NRF2/HO-1 경로 활성화를 통한 자발적 뇌내 출혈 후 RKIP 억제에 의한 신경 페로토시스 감쇠

자발성 뇌내출혈(ICH)은 두개내 혈관 손상, 괴사 및 혈관 파열로 인한 출혈을 특징으로 하는 뇌혈관 질환으로 일반적으로 기저핵에 영향을 미치며 출혈성 뇌졸중의 주요 하위 유형을 나타냅니다¹. ICH 진단을 받은 환자의 사망률은 약 50%이며, 생존자의 상당수가 심각한 독립성 상실을 경험합니다². 자발적 ICH에 대한 현재 치료 옵션은 제한되어 있으며, 사망률을 크게 줄이거나 ICH 후 신경학적 결과를 현저하게 향상시키는 것으로 나타난 기존 치료법은 없습니다.

철 의존성 형태의 프로그램된 세포 사멸인 페로토시스는 지질 과산화, 철 이온 축적 및 글루타티온의 고갈로 정의되며 유전적, 형태학적, 생물학적 측면에서 다른 형태의 프로그램화된 세포 사멸과 구별됩니다³. 점점 더 많은 증거가 ICH의 병리학에서 신경 페사토시스의 역할을 강조합니다. 포스파티딜에탄올아민 결합 단백질 1(PEBP1)으로도 알려진 Raf 키나제 억제제 단백질(RKIP)은 신경 발달에 관여하며 페옵토시스의 핵심 조절자인 15-리폭시게나제(15LOX)와의 결합을 통해 15LOX/PEBP1 복합체를 형성합니다⁴. 그러나 자발적인 ICH의 진행과 관련된 페롭토시스에서 RKIP의 구체적인 역할과 메커니즘은 아직 탐구되지 않았습니다.

이 연구는 뉴런에 대한 RKIP 억제의 항페로토시스 효과를 조사하여 RKIP 발현 억제가 잠재적으로 핵 인자 E2 관련 인자 2/헴 옥시게나제-1(NRF2/HO-1) 경로의 활성화를 통해 ICH 후 신경 페로토시스를 억제할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 발견은 ICH의 병인을 표적으로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 중요합니다.

PC12 세포의 배양
PC12 세포주는 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI-1640) 성장 배지에서 표준 배양 조건(37°C, 5% CO₂ 가습 분위기)에서 일상적인 유지 관리와 함께 증식되었습니다. 실험 절차를 위해 부착 세포를 배양 용기에 도금하고 거의 합류하는 단층(약 90% 표면 피복)에 도달할 때까지 증식하도록 허용했습니다. 세포 해리는 0.25% 트립신-EDTA 용액을 사용한 효소 처리를 통해 달성되었으며, 이어서 집단 안정성을 보장하기 위해 3번의 연속 계대 배양 주기가 이어졌습니다. 처리된 세포는 이후 다운스트림 실험 적용 및 분석 평가에 할당되었습니다.

세포 생존율 분석
분석 키트 제조업체에서 제공한 지침에 따라 PC12 세포에서 헤민과 로코스타틴의 세포독성을 평가하기 위해 세포 생존력을 평가했습니다. PC12 세포를 96웰 플레이트에 균일하게 파종하고 헤민 또는 로코스타틴과 함께 24시간 동안 배양했습니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 후, 세포를 10% 테트라졸륨 염 용액을 함유한 RPMI-1640 배지에서 37°C에서 90분 동안 배양했습니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 광학 밀도(OD) 값을 측정했습니다.

정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)
RNA 추출 시약을 사용하여 PC12 세포에서 총 RNA를 추출했습니다. 먼저, 샘플을 추출 시약에서 균질화하여 철저한 용해를 보장했습니다. 클로로포름을 혼합물에 첨가하고 세게 흔든 후 원심분리하여 상을 분리했습니다(12,000 × g, 15분, 4°C). RNA를 함유하는 수성상을 채취하고, 이소프로판올(수성상:iPrOH=1:1)을 첨가하여 RNA를 침전시키고 실온에서 배양하였다. RNA를 펠릿화하기 위해 원심분리(12,000 × g, 10분, 4°C)하고, 불순물을 제거하기 위해 70% 에탄올 1mL를 첨가하고, 마지막으로 RNA 펠릿을 RNase가 없는 물에 용해시켜 -80°C에서 보관하였다. 상보적 DNA(cDNA) 주형은 RT 마스터 믹스를 사용한 역전사에 의해 생성되었습니다. 그런 다음 생성된 템플릿을 1:5 비율로 희석하고 실시간 PCR 기기에서 정량적 실시간 PCR을 실시했습니다. 각 샘플을 세 번으로 증폭하고 PCR 산물의 상대적 양을 평균화했습니다. 사용된 프라이머는 표 1에 나열되어 있으며 β-액틴이 하우스키핑 유전자 역할을 합니다. 상대 mRNA 농도는 공식 E = 2^−ΔΔCt를 사용하여 결정되었고, 각 반응에 대해 임계 임계 주기(CT) 값을 기록했습니다.

