다중 모드 광시야 푸리에 변환 라만 현미경

요약

컴팩트하고 초안정한 이중 굴절 간섭계를 기반으로 한 광시야 푸리에 변환 현미경은 2D 검출기의 모든 픽셀에 대해 스펙트럼을 병렬로 획득할 수 있게 합니다. 시간 영역 접근법은 광발광과 라만 신호의 분리를 가능하게 하며, ~1 μm 공간 해상도와 23 ^cm-1 스펙트럼 해상도로 빠른 라만 매핑(~5 ms/pixel)을 가능하게 합니다.

초록

라만 현미경은 시료의 화학 조성을 결정하는 강력한 기법입니다. 포인트 스캐닝 주파수 영역 검출을 기반으로 한 최첨단 자발 라만 현미경의 주요 과제는 일반적으로 긴 픽셀 체류 시간(0.1-1초)으로 인해 넓은 영역의 라만 맵을 획득하는 것입니다. 여기 제시된 광시장 푸리에 변환(FT) 현미경은 ~1-μm 공간 해상도와 ~23-cm-1 스펙트럼 해상도로 확장된 샘플을 빠르게 측정할 수 있게 합니다. 이 장치는 상용 현미경의 검출 경로를 따라 추가된 초안정하고 컴팩트한 공통 경로 이중 굴절 간섭계를 기반으로 하며, 2D 검출기의 모든 픽셀에 대해 스펙트럼을 병렬로 획득할 수 있어 측정 시간을 크게 단축(10-100배 빠름)합니다. 시간 영역 접근법은 주파수 영역 기법의 또 다른 한계인 라만 신호를 광발광 배경에서 분리하는 문제를 효과적으로 해결합니다. 라만 신호는 묻혀 있을 수 있습니다. 이 프로토콜은 업그레이드된 상업용 현미경으로 초분광 측정을 수행하는 방법을 설명합니다: 조명 체계의 정렬, 측정 매개변수 선택 기준, 그리고 스펙트럼을 검색하고 조사하는 데이터 분석.

서론

스펙트럼 영상은 스펙트럼과 공간 정보를 모두 제공하는 기법으로, 현미경¹ 부터 원격 탐사²에 이르기까지 다양한 분야에 적용되어 왔습니다. 다중분광 및 초분광 영상은 2D 센서의 각 픽셀에 대해 몇 개의 개별 스펙트럼 밴드가 기록되는지, 아니면 연속적인 스펙트럼이 기록되는지에 따라 구분됩니다. 라만 이미징은 스펙트럼 이미징의 특정 구현 방식입니다.

라만 산란 현미경은 시스템의 진동 주파수 ν_R을 측정하는 강력한 기법입니다. 진동 모드는 화학 결합과 연관되어 있어, 라만 분광법³은 생물학⁴와 재료과학⁵에서 시료의 화학적 조성을 조사할 수 있게 합니다. 자발적 라만 분광법에서는 샘플을 주파수 ν₀의 단색 복사(펌프)로 조명합니다. 펌프 빛의 일부가 진동 모드와 상호작용하여 비탄성 산란을 겪을 수 있으며, 이로 인해 시료 내 분자 진동 주파수인 ν _R의 주파수 ν_S (ν_AS)=ν₀-(+) ν_R에서 광자가 생성됩니다. 저에너지 산란광(ν_S)은 스톡스 복사라고 하며, 고에너지 광(ν_AS)은 반 스톡스 복사라고 합니다. 열 평형 상태에서는 대부분의 분자가 낮은 에너지 상태를 차지하기 때문에 반-스톡스 성분은 스톡스 성분보다 현저히 약합니다. 이 때문에 라만 산란 현미경은 일반적으로 스톡스 광자를 검출합니다. 분자와 고체는 여러 진동 모드를 가지므로, 라만 스펙트럼은 독특한 화학 신호를 형성하는 뚜렷한 밴드들로 특징지어져 재료 식별과 분석이 가능합니다. 이 접근법의 주요 과제는 자발적 라만 산란의 단면적이 매우 낮다는 점으로, ^9-12 광자 10개에서 10개 중 1개만이 이 과정을 겪는다.

