 모니터링을 가능하게 하여 내성 발생을 실시간으로 평가하고 치료 수정을 알릴 수 있습니다33. 그러나 임상 적용은 전문 장비, 숙련된 인력 및 장기간의 처리 기간의 필요성으로 인해 제약을 받습니다.

P1 유전자의 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석을 기반으로 Mp는 I형(5가지 하위 유형: 1a-1e로 더 나뉩니다)과 II형(3가지 하위 유형으로 더 나뉩니다: 2a-2c)의 두 가지 유형으로 분류됩니다. 이 검사는 마이코플라스마 폐렴35의 8개 유전자 아형을 검출할 수 있습니다. 이 방법은 소아 객담 검체에서 마이코플라스마 폐렴 및 마크로라이드 내성 돌연변이(23S rRNA 2063(A:G) 및 2064(A:G) 돌연변이 부위)의 정성적 식별을 용이하게 하여 마이코플라스마 감염 및 항생제 내성 감시를 위한 신속하고 간단한 보조 진단 도구를 제공합니다.

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프로토콜

모든 연구 프로토콜은 Heyuan People's Hospital의 의료 윤리 위원회(승인 번호. YXYJLL-LW2025001)를 사용합니다. 모든 환자는 참여 전에 서면 동의서를 제공했습니다.

1. 표본 수집

알림: 샘플 수집 중에 무균 기술을 유지하는 데 주의하십시오.

  1. 환자 또는 의심 환자의 가래 검체를 수집합니다. 환자의 질병 발병 후 3일 이내에 샘플을 채취하십시오.
  2. 환자에게 물로 입을 헹구고 심호흡을 하고 5초 동안 숨을 유지한 다음 서서히 숨을 내쉬도록 지시합니다.
  3. 환자에게 다시 한 번 깊게 숨을 내쉬고 가래를 배출한 후 지정된 플라스틱 컵에 넣고 뚜껑을 단단히 닫도록 요청합니다. 가래는 실온(RT)에서 즉시 임상 실험실로 전달되어야 합니다. 샘플을 냉장고에 2-8°C에서 보관하십시오.

2. 증폭 시약의 준비

  1. PCR 실험실의 시약 준비 구역에서 -20°C 냉동고에서 회수한 후 키트의 완충액, 프라이머 프로브 및 물을 4°C에서 해동합니다. 효소를 제거하고 흔들어 부드럽게 혼합한 다음 1,006 x g 에서 10초 동안 원심분리합니다.
  2. 멸균 뉴클레아제가 없는 원심분리기 튜브를 회수하여 라벨을 붙이고 표 1에 설명된 대로 각 개인에 대한 반응 시스템을 준비합니다. PCR 반응의 총 수는 샘플의 합, 약한 양성 품질 관리 1개, 품질 관리 제품 W 1개, 음성 추출 대조군 1개와 같아야 합니다.
  3. 각 시약의 양을 결정하고 적절한 크기의 원심분리기 튜브에 넣고 완전히 혼합한 후 저속으로 잠시 원심분리합니다. 각 PCR 반응 튜브에 20μL의 시약을 분배하고 샘플 처리 영역으로 재배치합니다.

3. 샘플 처리

  1. 1mL의 가래 샘플을 2mL의 가래 소화 완충액으로 처리하고 완전히 와류로 혼합한 다음 완전한 액화가 이루어질 때까지 30분 동안 배양합니다.
  2. 시료량에 따라 핵산 추출 플레이트의 1차 및 7차 컬럼 에 내부 표준 5μL를 순차적으로 첨가한 후 액화 시료 200μL, 생리 식염수 및 MM 약양성 품질 관리를 연속적으로 첨가합니다.
  3. 자동 핵산 추출 기기를 사용하여 핵산 추출 플레이트를 회수합니다. 추출 플레이트의 열 6 및 12에서 다운스트림 분석을 수행한 후 추출된 핵산을 첨가합니다.
  4. 샘플 추가: PCR 실험실의 샘플 준비 구역에서 추출된 핵산을 추출 플레이트의 6번째 및 12번째 컬럼에 추가합니다. 그 후, 준비된 샘플 핵산 5.0μL를 PCR 반응 혼합물(샘플, 강하고 약한 양성 품질 관리, 품질 관리 W 및 추출 음성 대조군 포함)이 들어 있는 PCR 반응 튜브로 옮깁니다.
  5. PCR 반응 튜브 액체를 고정하고 즉시 원심분리를 수행하여 액체가 적절하게 밀봉되고 기포가 없는지 확인합니다.

4. 증폭

  1. 반응 튜브를 형광 PCR 검출기에 삽입하고 표 2와 같이 사이클 매개변수를 구성합니다.
  2. FAM(2063 또는 2064 A:G 돌연변이), VIC(Mycoplasma pneumoniae) 및 CY5(내부 표준)에서 형광 신호를 획득하고 데이터 수집은 64°C로 설정합니다.