세포내 활성 산소종(ROS) 및 지질 하이드로퍼옥사이드(LPO) 분석
ROS 및 LPO 수준은 유세포 분석을 사용하여 측정되었습니다. PC12 세포를 헤민(80μM), 로코스타틴(5μM) 및 ML385(5μM)로 24시간 동안 처리하고 접시에서 PBS로 3회 세척했습니다. 그런 다음 세포를 ROS 프로브인 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 및 LPO 프로브인 BODIPY 581/591 C11의 존재 하에서 5% CO₂와 함께 40분 동안 37°C에서 배양했습니다. 과도한 프로브를 제거하기 위해 PBS 세척 후, 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정했습니다. 모든 샘플에 일관된 게이팅 전략이 적용되었습니다: 먼저 파편을 배제하기 위해 FSC-A 대 SSC-A에서 세포를 게이팅한 다음 FSC-A 대 FSC-H 게이팅으로 단일 세포를 선택했습니다. 염색되지 않은 세포와 헤민 단독으로 처리된 세포를 음성 및 양성 대조군으로 사용하여 형광 보상 및 게이트를 설정했습니다. 데이터는 연결된 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.

단백질 추출 및 웨스턴 블롯
총 단백질 추출
처리된 PC12 세포의 상청액을 버린 후 얼음처럼 차가운 PBS로 세 번 세척했습니다. 트립신을 사용하여 세포를 수확하고 200× g 에서 5분 동안 원심분리했습니다. 상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 10% 프로테아제 억제제 및 10% 포스파타제 억제제를 포함하는 저온 RIPA(Radio-Immunoprecipitation Assay) 용해 완충액에서 균질화했습니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후, 용해물을 12,000 × g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리했습니다. 투명 상청액을 로딩 완충액(4:1)과 혼합하고 95°C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시켰다. 단백질 샘플은 후속 사용을 위해 -80°C에서 보관되었습니다.

웨스턴 블롯 분석
단백질은 스태킹 겔과 분리 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 분리되었으며 샘플은 웰에 로드되었습니다. 전기 영동은 스태킹 겔의 경우 80V, 분해 겔의 경우 120V에서 수행되었습니다. 단백질을 폴리불화비닐리덴(PVDF) 멤브레인(1-2시간 동안 300mA의 정전류에서 전방 활성화)으로 전사했습니다. 막을 TBST에서 5% 탈지유로 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 2시간 동안 차단했습니다. TBST로 3회 세척(각각 10분)한 후, 멤브레인을 TBST에서 희석한 다음 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다: 토끼 항-ACSL4 (1:1,000), 토끼 항-GPX4 (1:1,000), 토끼 항-HO-1 (1:2,000), 토끼 항-NRF2 (1:1,000), 토끼 항-RKIP (1:1,500) 및 마우스 항-β-액틴(1:5,000). 멤브레인을 TBST로 3 x 10분 동안 세척하고 HRP 접합 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 배양했습니다: HRP 표지 염소 항-마우스 IgG (1:1,000), HRP 표지 염소 항-토끼 IgG (1:1,000). 3 x 5분 동안 추가 TBST 세척 후, ECL 웨스턴 블롯 키트를 사용하여 단백질 신호를 시각화하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다.