라만 산란 현미경의 표준 구성에서는 여기 빛이 시료의 한 점에 강하게 집중됩니다. 탄성 산란된 펌프 광자(일반적으로 스펙트럼 필터를 사용)를 배제한 후, 남은 빛을 수집하여 주파수 영역 분광기(예: 분산 격자)로 특성화합니다; 이 장치들의 스펙트럼 해상도는 ~0.5-1 ^cm-1에 달할 수 있습니다. 측정은 시료의 시야각(FOV) 내 각 점 (x,y) 에 대해 포인트 스캐닝 또는 래스터 스캐닝⁶이라는 방법으로 반복됩니다. 이 접근법에는 두 가지 주요 문제가 있습니다: (1) 자발 라만 산란의 낮은 단면적은 일반적으로 분광기의 각 픽셀마다 충분한 광자를 수집하는 데 긴 적분 시간(0.1-1초)이 필요하며, 따라서 확장된 시료의 라만 맵은 긴 측정 시간이 필요할 수 있습니다; (2) 펌프 빛에 의한 여기는 또한 광발광(PL)을 발생시키는데, 이는 자발적인 라만 신호와 겹치며 종종 이를 압도할 수 있다.

획득 속도를 높이기 위해 라인 스캐닝⁷ 방식을 채택할 수 있는데, 이 방법은 펌프를 FOV의 선(예: 좌표 x)을 따라 집중하고, 수집된 신호(PL 또는 라만 산란)를 2D 센서가 장착한 분광기에 의해 분산되어, 주어진 좌표 x 에 대해 한 축은 스펙트럼을, 다른 축은 한 공간 좌표 y에 해당하는 2D 데이터셋을 생성하는 방식입니다. 그럼에도 불구하고, 이 구현은 분광기의 입구 슬릿이 초래하는 상당한 손실을 겪는데, 좁은 폭이 더 나은 스펙트럼 해상도를 제공하지만 수집되는 빛의 양을 제한합니다.

광시야 구성이 측정 시간을 단축하는 데 더 적합할 수 있습니다: 이 방법은 시료의 넓은 영역을 조명하고 2D 센서의 모든 픽셀에 대해 스펙트럼을 동시에 획득합니다. 이 경우 단색 영상 카메라 앞에 밴드패스 필터⁸ 또는 조정 가능한 스펙트럼 필터⁹ 를 사용하여 스펙트럼 정보를 수집할 수 있습니다. 또한 이 방법은 주파수 영역 접근법에 기반하며, 이산 수의 스펙트럼 밴드만 획득합니다.

스펙트럼을 측정하는 또 다른 방법은 푸리에 변환(FT) 접근법입니다. 이는 Wiener-Kintchin의 정리¹⁰에 기반한 시간 영역 기법으로, 신호의 전력 스펙트럼 밀도가 그 시간 자기상관관계의 푸리에 변환임을 명시합니다. 광학에서는 간섭계를 이용해 파형의 두 개의 지연된 복제체를 생성하여 이를 실현합니다. 이들의 간섭은 상대 지연에 따라 검출기에 의해 측정되며, 이로 인해 이른바 간섭도¹¹이 형성됩니다. FT 접근법은 적외선 스펙트럼 영역에서 스펙트럼을 측정하는 데 널리 사용되며, 이 분야에서는 푸리에 변환 적외선 분광 법(FTIR)¹²라고 불립니다. FTIR은 중적외선 스펙트럼 범위(~2.5−25 μm 파장)에서 진동 전이의 흡수 스펙트럼을 측정하는 데 일상적으로 사용됩니다.

시역 FT 접근법은 기존 분산 분광기에 비해 몇 가지 장점이 있습니다: 슬릿이 없어 더 높은 처리량을 달성합니다(Jacquinot의 에텐듀 이점¹²); 이는 스캔 범위에만 의존하는 유연한 스펙트럼 해상도를 제공합니다. 더불어 광시야 구성에도 적합하는데, 실제로 2D 검출기를 사용할 때 각 픽셀에 대해 병렬로 한 개의 간섭도를 측정하여 모든 픽셀에 걸쳐 연속 스펙트럼을 동시에 기록할 수 있습니다. 반면, FT 이미징 시스템은 두 가지 어려운 요구사항을 충족해야 합니다: (1) 두 빛 복제체 간의 상대적 지연을 광학 사이클의 아주 작은 부분으로 제어해야 함; (2) 단일 픽셀에서 간섭하는 광선 간의 위상 이동을 제한하여 좋은 코히어런스와 높은 대비를 보장해야 합니다. 일부 해결책은 공통 경로^13,14, 거의¹⁵ 간섭계를 기반으로 하지만, 다소 번거롭거나 스펙트럼 해상도가 100 ^cm-1보다 큽니다.