5. 데이터 분석

참고: 이 연구는 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 사용했으며, 대표적인 결과는 마이코플라스마 폐렴의 위치 2063 또는 2064에서 A:G 내성 관련 돌연변이를 나타냅니다. 양성 판정을 받은 환자는 임상 치료에서 마크로라이드 항생제를 피해야 합니다.

  1. 반응 후 기기는 결과를 자율적으로 분석하고 보관합니다. 음성 대조군의 표적 유전자가 FAM 형광 Ct ≥ 35.33 및 VIC 형광 Ct ≥ 35.01을 나타내는 반면, 품질 관리 W의 표적 유전자는 FAM 형광 Ct ≥ 35.33 및 VIC 형광 Ct ≥ 35.01을 나타내는지 확인합니다. 약하게 양성 품질 관리 제품에서 FAM 및 VIC 형광에 대한 Ct 값은 29.00에서 34.00 사이였습니다.
  2. 일반적으로 내부 표준의 Ct 값은 ≤ 35.00입니다. 특징적인 S 증폭 곡선이 관찰되지만 표적 유전자의 농도 상승으로 인해 내부 표준이 증폭되지 않는 경우 양성 샘플로 직접 보고하거나 10배 그래디언트 희석을 통해 샘플을 재평가합니다.
  3. UNDECT 또는 일반적인 S형 증폭 곡선이 없는 샘플을 음성으로 분류합니다.
  4. FAM 형광(2063 또는 2064 A:G 돌연변이) Ct ≥ 35.33, VIC 형광(Mycoplasma pneumoniae) Ct가 35.01 ≥ 또는 일반적인 S형 증폭 곡선이 없는 경우 샘플을 음성으로 간주합니다. Ct 값이 표 3을 충족하고 특징적인 S형 증폭 곡선을 나타낼 때 샘플을 양성으로 간주합니다.
    참고: 샘플 검출의 결과는 샘플 수집, 처리, 운송 및 보존의 품질에 따라 달라집니다. 오류가 있으면 거짓 음성 결과가 발생할 수 있습니다. 샘플 처리 중 교차 오염을 제어하지 못하면 위양성 결과가 발생할 수 있습니다.

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결과

객담 샘플의 액화, 핵산 추출 및 형광 PCR 증폭 후, 증폭 곡선 분석 후 기준선의 시작 값, 종료 값 및 임계값을 수정했습니다. 시작 값은 3이고 종료 값은 20입니다.

본 실험의 대표적인 결과는 Mp 핵산에 대해 양성이었고, 2063 또는 2064 부위에서 A:G 내성 돌연변이가 발생하여 Mp 감염 및 마크로라이드 항생제에 대한 내성을 시사하였다.

품질 관리 W의 증폭 곡선은 임계값 선 아래에 유지되도록 보정되었습니다. 음성 대조군의 표적 유전자는 FAM 형광 Ct > 35.33 및 VIC 형광 Ct > 35.01이었습니다. 품질 관리 W의 표적 유전자는 FAM 형광 Ct > 35.33 및 VIC 형광 Ct > 35.01이었습니다...

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토론

PCR 및 그 유도 기술은 마이코플라스마 폐렴 (MP)의 약물 내성 식별, 유형 및 검출에서 혈청학적 방법에 비해 우수한 민감도와 특이성을 보여줍니다. 또한 PCR 기반 기술은 작동 용이성과 비용 절감을 제공하여 일상적인 임상 진단을 위한 실행 가능한 대안이 됩니다36. Mp는 CAP와 관련된 주목할만한 병원체이며 상당한 유병률을 보여줍니다37. 적절한 항생제를 선택하면 회복을 촉진하고 부작용 가능성을 줄일 수 있습니다. 마크로라이드는 특히 소아 환자에서 M. 폐렴의 일차 치료법으로 사용됩니다. 중국에서 M. pneumoniae 의 유병률 증가는 임상 관리에 심각한 어려움을 안겨줍니다37.

이 연구는 인간 가래 샘플에서 마이코플라스마 폐렴...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

실험 시약은 광동성 의사 스테이션의 분자 진단 및 질병 예방 및 치료 Heyuan 핵심 연구소의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자동 핵산 추출 기기광저우 Da 'an Gene Co., Ltd.스마트 32
필터 팁코링생명과학(주)298220010-10&마이크로; L
필터 팁코링생명과학(주)030230011-50&마이크로; L
필터 팁코링생명과학(주)056230015-300&마이크로; L
마이크로튜브코링생명과학(주)141249341.5mL
마이코플라스마 폐렴 핵산 및 약물 내성 돌연변이 부위 검출 키트(형광 PCR 방법)장쑤성 두더지 생명 공학 유한 회사20241111
핵산 추출 시약(마그네틱 비드 방식)Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.지24004
PCR 튜브DN Biotech(홍콩)  주식회사61210030.2mL
실시간 형광 PCR 기기바이오 RADCFX96 시리즈

참고문헌

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