면역형광 염색
세포를 배양 플레이트에 미리 배치된 커버슬립에 시딩하고 부착하도록 했습니다. 실험적 처리 후 상청액을 폐기하고 세포를 PBS로 3회 세척했습니다. 세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후 PBS 세척을 3회 수행했습니다. 이어서, 세포를 실온에서 10분 동안 0.1% Triton X-100으로 투과화하고 PBS로 3회 세척하였다. 비특이적 결합은 실온에서 30분 동안 3% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 배양하여 차단되었습니다. 1차 항체는 4°C에서 밤새 적용되었습니다: 토끼 항-HO-1 (1:500), 토끼 항-NRF2 (1:500). 다음날 PBS 세척 3회 후, 세포를 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 형광 2차 항체와 함께 배양했습니다: Alexa Fluor 488 표지 염소 항토끼 IgG(1:500). 최종 세척 후, 시료는 핵 대대 염색을 위해 4',6-디아미디노-2'-페닐인돌(DAPI)을 함유한 마운팅 매체로 장착되었습니다. 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 캡처되었습니다.

통계 분석
측정 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현되었습니다. 분석을 위해 3개의 독립적인 반복 분석의 결과를 나타내는 정량적 데이터를 가져왔습니다. 두 그룹 간의 비교를 위해 t-테스트를 적용하였고, 여러 그룹 간의 비교를 위해 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하였고, 다중 비교를 위해 Tukey의 사후 검정을 사용했습니다. 0.05< p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

헤민은 원형질막 손상을 유도할 수 있으므로 ICH의 시험관 내 세포 모델 구축에 자주 사용됩니다. 이 연구는 다양한 농도와 기간의 헤민 처리가 PC12 세포 생존력에 미치는 영향을 조사하는 동시에 웨스턴 블롯 분석을 통해 해당 실험 조건에서 RKIP 단백질 발현 역학을 분석했습니다(그림 1A). 세포 생존력은 60μM 이상의 헤민 농도에서 유의하게 감소했으며(그림 1B), 이러한 감소는 농도가 증가함에 따라 용량 의존적 방식으로 발생했습니다. 또한, 헤민 세포독성은 시간에 따라 달라졌으며, 노출 후 처음 24시간 이내에 최고조에 달한 후 점차 감소했습니다(그림 1C). 웨스턴 블롯 분석은 RKIP 단백질 발현이 80μM 헤민(그림 1D,E)에서 유의하게 상승하고 자극 후 24시간에 정점에 도달한 것으로 나타났습니다(그림 1F,G). 이러한 결과를 바탕으로 우리는 관련된 기본 메커니즘 및 신호 전달 경로를 밝히기 위해 후속 실험을 위해 80μM 헤민과 24시간의 처리 기간을 선택했습니다.

ICH 후 신경 페옵토시스에서 RKIP의 역할을 조사하기 위해 로코스타틴을 사용하여 RKIP 발현을 억제했습니다(그림 2A). 로코스타틴은 RKIP에 결합하여 RKIP와 Raf-1 키나아제 및 GRK2 사이의 상호 작용을 방해하여 RKIP의 기능적 효과를 약화시켜 억제 목적을 달성합니다. 이 연구에서 우리는 관련 분자 메커니즘을 조사하기 위해 로코스타틴을 RKIP 억제제로 사용했습니다 5,6. 로코스타틴의 세포독성은 생존율 분석을 사용하여 0-40μM의 농도 범위에서 먼저 평가되었습니다. 결과는 ≤5μM에서 유의미한 세포독성이 없음을 보여 후속 실험을 위한 안전한 농도 범위를 설정했습니다(그림 2B). 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR 분석을 사용하여 RKIP 발현에 대한 5μM 로코스타틴의 억제 효과를 추가로 확인했습니다. 웨스턴 블롯은 RKIP 단백질 수준의 유의한 감소를 나타낸 반면(그림 2C,D), RT-qPCR은 RKIP mRNA 수준의 감소를 나타냈습니다(그림 2E). 이러한 결과는 RKIP 발현을 억제하는 5μM 로코스타틴의 효능을 보여줍니다.

본 연구에서는 페로토시스에서 RKIP의 조절 기능을 설명하기 위해 뇌내출혈(ICH)의 헤민 유도 PC12 세포 모델을 개발했습니다. 우리의 결과는 헤민 자극이 세포 생존력을 감소시키는 동안 RKIP 발현을 유의하게 증가시켰다는 것을 나타냅니다. 기존 연구를 바탕으로 우리는 헤민 유도 세포 사멸이 세포 구획 내 병리학적 철 침착과 활성 산소종(ROS) 수치 상승을 특징으로 하는 철 촉매 지질 과산화 과정인 페롭토시스와 밀접한 관련이 있을 수 있다고 추측했습니다.