이 연구에서는 광발광과 라만 산란 이미지를 획득할 수 있는 새로운 광시야 현미경을 기술합니다. 이 시스템의 혁신적인 블록은 Translating-Wedge-based Identical Pulses eNcoding System(TWINS)¹⁶이라 불리는 컴팩트하고 초안정적인 공통 경로 이중 굴절 간섭계입니다. 수백 개의 광학 사이클에 대한 지연 스캔을 제공하며, 광학 사이클 자체의 작은 부분에 불과한 위상 정확도와 높은 안정성을 제공합니다. 두 빛 복제체는 직교 편광을 가지며 같은 공통 경로를 공선선으로 이동하므로, 이중 빔 간섭계에서 흔히 발생하는 경로 길이 변동의 영향을 받지 않습니다. 그림 1 삽입 부분에 나타난 이 도면은 직교 광학축을 가진 두 개의 쌍굴절 결정 블록으로 구성되어 있습니다: 하나는 고정 길이의 B₂이고, 다른 하나는 공통 빗변 방향을 따라 움직일 수 있는 쐐기로 나뉘어 있습니다. 입사광은 복굴절 결정의 광축에 대해 45° 방향으로 P₁에 의해 편광되어, 에너지의 절반은 일반 편광을, 절반은 비정상적인 편광을 따라 분열됩니다. 이중 굴절 블록을 따라 이동하는 동안, 두 직교 성분은 상대적 지연을 누적하며, 쐐기 삽입 위치를 바꿔 블록 B₁의 전체 두께를 조절하여 미세하게 조정합니다. 두 번째 편광기 P₂는 전장 성분들을 공통 선형 편광으로 투사하여 간섭하게 만듭니다. 복제체 간 지연 τ는 공통 빗변을 따라 쐐기 변위 x에 따라 달라지며, (방정식 1) , 빛의 속도 c, α쐐기의 꼭짓각, Δn= n_{e-n o} 일반 굴절률과 특이한 굴절률 차이(쌍굴절)에 따라 달라집니다. 스펙트럼 해상도 Δv는 스캔 범위 T=|T_{2-T 1}| 간섭도의 초기 및 최종 지연이 T ₁,_{T 2}로 처리되므로, 라만 분광법이 요구하는 높은 스펙트럼 해상도는 높은 이중 굴절과 긴 쐐기 이동을 요구합니다. 가장 흔한 이중굴절 결정 중 YVO₄(이트륨 정형변반산염)는 가시광선-근적외선에서 높은 Δn과 투명도 범위 덕분에 특히 적합하다. 쐐기는 10°의 정점각으로 설계되어 있어, 스캔 길이 15.3mm로 간섭계는 600 nm에서 2500 fs의 지연을 부여할 수 있으며, 관심 있는 전체 스펙트럼 범위에서 23 ^cm-1의 스펙트럼 해상도를 얻을 수 있습니다(실리콘 카메라 감도가 상한입니다). 이 연구는 간섭도 샘플링(즉, 스텝 및 스캔 범위)을 적절한 설정하여 원하는 스펙트럼 해상도를 달성하고 광대역 배경을 다루어 라만 신호를 광발광에서 분리하는 전략을 제시할 것입니다.

