이 프로토콜의 목적은 생리 활성 화합물에 의한 쿼럼 감지 억제를 평가하기 위한 프록시로서 Chromobacterium violaceum ATCC 12472에 의한 비올라세인 생산을 정량화하는 것입니다.
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방법 논문
Chromobacterium violaceum에서 Violacein의 정량화 및 생리 활성 화합물에 의한 억제
이 논문에서
요약
초록
박테리아는 쿼럼 감지(QS)라는 시스템을 통해 통신하며, 이를 통해 세포 밀도의 변화에 반응하여 행동을 조정할 수 있습니다. 이 과정에는 일반적으로 자가유도제(AI)라고 하는 작은 세포외 신호 분자의 생산, 분비 및 검출이 포함됩니다. QS는 생물막 형성 및 확산, 군집 운동성, 독성 인자 생성, 항생제 내성, 생물 발광 등 광범위한 유전자와 기능을 조절합니다. QS 억제는 기존 항생제에 비해 낮은 선택압을 발휘하기 때문에 항생제 내성 박테리아에 대한 유망한 항독성 전략이 되었습니다. 박테리아 Chromobacterium violaceum ATCC 12472에서 Aliivibrio fisheri의 LuxI/LuxR형 QS 단백질과 상동인 QS 단백질 CviI/CviR은 보라색 색소 비올라세인 생성을 담당하는 유전자를 포함하여 많은 유전자를 제어합니다. C. violaceum 은 QS 억제 연구, 특히 비올라세인 생산 억제에서 바이오센서 균주로 널리 사용되었습니다. 많은 화합물은 LuxI 또는 LuxR 상동체인 QS 단백질에 결합하여 QS 회로를 방해함으로써 QS를 억제할 가능성이 있습니다. 이 프로토콜은 C. violaceum ATCC 12472에 의해 생산된 비올라세인을 정량화하는 방법과 박테리아 성장에 영향을 미치지 않는 농도의 생리 활성 화합물에 의한 억제를 설명합니다. 여기에 설명된 분석은 테스트된 화합물에 의한 비올라세인 생산의 상당한 감소를 보여줍니다. 이 연구는 QS 억제 연구에서 유망한 후보를 선별하기 위해 이 프로토콜을 사용할 수 있는 가능성을 강조합니다.
서론
박테리아는 QS라는 시스템을 통해 통신할 수 있으며, 이를 통해 세포 밀도의 변화에 반응하여 행동을 조정할 수 있습니다. 이 과정에는 자가유도제라고도 하는 작은 세포외 신호 분자의 생산, 분비 및 검출이 포함되며, 이는 서로 다른 종 간 및 동일한 종 내에서 통신을 가능하게 합니다 1,2.
이 통신은 생물막 형성 및 분산, 운동성 및 접착, 세포 증식, 외효소 및 철단의 합성, 포자 형성, 내산성, 수평 유전자 전달, 항생제 내성, 생물 발광, 외소다당류 생산 등과 같은 유전자 및 기능을 조절할 수 있습니다 3,4,5. QS 조절 표현형의 관련성을 감안할 때 이 세포 통신을 방해할 수 있는 시스템을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다. QS 신호의 억제는 쿼럼 소멸(QQ)이라고도 합니다6. QQ는 자가유도제 합성 억제제, 이러한 신호의 ....
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프로토콜
1. 배양 준비(그림 2)
- Luria Bertani 국물(LB: 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 5g/L NaCl)에서 Luria Bertani 국물(LB: 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 5g/L NaCl)에서 5mL 배양액을 시험관에서 24시간 동안 성장시킵니다.
- 배양액을 약 1 x 108 CFU/mL에 해당하는 0.1 in LB 국물의 OD595로 조정합니다.
2. 화합물 준비
- 바닥이 평평한 96웰 플레이트에 아래 설명에 따라 연속 희석 계산에 따라 LB 국물과 생리 활성 화합물을 추가합니다. 용해도에 따라 생리 활성 화합물은 일반적으로 순수 DMSO 또는 DMSO: 물(1:1) 용액에서 희석됩니다.
참고: QSI를 평가하는 방법론에서는 사용된 농도가 박테리아 성장에 영향을 미치지 않는 최소 억제 농도(sub-MIC) 미만인지 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 화합물이 미생물 생존율....
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결과
여기에 표시된 결과를 위해 연구 그룹8에서 이전에 연구한 세 가지 생리 활성 화합물인 레스베라트롤, 파르네솔 및 리나룰이 사용되었습니다. 각 화합물은 vioABCDE 오페론23에 대해 QS 시스템에 의해 조절되는 표현형인 C. violaceum ATCC 12472에서 비올라세인 생산을 억제하는 능력에 대해 테스트되었습니다.
결과는 C. violaceum ATCC 12472에서 비올라세인 생산 및 생리 활성 화합물에 의한 억제를 정량화하는 프로토콜의 효능을 검증합니다. 박테리아 성장에 영향을 주지 않고 파르네솔, 리나룰 및 레스베라트롤에 의한 비올라세인 수치의 유의한 감소는 QSI를 항균 효과와 구별하는 방법의 능력을 확인시켜 줍니다24. 이전 방법(25,24,26.......
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토론
C. violaceum에서 비올라세인을 추출하고 특성화하는 최초의 방법은 1990년대에 등장했으며, 안료 합성에 적합한 탄소원을 식별하는 데 중점을 두었습니다. 이 과정에서 비올라세인은 세포 및 배양 배지와 함께 건조되고 에탄올에 재현탁된 다음 상청액 추출에 의해 분리되었습니다. 이제 에탄올에 용해된 비올라세인은 이후 다시 건조되어 순수하고 건조한 형태의 안료를 산출했습니다27. 1998년에 프로토콜이 수정되었습니다28. 에탄올은 여전히 비올라세인을 용해하는 데 사용되었지만 업데이트된 방법은 여과, Soxhlet 추출 및 결정화 단계를 도입했습니다. 수년에 걸쳐 비올라세인 추출 / 정량 화는 세포를 용해하고 부탄올25로 비올라세인을 추출, 초음파 처리 및 DMSO29에서 희석하고 플레.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
보조금 #403661/2023-4 및 #444794/2024-7 및 장학금 #306685/2022-1을 통해 국립과학개발위원회(CNPQ)와 보조금 #2024/05158-6 및 2023/17090-4, 식품연구센터(FoRC) #2013/07914-8에 대한 재정 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMSO | 신디사이저 | ||
| 파르네솔 | 시그마-알드리치 | 에프203 | 95% |
| 리나룰 | 시그마-알드리치 | L2602 | 97% |
| 루리아-베르타니 미디엄 | 디프코 | 244620 | |
| 광학 접착 필름 | 써모 피셔 | 4311971 | 마이크로앰프 |
| 레스베라트롤 | 시그마-알드리치 | R5010 | ≥ 99%(HPLC) |
| Synergy HTX 다중 모드 리더 | 바이오텍 | ||
| 조직 배양 플레이트 96 웰 | 카스비 | K12-096 |
참고문헌
- Mukherjee, S., Bassler, B. L. Bacterial quorum sensing in complex and dynamically changing environments. Nat Rev Microbiol. 17 (6), 371(2019).
- Lima, E. M. F., Winans, S. C., Pinto, U. M. Quorum sensing interference by phenolic compounds - A matter of bac....
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재인쇄 및 허가