RKIP와 페로토시스 사이의 관계를 더 자세히 조사하기 위해 헤민 자극 PC12 세포를 로코스타틴으로 치료했습니다. 웨스턴 블롯 분석은 페롭토시스의 주요 동인인 아실-CoA 합성 장쇄 계열 4(ACSL4)의 발현이 헤민 처리군에서 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3A,B). ACSL4는 페옵토시스에서 중요한 사멸 촉진 유전자로, 고도불포화지방산(PUFA)의 에스테르화를 촉진하여 페롭토시스에 대한 세포 민감도를 증가시킵니다. 또한, 페롭토시스 억제제인 글루타티온 퍼옥시다제 4(GPX4)의 발현은 헤민 처리군에서 유의하게 감소하였다(그림 3A,C). GPX4는 지질 과산화물을 제거하여 지질 과산화를 억제하여 산화 손상으로부터 세포를 보호하는 페롭토시스의 핵심 조절자입니다. 이러한 결과는 헤민 자극이 PC12 세포에서 페사토시스를 증가시킨다는 것을 나타냅니다. 그러나 헤민군과 비교하여 로코스타틴을 사용한 RKIP의 약리학적 억제는 이러한 변화를 역전시켰으며, 이는 RKIP 발현의 억제가 PC12 세포에서 페로토시스를 억제했음을 나타냅니다. mRNA 수준에서도 일관된 결과가 관찰되었습니다(그림 3 F,G).

우리는 또한 페롭토시스 관련 경로 분자의 발현을 조사했습니다. NRF2/HO-1 경로는 페옵토시스에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 이를 바탕으로 우리는 RKIP 억제가 NRF2/HO-1 경로를 활성화하여 신경 페사토시스를 억제할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 먼저 PC12 세포를 헤민으로 자극한 결과 NRF2 단백질의 발현이 현저하게 증가하고(그림 3A,D) 다운스트림 산물 HO-1의 유의한 증가를 발견했습니다(그림 3A,E). 이러한 발견은 헤민 유도 페사토시스가 세포에 보호 효과를 발휘하는 NRF2/HO-1 경로를 활성화한다는 것을 시사합니다. 세포 항산화 반응의 주요 조절자인 NRF2는 HO-1과 같은 다운스트림 표적 유전자의 발현을 조절하여 세포 항산화 능력을 향상시켜 페로토시스를 억제합니다. 그 후, 로코스타틴 치료는 헤민 치료군에 비해 HO-1 및 NRF2의 발현을 더욱 증가시켰다(그림 3A,D). mRNA 수준에서도 일관된 결과가 관찰되었으며(그림 3I,J), RKIP의 억제가 NRF2 및 그 다운스트림 분자 HO-1을 조절함으로써 헤민 자극 PC12 세포에서 페롭토시스를 억제한다는 것을 추가로 확인했습니다.

특히, 또 다른 페롭토시스 억제제인 페리틴 중쇄 1(FTH1)은 헤민 자극 시 발현 증가를 보였고, RKIP 가 억제되었을 때 발현이 더욱 증가하였다(그림 3H). FTH1 은 철 저장 및 산화를 담당하는 페리틴의 주요 성분입니다. 철 이온을 보다 안정적인 형태로 전환하여 유리 철로 인한 산화 스트레스를 줄입니다. 헤민 자극 시 FTH1 의 상향 조절은 세포가 산화 손상을 피하기 위해 과도한 철분을 저장하려고 시도하기 때문에 철분 과부하에 대한 보상 반응을 나타낼 수 있습니다. 로코스타틴 치료 시 FTH1 발현의 추가 증가는 유리 철 수치 감소와 항산화 능력 향상을 시사하며, RKIP 억제가 PC12 세포에서 헤민 유도 페사토시스를 억제한다는 결론을 강화합니다.

PC12 세포의 ROS 및 지질 하이드로퍼옥사이드(LPO) 수치는 유세포 분석을 통해 평가되었습니다. 헤민 치료는 ROS 및 LPO 수치를 크게 증가시켰고, 이는 로코스타틴 투여 후 역전되었습니다. 이 발견은 RKIP를 억제하는 것이 뉴런의 페사토시스를 억제하는 데 도움이 될 수 있음을 나타냅니다(그림 4A-D).