Candeo 등¹⁷에 의해 설명된 바와 같이, 이 복굴절 분광기는 상업용 광학 현미경과 결합하여 초분광 측정을 수행할 수 있습니다. 요구 사항은 다음과 같습니다: 재구성 가능한 광학 현미경 본체, TWINS 이중 굴절 간섭계, 저잡음 단색 카메라(예: CCD 또는 sCMOS), 그리고 협대역 레이저 광원. 후자의 경우, 라만 및 형광 분광의 일반적인 여기 파장은 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm, 785 nm입니다. 재료표 에 나열된 것과 같은 고순도 레이저가 최선의 선택임에도 불구하고, 기기의 제한된 스펙트럼 해상도를 고려할 때 ~0.1 nm 같은 더 넓은 선폭의 레이저도 사용할 수 있습니다. 현미경은 튜브 렌즈와 흑색 검출기 사이의 검출 경로에 TWINS를 배치하여 업그레이드됩니다. 이 구성은 시야각에 걸쳐 균일한 경로 지연과 평균 55%의 대비를 제공합니다. 여기 경로는 시료의 균일한 조명을 얻도록 설계되었으며, 실제로는 대형 코어 멀티모드 광섬유의 출력 팁이 시료 평면에 이미징됩니다. 기계식 스크램블러를 사용함으로써 모드들은 광섬유 코어에서 강하게 결합되어 샘플 평면에 평평한 상단 프로파일을 만듭니다. 또한, 진동하는 음성 코일은 단색 복사에서 흔히 볼 수 있는 스펙클 패턴을 평균화합니다. 이 탑햇 조명의 특성은 보충 그림 1에 나와 있습니다. 빔은 무한 보정된 대물렌즈에 의해 시료에 초점을 맞추며, 이 물체는 또한 검출 경로로 방향으로 후방 산란된 라만 및 발광 빛을 수집합니다. 조명을 차단하는 데 필요한 필터는 상세히 설명될 것입니다.

이 초분광 현미경으로 광대역 및 협대역 스펙트럼 특징을 측정하는 방법을 보여주기 위해, 특별히 선정된 시험 샘플에 대해 발광과 라만 산란을 모두 측정합니다. 시료는 잘 알려진 라만 스펙트럼을 가진 세 가지 분말 안료의 혼합물로 구성되어 있습니다: 티타늄 화이트(TiO₂)의 두 가지 다형성인 루틸과 아나타아제, 그리고 카드뮴 황화 옐로우(CdS)입니다. 하지만 동일한 절차는 재료 과학에서 생물학에 이르기까지 더 넓은 범위의 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

이 글의 범위는 초분광 측정을 수행하는 단계를 설명하는 것이며, TWINS 간섭계의 조립 및 정렬은 Candeo 등¹⁷에서 자세히 설명하고 있습니다. 따라서 관심 있는 실험자는 이 기술을 기반으로 미리 조립된 간섭계에서 시작해야 합니다.

프로토콜은 샘플 준비와 현미경을 설치하여 라만 산란과 PL 광자를 여기 및 수집하는 것부터 시작합니다. 그 후 스캔 매개변수(스캔 길이, 샘플링 단계)와 획득 매개변수(노출 시간, 하드웨어 비닝)를 조사 대상 신호의 요구사항에 따라 설정합니다. 마지막으로, 후처리 파이프라인이 소개되며, 획득한 시간 데이터셋(시간 하이퍼큐브, 그림 2A)에서 각 픽셀(스펙트럼 하이퍼큐브, 그림 2B)에서 스펙트럼을 추출하는 절차를 상세히 설명하고, 노이즈 감소 및 고급 스펙트럼 분석을 위한 알고리즘을 개괄합니다. 전체 워크플로우는 그림 3에 나와 있습니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 샘플 준비

주의: 이 준비 과정 중에는 특히 흡입 시 독성이 있는 CdS 안료가 독성이 있으므로 라텍스 장갑을 착용하세요.

1. 스크레이퍼를 사용해 각 안료 가루 각각 20mg씩 정밀 저울에 증착하여 1:1:1 무게 비율을 얻습니다.
   참고: 각 샘플마다 교차 오염을 방지하기 위해 스크레이퍼 팁을 신중히 청소하세요.
2. 가루를 모르타르와 섞어 뭉치를 제거하세요.
3. 생성된 혼합물을 현미경 슬라이드에 부어; 스크레이퍼 팁으로 부드럽게 눌러 거의 균일한 두께의 층을 얻으세요.
4. 현미경 커버 슬립 가장자리에 매니큐어를 바르세요. 네일 폴리시를 아래쪽으로 향하게 하여 혼합물 위에 올려놓고, 밀봉할 수 있도록 충분한 압력을 가하세요. 매니큐어를 굳히기 위해 몇 초간 말리세요.

2. 현미경 설치

주의: 레이저가 켜져 있을 때는 안전 안경을 착용하세요. 샘플 평면에서 최대 출력이 300 mW이기 때문입니다.

참고: 펌프 레이저의 성능은 데이터시트에 명시된 온도 범위(예: 재료표에 보고된 레이저의 10-40 °C) 내에서 작동하면 온도 변화에 영향을 받지 않습니다.

1. TWINS 간섭계를 현미경 검출 경로를 따라 정렬하세요.
   참고: Candeo 등에서 자세히 설명한 바와 ^같이, 간섭계 모듈은 튜브 렌즈와 검출기 사이에 추가되어야 하며, 적절한 거리를 확보해야 합니다. 이 작업에 사용된 현미경의 경우, 접안렌즈 모듈을 제거했을 때만 이 기능이 보장됩니다.
2. 쾰러 조명 방식을 레이저 여기에 맞게 적용하기 위해, 현미경에 내장된 여기 램프를 제거하고 현미경 대물렌즈를 사용해 대형 코어 멀티모드 광섬유의 출력에서 빛을 수집합니다.
   참고: 대물렌즈 배율은 섬유 끝이 샘플 평면과 결합될 때 조명 패턴의 크기를 설정합니다. 가능한 선택지는 10배/0.25-0.30 대지렌즈입니다.
3. 여기 파장을 선택하고 여기 레이저를 대형 코어 다중모드 광섬유의 입력에 집중시킵니다. 카메라를 켜고 시각화 소프트웨어를 실행하세요.
   1. 섬유의 중간 부분을 보이스 코일의 진동막에 부착하면 스펙클이 제거됩니다. 광섬유를 단단히 구부려 모든 공간 모드를 합치도록 기계적으로 교합합니다. 레이저 켜.
   2. 정렬을 위한 시험 샘플을 준비하세요. 예를 들어, 현미경 커버슬립에 형광 빨간색 마커 줄무늬를 표시하세요.
   3. 광섬유 팁의 위치를 정밀 변환 단계로 이동시켜 샘플 평면에서 균일한 강도와 명확한 가장자리를 가진 지점을 만듭니다.
      참고: 보고된 모든 측정에는 532nm 레이저가 사용됩니다. 400 μm 코어 크기의 광섬유를 사용하면 스팟의 직경이 카메라 FOV 폭의 82%를 차지합니다.
4. 여기 및 검출 경로에 대해 다음 기준을 채택한 필터 세트를 사용하세요(보조 그림 2):
   1. 레이저 라인을 정화하고 광섬유 내 전파로 인한 비선형 광범위로 인한 펌프 사이드밴드를 제거하기 위해 532nm(2.0nm 대역폭)의 좁은 대역폭 필터를 사용하세요.
   2. 이색성 거울( 그림 1의 DM)을 사용하여 레이저 빛을 시료 쪽으로 반사시키고, 대물렌즈가 수집한 적색편이 후방산란 복사를 투과합니다.
   3. 532nm 거리의 롱패스 필터( 그림 1의 LPF)를 사용하여 잔류 조명 빛을 차단합니다.
   4. 라만 산란 측정 중에는 600nm 단통과 필터( 그림 1의 SPF)를 사용하여 배경 형광을 억제합니다.
5. 파워미터로 샘플 평면의 전력을 측정하세요. 펌프 빔을 감쇠하여 시료에서 손상을 일으키지 않는 강도(표 1에 보고된 약 2 W/cm² 정도)를 얻습니다. 다른 측정 파라미터는 설정하면서 레이저는 셔터를 사용하세요.
   참고: 자발 라만 산란의 단면적이 작기 때문에 신호 수집을 향상시키기 위해 높은 출력 밀도가 필요합니다. 하지만 샘플 손상 임계값은 반드시 고려해야 합니다. 포인트 스캐닝 시스템과 달리, 광야(widefield) 장치는 넓은 영역을 밝히기 때문에 전력 소모 효율이 떨어지고, 샘플 손상을 방지하기 위해 신중한 전력 관리가 필요합니다.
6. 샘플을 현미경 스테이지에 올려놓고 초점을 조정하세요.
   참고: 초점을 쉽게 찾으려면, 먼저 투과형 또는 반사된 흰색 램프로 샘플을 밝히세요. 후자의 경우에는 현미경 옆에 전구를 놓을 수 있었다. 샘플 초점은 이후 펌프 레이저 광선으로 최적화됩니다.