요약하면, RKIP 단백질 수준의 현저한 증가와 함께 PC12 세포 생존력의 헤민 유도 용량 및 시간 의존적 감소. 이 과정은 ACSL4 수치 상승 및 GPX4 발현 억제와 관련이 있었습니다. 동시에, 산화 손상 마커(ROS 및 LPO)의 상당한 축적이 관찰되었으며, 둘 다 산화 스트레스와 지질막 파괴를 매개하여 페옵토시스의 핵심 동인 역할을 합니다. 또한, 철 저장 단백질 FTH1 의 상향 조절은 철 과부하에 대한 보상 세포 반응을 시사했습니다. 결정적으로, 로코스타틴에 의한 RKIP 의 약리학적 억제는 이러한 변화를 역전시키고 헤민 유발 페사토시스를 없애었습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3 및 그림 4).

분석 결과는 RKIP 를 억제하면 신경 페사토시스를 효과적으로 억제하고 NRF2/HO-1 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. NRF2/HO-1 경로가 페로토시스에서 핵심적인 역할을 한다는 점을 감안할 때, RKIP 억제로 관찰된 신경 페로토시스의 억제가 이 경로의 자극을 통해 매개될 수 있다는 가설이 세워졌습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 추가 실험이 수행되었습니다(그림 5A).

선택적 NRF2 억제제인 ML385를 사용하였고, 그 결과 NRF2 발현이 단백질(그림 5B,C) 및 mRNA 수준(그림 5E) 모두에서 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 NRF2의 다운스트림 분자인 HO-1의 발현을 평가했습니다. 연구 결과에 따르면 RKIP 억제는 처음에는 HO-1 발현을 증가시켰지만 NRF2 억제 후 이 효과가 역전되었습니다(그림 5B,D,F). 이러한 결과는 RKIP 억제가 NRF2/HO-1 경로를 활성화하여 신경 페사토시스를 약화시킬 수 있음을 시사합니다. 면역형광 염색은 RKIP 억제 후 NRF2의 핵 전좌가 관찰되었기 때문에 이러한 결과를 더욱 뒷받침했습니다(그림 5G-J).

그 후, 우리는 유세포 분석을 사용하여 PC12 세포의 ROS 및 LPO 수준을 추가로 평가했습니다. 우리는 ML385로 NRF2를 억제하면 로코스타틴으로 인한 ROS 및 LPO 수치 감소를 역전시킨다는 것을 발견했습니다. 이러한 발견은 RKIP 억제가 NRF2/HO-1 경로를 활성화하여 신경 페사토시스를 억제할 수 있음을 시사합니다(그림 6A-D).

데이터 가용성:
현재 연구 중에 생성된 데이터 세트는 보충 파일 1에 포함되어 있습니다.