3. 측정 매개변수

1. 쐐기 이동을 수행하는 모터의 드라이버를 켜세요. 하드웨어 부품(카메라와 모터)을 동시에 제어하여 하이퍼스펙트럼 측정을 수행합니다( 보조 그림 3에 보이는 사용자 인터페이스 예시).
2. 카메라 획득 매개변수, 노출 시간, 하드웨어 비닝을 설정하여 신호 강도를 최적화하고, 다음 지침을 채택하세요:
   1. 시간 신호의 높은 신호 대 잡음비(SNR)는 회수 스펙트럼의 높은 SNR을 초래하므로, 센서의 동적 범위를 더 잘 채우는 긴 노출 시간을 우선시합니다.
      참고: 라만 산란과 마찬가지로 신호 수준과 총 측정 시간 사이에서 타협점을 찾아야 합니다. 가장 긴 노출 시간은 실현 가능하지 않을 수 있습니다.
   2. 하드웨어 비닝을 선택해 더 많은 픽셀에서 전하를 수집해 출력을 읽으세요.
      참고: 전하를 합산하고 단일 판독을 하는 것이 여러 픽셀을 읽고 후처리에서 신호를 합산하는 것보다 노이즈 성능이 더 좋습니다. 빈 분류 선택은 공간 해상도의 허용 가능한 감소에도 영향을 받습니다.
3. 다음 기준에 따라 스캔 매개변수, 총 스캔 길이, 샘플링 단계를 선택하세요:
   1. 라만 피크에 대한 높은 스펙트럼 해상도를 달성하려면 비대칭 롱 쐐기 이동 평행 이동(-2526 fs→ -36 fs)을 설정하세요. 반면, 0지연 위치(-65 fs → 65 fs) 주변에서 대칭 스캔을 수행하여 PL 신호의 광대역 스펙트럼 특징을 더 많이 얻습니다.
   2. 지연 τ 를 쐐기 이동 x의 함수로 하는 식1을 사용하여, 관심 있는 스펙트럼 대역폭의 나이퀴스트 극한을 충족하는 샘플링 단계를 선택합니다.
      참고: 스펙트럼 λ_min의 최소 파장이 주어졌을 때, (식2)를 부과합니다.
      
      여기서 쌍굴절 Δn 은 파장에 따라 달라집니다(셀레마이어 방정식 참조).
4. 셔터를 열어 레이저를 샘플에 비추세요. 신호 세기가 감소하는 것이 관찰되면, 시료가 정지 상태(보통 몇 초)에 도달할 때까지 기다립니다.
   참고: 신호 강도 감소를 보상하기 위해 비닝과 노출 시간을 조정하여 좋은 SNR을 유지하세요.
5. 각 쐐기 위치, 즉 2D 센서의 각 지점에서 복제체 간 시간 지연에 대해 단색 이미지를 획득하기 시작합니다.
   참고: 획득 소프트웨어는 두 가지 변수를 저장해야 합니다: 시간적 하이퍼큐브(2D 이미지 세트)와 스캔 중 인코더가 기록한 모터 위치 벡터입니다.
6. 측정이 끝나면 레이저를 끄고 데이터 분석을 진행하세요.

4. 획득한 데이터큐브의 처리

1. 획득한 데이터셋에서 다음 지침을 따라 스펙트럼 하이퍼큐브를 생성합니다:
   1. 특정 스테퍼 모터에 맞는 모터 위치 보정 파일을 로드하세요(논의 참조).
   2. 특정 간섭계의 주파수 보정 파일을 불러와 측정된 공간 주파수(의사 주파수)를 실제 광학 주파수와 연관시키세요(토론 섹션 참조).
   3. 모든 픽셀의 간섭도에 푸리에 변환으로 계산할 스펙트럼의 주파수 범위를 선택하세요.
   4. 측정된 간섭도의 윈도잉을 위한 사용 가능한 아포다이제이션^{함수 12} 중에서, 회수 스펙트럼 확장과 회수 스펙트럼의 아티팩트 감소 사이에서 적절한 균형을 제공하는 함수(예: Happ-Genzel(Hamming) 윈도우를 선택하세요.
   5. 모든 픽셀에 대해 아포디션 간섭도를 푸리에 변환하여 스펙트럼 하이퍼큐브를 생성합니다. 복잡한 값으로 저장하세요.
      참고: FT의 복소 스펙트럼은 추가 정보를 담고 있어, 데이터셋의 노이즈를 제거하고 선택한 픽셀 집합의 평균 스펙트럼을 추출하는 데 유용합니다.
2. 스펙트럼 하이퍼큐브가 계산된 후에는 다양한 조사를 수행하세요. 예를 들어, 선택된 영역의 평균 스펙트럼을 얻고; 가짜 색상 RGB 이미지를 생성하고; 지도 스펙트럼 피크; 배경 빼기.
3. 특히 라만 스펙트럼에서 중요한 피크를 압도할 수 있는 스펙트럼 잡음을 줄이기 위해, 다음과 같은 단계를 따라 특이점 분해(SVD)¹⁸ 을 구현하세요:
   1. 시간적 하이퍼큐브를 행렬 A로 재구성하고, 그 행을 따라 간섭도(interferogram)를 배치합니다.
   2. 행렬의 SVD를 수행하여 A = USV^T가 되는 U, S, V 행렬을 얻습니다.
      참고: U 열은 V의 고유벡터(열)의 공간적 분포이며, S는 내림차순 특이점(SV)을 가진 대각선 행렬입니다.
   3. U의 각 열을 픽셀 행렬로 재구성하고 2D FT를 수행하여 공간 주파수를 얻습니다.
   4. 고주파는 맵에서 매우 급격한 변화와 연관되어 있으므로, 이를 노이즈로 간주합니다; 계산된 푸리에 공간 중심에 정사각형 영역을 정의하여 저주(주로 신호)와 고(주로 잡음) 주파수를 구분합니다.
      참고: 이 영역에 대한 가능한 선택지는 푸리에 공간 크기에 대해 변이 1/4인 경우입니다.
   5. 경계 내 픽셀 강도(복소수 모듈러스)의 합을 경계 밖 세기의 합으로 나누어 각 SV의 공간 신호 비율(SSR)을 계산합니다. SV 수에 따른 SSR의 함수로 그래프를 그립니다.
   6. SSR의 임계값을 정의하라. 즉, 데이터셋 내 잡음 기여를 줄이고 아티팩트를 피하기 위해 유지해야 할 중요한 SV 수를 말한다.
      참고: SSR은 일반적으로 감소하는 추세를 보이며, 특이값 수가 증가함에 따라 정체기에 도달합니다. 경험상 고원이 시작되는 지점까지는 특이점을 유지하는 것이 좋습니다.
   7. 대각선 행렬 S에서 모든 하위 SV를 0으로 설정하여 S를_탈잡음 처리하고, US_{잡음 제거된} 시간 하이퍼큐브를 V^T로 계산합니다.
      참고: SVD는 행렬 팩토리화로, 재구성된 스펙트럼 하이퍼큐브(간섭도가 아닌 스펙트럼을 포함하는 행)에도 적용할 수 있습니다.
4. 디노이즈드 시간 초큐브로 4.1-4.2 단계를 반복하여 스펙트럼을 얻습니다.
5. 참고문헌¹⁹ 의 링크에서 프로그램을 다운로드하여 다변량 곡선 해상도-교대 최소제곱법(MCR-ALS) 알고리즘으로 데이터셋을 심층 분석할 수 있습니다.
   참고: 소프트웨어 개발자는 알고리즘²⁰에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 혼합 분석 문제를 해결하는 반복 방법으로, 각 스펙트럼은 순수 스펙트럼 프로파일의 선형 결합으로 표현됩니다. 행렬 표현을 사용하면: B = C R^T+E, 여기서 B는 데이터셋, C는 각 스펙트럼의 농도, R의 열은 구성 성분의 기준 스펙트럼, E는 오차를 나타냅니다.
   1. 스펙트럼 하이퍼큐브를 N_{픽셀 x N 주파수 행렬, 총 픽셀} 수와 주파수 벡터 길이를 N픽셀로 재구성합니다.
   2. 샘플에 예상되는 종의 수를 선택하고 참조 스펙트럼을 로드합니다.
      참고: 참조 스펙트럼은 각 안료별로 별도로 측정할 수 있습니다. 그렇지 않으면 프로그램이 데이터셋의 SVD를 생성하고, 초기 추정에 선택된 구성 요소만큼 주성분을 사용합니다.
   3. 제약 조건 선택: 회수된 스펙트럼 프로필은 음수가 아니어야 하며 참조 스펙트럼과 가능한 한 유사해야 합니다.
   4. 각 종별로 농도 지도(C의 재구성된 기둥)와 스펙트럼(R의 기둥)을 그립니다.
   5. 이 지도들을 내보내 위조 색상 이미지를 생성하여 분석을 마무리합니다(그림 4A).
      참고: 여기 제시된 결과를 얻기 위해 사용된 프로그램은 공개되지 않으나, 저자로부터 요청 시 받을 수 있습니다.