그림 1: 헤민 자극 PC12 세포에 의한 시험관 내 질병 모델 구축.(A) 헤민 자극 PC12 세포 모델의 구성에 대한 개략도. (B) 세포 생존력을 평가하기 위해 세포 생존율 분석을 사용하여 시험관 내 뇌내 출혈 모델 구축을 위한 최적의 헤민 농도 결정. (C) 다양한 시점에 대해 헤민(80μM)으로 처리된 PC12 세포를 사용한 세포 생존율 분석. (D,E) 상이한 헤민 농도로 처리된 PC12 세포에서 RKIP 발현 수준의 대표적인 웨스턴 블롯 분석 및 정량적 평가(24시간). (에프,지) 다양한 기간 동안 헤민(80μM)에 노출된 PC12 세포에서 RKIP 발현 수준의 대표적인 웨스턴 블롯 분석 및 정량적 평가. 모든 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: CCK8 = 세포 계수 키트-8; WB = 웨스턴 블롯; RKIP = Raf 키나아제 억제제 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 헤민으로 자극된 PC12 세포에서 RKIP 발현에 대한 로코스타틴의 효과.(A) PC12 세포에서 로코스타틴 치료를 위한 실험 절차의 개략도. (B) 상이한 농도의 로코스타틴으로 처리된 PC12 세포의 세포 생존율은 세포 생존율 분석을 사용하여 평가되었습니다. (C,D) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간)으로 처리된 PC12 세포에서 RKIP의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석했으며, 대표적인 블롯 및 통계 분석이 표시되었습니다. (E) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간)으로 처리된 PC12 세포에서 RKIP mRNA 발현을 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다. 모든 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: CCK8 = 세포 계수 키트-8; WB = 웨스턴 블롯; RT-qPCR = 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응; ROS = 활성 산소종; LPO = 지질 과산화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 헤민 자극 후 PC12 세포에서 페로토시스에 대한 RKIP 억제의 효과. (A-E) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간)으로 처리된 PC12 세포에서 ACSL4, GPX4, NRF2 및 HO-1의 단백질 발현 변화에 대한 웨스턴 블롯 분석. (FJ) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간)으로 처리된 PC12 세포에서 ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 및 FTH1의 mRNA 발현 수준의 RT-qPCR 분석. 모든 데이터는 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: WB = 웨스턴 블롯; RT-qPCR = 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응; RKIP = Raf 키나아제 억제제 단백질; ACSL4 = 아실-CoA 합성효소 장쇄 계열 4; GPX4 = 글루타티온 과산화효소 4; NRF2 = 핵 인자 E2 관련 인자 2; HO-1 = 헴 옥시게나제-1; FTH1 = 페리틴 중쇄 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 헤민 자극 후 PC12 세포의 산화 스트레스에 대한 RKIP 억제의 효과. (A,C) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간)으로 처리된 PC12 세포에서 활성산소종 생산의 유세포 분석. (나, 나) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간)으로 처리된 PC12 세포에서 지질 과산화의 유세포 분석. 모든 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: ROS = 활성 산소종; LPO = 지질 과산화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: RKIP 억제에 의해 매개되는 항철광학 효과에서 NRF2의 역할. (A) 다양한 조건에서 PC12 세포를 처리하기 위한 실험 절차의 개략도. (B-D) 헤민(80μM, 24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM,24시간) 및/또는 ML385(5μM, 24시간)를 사용한 PC12 세포에서 상이한 처리 조건에서 NRF2 및 HO-1의 단백질 발현 변화에 대한 웨스턴 블롯 분석. (E,F) 헤민(80μM, 24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM, 24시간) 및/또는 ML385(5μM, 24시간)로 처리된 PC12 세포에서 NRF2 및 HO-1의 mRNA 발현 수준의 RT-qPCR 분석. (G-J) 헤민(80μM, 24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM, 24시간) 및/또는 ML385(5μM, 24시간)로 처리된 PC12 세포에서 NRF2 및 HO-1 발현의 면역형광 분석 및 평균 형광 강도의 정량화. 스케일 바= 50μm. 모든 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: WB = 웨스턴 블롯; RT-qPCR = 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응; IF 염색 = 면역형광 염색; NRF2 = 핵 인자 E2 관련 인자 2; HO-1 = 헴 옥시게나제-1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: RKIP 억제 에 의해 매개되는 산화 스트레스 억제에서 NRF2의 역할.(A,C) 헤민(80μM, 24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM, 24시간) 및/또는 ML385(5μM, 24시간)를 사용한 PC12 세포에서 활성산소종 생산의 유세포 분석. (나, 나) 헤민(80μM,24시간) 및/또는 로코스타틴(5μM, 24시간) 및/또는 ML385(5μM, 24시간)로 처리된 PC12 세포에서 지질 과산화의 유세포 분석. 모든 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 약어: ROS = 활성 산소종; LPO = 지질 과산화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: NRF2/HO-1 경로를 활성화하여 자발적인 ICH 후 신경 페로토시스를 약화시키는 RKIP 억제의 개략도.우리의 연구 결과는 RKIP 억제가 NRF2 핵 전좌를 효과적으로 촉진하고 지질 ROS 축적을 억제하며 결과적으로 헤민 유발 페사토시스 및 산화 스트레스로부터 보호한다는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 정량적 역전사-PCR을 위한 프라이머.

보충 파일 1: CCK-8 분석, 웨스턴 블롯, RT-qPCR 및 유세포 분석을 포함하여 처음 6개의 수치를 뒷받침하는 원시 및 처리된 정량 데이터. 데이터는 그림 하위 패널별로 구성되며 통계 분석에 사용되는 모든 반복 값을 포함합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이 논문에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다.