결과

그림 4A는 분말 혼합물의 선택된 영역에 대한 라만 맵을 보여줍니다. 이는 4.5단계에서 설명한 MCR-ALS로 검색된 풍부도 지도의 가짜 색상 표현입니다. 이 방법은 시야 내에서 세 종을 명확히 구분할 수 있어 샘플 조성에 대한 정보를 제공합니다. 그림 4B는 지도의 선택된 영역에서 평균 스펙트럼을 보여주며, 선택한 스캔 길이에 의해 스펙트럼 해상도는 23 ^cm-1입니다. 선택한 필터 세트는 105-2130 ^cm-1 범위(보조 그림 2)를 측정할 수 있으나, 종 구별의 주요 피크가 나타나는 285-750 ^cm-1만 보고됩니다. 문헌^21,22의 참조 스펙트럼과 비교할 때,...

토론

자발적 라만 산란 및 발광 이미지 획득을 위해 광시야 FT 다중모달 현미경이 도입되었으며, 이는 재료 과학에도 적용 가능합니다. 생물학적 샘플에 대한 적용 가능성은 Candeo 등¹⁷이 염색된 인간 세포의 초분광 형광 이미지를 제시함으로써 입증되었습니다. 이 분야에서 라만 산란 측정의 주요 과제는 광범위하게 밝혀진 영역에서 비효율적인 열 방출로 인한 광손상을 방지하는 것입니다. 가능한 해결책으로는 더 긴 여기 파장(예: 785 nm)을 사용하여 전력 흡수를 줄이는 것이 있으며, 단점은 라만 산란 단면적을 낮추는 것입니다. 또는 열 방출을 더 효과적으로 하기 위해 물 담근 목적을 도입할 수도 있습니다.

다중 모달리티는 시간 영역 접근법에 내재되어 있습니다. 이 방법은 조사 대상 신호(광발광 또는 라만 산란)에 따라 샘플링 전략을 선택할 수 있게 합니다. 개념을 설명하기 위해 푸리...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아나타세	크로노스	1200	흰색 TiO2 색소의 다형성
카드뮴 황화 분말	크레머 피그멘테 GmbH & 중계.	21060	카드뮴 옐로우, 색 지수 어두운/PY35
카메라	안도르	루카 R	1004x1002 픽셀의 8&마이크로 전자 증배 CCD 카메라; m x 8µ m
정화 필터	셈록	LL01-532-12.5	& Oslash; 1/2" 2.0 nm - 532 nm FWHM 레이저 라인 필터
커버슬립	BRAND GmbH & 코	4700 55	붕규산 유리 22x22x0.15 mm 현미경 커버슬립
이색성 거울	셈록	디02-R532-25x36	532 nm 단선 레이저 이색성 빔스플리터 25.2x35.6 mm 단면 빔스플리터
광섬유	토를랩	M74L05	400µ m-코어 크기, NA 0.39 멀티모드 광섬유
레이저	허브너 포토닉스	코볼트 삼바 1000	CW 다이오드 펌핑 레이저, 532 nm, 최대 전력 1000 mW
롱패스 필터	셈록	LP03-532RU-25	532 nm 초가파른 롱패스 엣지 필터
현미경	라이카	DMRBE  그리고 nbsp;	삼단 연구 현미경
목표	라이카	PL-플루오타르, 10배/0.30	여기 및 수집 대의렌즈, 10배 배율, 0.3 NA
목표	뉴포트	M-10X	조명 경로 내 대물렌즈, 10배 배율, 0.25 NA
루틸	크로노스	2900	흰색 TiO2 색소의 다형성
단패스 필터	토를랩	FESH600	& Oslash; 컷오프 파장 600의 25.0 mm 단통 필터
슬라이드	마리엔펠트	1000612	76x26x1 mm 현미경 슬라이드